Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Тканевая обработка и выделение первичных фибробластов из влагалища человека

1.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/65864

⸱

22 ноября 2024 г.

 ,  , 
1Department of Obstetrics, Gynecology and Reproductive Biology, Division of Urogynecology, Massachusetts General Hospital, 2Massachusetts General Hospital/Vincent Center for Reproductive Biology/Harvard Medical School, 3Department of Obstetrics, Gynecology and Reproductive Biology, Massachusetts General Hospital, Vincent Center for Reproductive Biology

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол демонстрирует надежную и эффективную технику выделения первичных фибробластов из тканей влагалища человека в пременопаузе или постменопаузе. Существующие протоколы выделения вагинальных фибробластов не учитывают проблемы выделения клеток из стареющих тканей. Ткань влагалища была получена от женщин после операции по удалению пролапса тазовых органов.

Аннотация

Пролапс тазовых органов – это заболевание, которое серьезно влияет на качество жизни женщин. Он возникает, когда мышцы и связки ослабевают и заставляют органы малого таза опускаться ниже в области таза, создавая выпуклость во влагалище. Хирургическое вмешательство по коррекции пролапса тазовых органов является основным методом лечения. В последнее время растет интерес к изучению состава тканей пациентов с пролапсом на клеточном уровне.

В настоящее время нет единого мнения относительно влияния возраста донора или пациента на клеточную терапию. В настоящее время опубликованные протоколы выделения вагинальных фибробластов либо концентрируются на ткани пременопаузы, либо пренебрегают комментариями о возрасте донорской ткани. В большинстве существующих протоколов используются животные модели. Консистенция тканей влагалища человека более плотная, чем ткани, используемые в большинстве протоколов. В этом исследовании ткань человеческого влагалища была получена в основном от пожилых доноров, что, вероятно, способствовало провалу существующих протоколов.

Целью данного исследования является описание стандартного протокола надежного получения вагинальных фибробластов человека, независимо от возраста донора и менопаузального статуса. Результаты были воспроизведены с использованием тканей девяти отдельных доноров, перенесших операцию по удалению пролапса тазовых органов. Шесть пациенток находились в постменопаузе, самому старшему донору было 78 лет. Средний возраст доноров тканей составил 59 лет.

В данной статье мы описываем надежный метод получения обогащенной фибробластами одноклеточной суспензии с использованием комбинации ферментативной и механической диссоциации и объединения клеточных суспензий нескольких вагинальных биопсий от одного донора. Надежная изоляция первичных фибробластов влагалища человека может быть полезна при изучении пролапса тазовых органов, а также взаимодействий микробиома и хозяина.

Введение

Гендерное неравенство в науке и исследованиях является постоянной проблемой. Исследования расстройств, которые в первую очередь поражают людей женского пола, недостаточно финансируются1. Пролапс тазовых органов – это заболевание, тесно связанное с женским полом. Он возникает, когда мышцы и связки ослабевают и заставляют органы малого таза опускаться ниже в области таза, создавая выпуклость во влагалище2. Мало что известно о клеточных взаимодействиях в контексте этой патофизиологии, а также о том, как факторы на уровне тканей влияют на успех хирургическихвмешательств.

Первичные клетки, а не клеточные линии, широко признаны важными для трансляционных клинических исследований, обеспечивая большую физиологическую значимость4. Первичные клетки берутся непосредственно из интересующей ткани тела и могут более точно имитировать физиологию in vivo . Выделение первичных фибробластов из влагалища человека может быть полезным для изучения биологических механизмов опущения тазовых органов и моделирования заболевания с учетом ключевых характеристик донора, таких как возраст и менопаузальный статус.

Пролапс тазовых органов обычно поражает пожилых людей или лиц в постменопаузе. Выделение и пролиферация первичных клеток фибробластов при изучении этого состояния затруднены из-за снижения популяций клеток и клоногенной способности от более старых доноров5. По нашему опыту, использование ранее описанных протоколов диссоциации тканей влагалища не привело к извлечению фибробластов из стандартной биопсии ткани размером 1см2 .

Благодаря обзору литературы мы обнаружили, что подобные исследования были разделены на две группы: животные модели, такие как мышиные6, и человеческие модели 7,8. При следовании мышиному протоколу использование ножниц для тканевой обработки тканей влагалища человека приводило к недостаточному механическому пищеварению. Экстраполяция протоколов с использованием мышиной ткани и других тканевых участков9 не увенчалась успехом.

В большинстве работ с использованием образцов влагалища человека использовалась ткань женщин в пременопаузе с пролапсом тазовых органов 7,10. Несмотря нато, что в нескольких работах сообщалось об использовании образцов как в пременопаузе, так и в постменопаузе, они не описывали достаточно подробно протокол, используемый для успешной изоляции фибробластов от более старых доноров или доноров в постменопаузе. Выделение и моделирование заболевания с использованием фибробластов из тканей постменопаузы может иметь важное значение для понимания клеточной патофизиологии пролапса тазовых органов, поскольку это состояние имеет наибольшую распространенность у людей в течение десятилетия после менопаузы.

Описан способ выделения и культивирования обогащенной фибробластами одноклеточной суспензии из ткани влагалища человека с использованием комбинации механической и ферментативной диссоциации. В этой статье описан надежный протокол о том, как приобрести вагинальные фибробласты человека в постменопаузе или стареющем состоянии. Выделенные клетки были подтверждены как фибробласты с помощью морфологического исследования с использованием фазово-контрастной микроскопии и иммунофлуоресценции (ИФ) для оценки экспрессии виментина, F-актина и α-гладкомышечного актина (α-СМА).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Ткань влагалища была получена от женщин, перенесших операцию по удалению пролапса тазовых органов. Вагинальная ткань, собранная после операции, считалась отходами и в противном случае была бы выброшена. Исследование было выполнено в соответствии с Институциональными руководящими принципами и было одобрено Институциональным наблюдательным советом штата Массачусетс имени генерала Бригама.

1. Забор тканей влагалища у пациентки

  1. Диагностируйте пролапс тазовых органов путем сбора анамнеза и использования данных гинекологического осмотра: в клинике были получены измерения количественного определения пролапса тазовых органов (POP-Q), которые показали признаки пролапса тазовых органов.
  2. Используйте следующие критерии включения: старше 18 лет; симптоматический пролапс тазовых органов в анамнезе; отбор на хирургическую коррекцию опущения тазовых органов.
  3. Исключите следующее: Беременные женщины и пациенты, отказывающиеся от донорства тканей.
  4. Обрезка избыточной ткани влагалища в качестве необходимого этапа операции по удалению пролапса тазовых органов. Этот эпителий влагалища иссекается по общей толщине после следующих операций: передняя кольпорафия, задняя кольпорафия и кольпоклез.
  5. Транспортировка ткани в лабораторию в стерильном стаканчике для сбора образцов с обычным физиологическим раствором или не содержащим сыворотки средой DMEM/F12 (Gibco). Держите на льду.

2. Обработка и переваривание тканей

  1. Подготовка тканей
    1. Измерьте и разрежьте ткань так, чтобы она охватывала всю толщину эпителия влагалища, создавая сегменты размером примерно 1см2.
    2. Обеспечьте точное измерение размера биопсии 1 см2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Завышение размера биопсии ткани может ухудшить переваривание тканей.
    3. Подготовьте 2-3 дополнительные биопсии влагалища размером 1 см2 каждая от одного донора и отложите биопсию в сторону.
  2. Механическое сбраживание
    1. Поместите биопсию влагалища в чашку Петри для клеточной культуры толщиной 10 см. Пипетку 500-1 000 мкл бессывороточной среды с добавлением 100 ЕД/мл пенициллина/стрептомицина, 2,5 мкг/мл амфотерицина Бонто во влагалищную ткань для предотвращения высыхания ткани.
    2. Измельчите ткани влагалища на мелкие фрагменты с помощью двух стерильных скальпелей (No11 или No15) в обеих руках.
    3. Убедитесь, что кончики лезвий расположены перпендикулярно поверхности ткани. Равномерное и равномерное давление надавите на поверхность ткани с помощью двух скальпелей. Выполняйте попеременное тянущее действие, чтобы разрезать ткань на очень мелкие кусочки.
    4. Повторяйте эту технику измельчения, используя технику двух скальпелей до тех пор, пока образец не станет однородным по консистенции с кусочками 1-2 мм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Механическое разложение с использованием этой двухскальпельной техники биопсии размером 1 см2 должно занять примерно 15-20 минут.
    5. Добавьте в тарелку 2-3 мл бессывороточной среды DMEM/F12 с добавлением 100 ЕД/мл пенициллина/стрептомицина, 2,5 мкг/мл амфотерицина В, суспендируя измельченную ткань. Пипеткой впрыскивайте раствор, содержащий фрагменты ткани, вверх и вниз, чтобы разбить любые комки.
  3. Ферментативное сбраживание
    1. Перелейте раствор, содержащий фрагменты ткани, в коническую пробирку объемом 15 мл. Добавьте бессывороточную среду DMEM/F12 в чашку для культивирования тканей, где была измельчена вагинальная ткань, чтобы собрать любые оставшиеся фрагменты ткани. Переложите раствор, содержащий фрагменты ткани, в коническую трубку. Добавляйте дополнительные бессывороточные среды DMEM/F12 до тех пор, пока общий объем не достигнет 10 мл.
    2. Растворите 5 мг либеразы в 1 мл стерильной воды (5 мг/мл). Хранить в аликвотах объемом 230 мкл при температуре −20 °C до месяца или при температуре −80 °C в течение 6 месяцев.
    3. Добавьте в пробирку 230 μЛ Либеразы (запас 13 Ед/мл) с конечной концентрацией 0,3 Ед/мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Активность Liberase может варьироваться в зависимости от партии. Разморозьте каждую аликвоту непосредственно перед применением с помощью водяной бани. Избегайте многократного замораживания и размораживания.
    4. Повторите шаги 2.1-2.3 для 2-3 дополнительных биопсий влагалища того же донора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Храните каждый раствор, содержащий фрагменты ткани из одной биопсии, в отдельных конических пробирках. Например, 4 биопсии влагалища в 4 пробирках. Это важно для оптимального гранулирования клеток после центрифугирования.
    5. Инкубируйте пробирки в течение 3 ч при 37 °C при постоянном энергичном перемешивании с помощью смесителя для проб.
    6. Поместите смеситель для образцов в инкубатор сCO2 . Поддерживайте постоянное возбуждение. (Настройки смесителя образцов: 25 об/мин вращательного движения в течение 5 с, 30° обратного (наклонного вращения) в течение 5 с и 2° вибрационного (вихревого) движения в течение 3 с).
    7. Во время инкубации делайте трубки вихревыми с интервалом в 30 минут.
    8. Центрифугируйте образцы при давлении 3 000 x g в течение 5 минут. Удалите и выбросьте надосадочную жидкость.
    9. Ресуспендируйте гранулу в 1-2 мл DMEM/F12 среды с 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) и 100 ЕД/мл пенициллина/стрептомицина, 2,5 мкг/мл амфотерицина B для разбавления фермента либеразы. Энергично пипетируйте до тех пор, пока гранула не будет полностью суспендирована.

3. Культура клеток

  1. Удаление непереваренных фрагментов тканей
    1. Поместите клеточное фильтр 100 мкм над стерильным коническим контейнером объемом 50 мл.
    2. Объедините клеточную суспензию из нескольких биопсий тканей одного и того же донора.
    3. Процедите суспензию ткани/фермента, продавливая через нее поршенем шприца объемом 5 мл. Повторяйте этот шаг до тех пор, пока оставшиеся фрагменты ткани не будут полностью продавлены.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Может быть некоторое количество слизи из фрагментов ткани влагалища, которая не полностью прорабатывается через ситечко. Слейте слизь с помощью клеточного ситечка.
  2. Объединение клеточных культур
    1. Планшет с объединенной клеточной суспензией из нескольких биопсий влагалища (от одного и того же донора) на чашке Петри (60 мм x 15 мм).
    2. Инкубируйте чашку Петри в инкубаторе сCO2 при температуре 37 °C в течение ночи.
    3. Наблюдайте и подтверждайте наличие неадгезивных клеток с помощью фазово-контрастного микроскопа.
    4. Убедитесь, что фокус микроскопа находится в нижней части пластины.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На переднем плане может быть много иммунных клеток. Меньшее количество фибробластов будет прикреплено к нижней части пластины.
    5. Подождите 18-24 часа перед сменой среды для клеточных культур, чтобы обеспечить адекватную адгезию клеток.
    6. Меняйте питательную среду каждые три дня до тех пор, пока не произойдет 80% слияние. Когда клетки достигнут 80-90% слияния, разложите до колбы большего размера или заморозьте аликвоты клеток для дальнейшего использования.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Ткань влагалища была собрана у 10 независимых доноров, перенесших операцию по удалению пролапса тазовых органов. С помощью описанного протокола клетки были выделены из тканей влагалища человека. Клеточные популяции имели характерный удлиненный, плоский и веретенообразный вид. Как и в других исследованиях, мы наблюдали значительно более медленное удвоение клеточной способности и снижение клоногенной способности фибробластов с увеличением возраста донора. Эти различия были отмечены при сравнении фибробластов, выделенных от...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Во многих предыдущих исследованиях сообщалось о том, как выделить первичные фибробласты из влагалища человека 3,7. В нескольких исследованиях использовали ткани человеческого влагалища у женщин в пременопаузе с пролапсом тазовых органов. Хотя в нескольких работах сообщалось об использовании тканей от лиц в пременопаузе и постменопаузе 7,11, они не описывали достаточно под...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У нас нет никаких конфликтов интересов, которые мы могли бы раскрыть.

Благодарности

Мы хотели бы выразить нашу благодарность всем членам Центра репродуктивной биологии Винсента при Массачусетской больнице общего профиля, а также Фонду Мемориальной больницы Винсента за их щедрую поддержку. Особая благодарность доктору Бо Руэде и его лаборатории за их ценные предложения и предоставленное нам лабораторное оборудование.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Амфотерицин BBio TechneB23192
Клеточный фильтр (100 μ m)ThermoFisher Scientific22363549
конические центрифужные пробирки (15 мл)Fisher Scientific 14-959-53A
DMEM/F12ThermoFisher Scientific11320033
Перо одноразовый скальпель No15SocorexFB.15
Фетальная бычья сывороткаSigma AldrichNC1983075
конические центрифужные пробирки высокой прозрачности (50 мл)Fisher Scientific 14-432-22
Смеситель образцов HulaMixerThermoFisher Scientific15920D
Фибронектин человека DuoSet ELISAR& D SystemsDY1918-05
Human Pro-Collagen I alpha 1 DuoSet ELISAR& D SystemsDY6220-05
Liberase Research GradeSigma Aldrich05 401 119 001
Пенициллин/стрептомицин (5000 ед/мл)ThermoFisher Scientific15070063
чашки Петри, полистирол (100 мм x 20 мм)Millipore SigmaP5606
(10 мл)ThermoFischer Scientific170356N
Стерильные шприцы (5 мл)Fischer Scientific14-955-458
Серологические пипетки

Ссылки

  1. Mirin, A. A. Gender disparity in the funding of diseases by the U.S. J Womens Health. 30 (7), 956-963 (2021).
  2. MacLennan, A. H., Taylor, A. W., Wilson, D. H., Wilson, D. The prevalence of pelvic floor disorders and their relationship to gender, age, parity, and mode of delivery. BJOG. 107 (12), 1460-1470 (2000).
  3. Ruiz-Zapata, A. M., Kerkhof, M. H., Zandieh-Doulabi, B., Brölmann, H. A. M., Smit, T. H., Helder, M. N. Fibroblasts from women with pelvic organ prolapse show differential mechanoresponses depending on surface substrates. Int Urogynecol J Pelvic Floor Dysfunct. 24 (9), 1567-1575 (2013).
  4. Kaur, G., Dufour, J. M. Cell lines. Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).
  5. Rorteau, J., et al. Maintenance of chronological aging features in culture of normal human dermal fibroblasts from old donors. Cells. 11 (5), 858(2022).
  6. Blum, M., Koehler, J., Yangdon, T., Chatterjea, D. Generating primary murine vaginal fibroblast cell lines. MethodsX. 7, 101100(2020).
  7. Kufaishi, H., Alarab, M., Drutz, H., Lye, S., Shynlova, O. comparative characterization of vaginal cells derived from premenopausal women with and without severe pelvic organ prolapse. Reprod Sci. 23 (7), 931-943 (2016).
  8. Ruiz-Zapata, A. M., et al. Vaginal fibroblastic cells from women with pelvic organ prolapse produce matrices with increased stiffness and collagen content. Sci Rep. 6 (1), 22971(2016).
  9. Khan, M., Gasser, S. Generating primary fibroblast cultures from mouse ear and tail tissues. J Vis Exp. (107), e53565(2016).
  10. Kufaishi, H., Alarab, M., Drutz, H., Lye, S., Shynlova, O. Static mechanical loading influences the expression of extracellular matrix and cell adhesion proteins in vaginal cells derived from premenopausal women with severe pelvic organ prolapse. Reprod Sci. 23 (8), 978-992 (2016).
  11. Medel, S., Alarab, M., Kufaishi, H., Drutz, H., Shynlova, O. Attachment of primary vaginal fibroblasts to absorbable and nonabsorbable implant materials coated with platelet-rich plasma. Female Pelvic Med Reconstr Surg. 21 (4), 190-197 (2015).
  12. Awwad, J., Sayegh, R., Yeretzian, J., Deeb, M. E. Prevalence, risk factors, and predictors of pelvic organ prolapse. Menopause. 19 (11), 1235-1241 (2012).
  13. Waise, S., et al. An optimized method to isolate human fibroblasts from tissue for ex vivo analysis. Bio Protoc. 9 (23), e3440(2019).
  14. Nadalutti, C. A., Wilson, S. H. Using human primary foreskin fibroblasts to study cellular damage and mitochondrial dysfunction. Curr Protoc Toxicol. 86 (1), (2020).
  15. Da Silva Lara, L. A., et al. Menopause Leading to Increased Vaginal Wall Thickness in Women with Genital Prolapse: Impact on Sexual Response. J Sex Med. 6 (11), 3097-3110 (2009).
  16. Stasio, D. D., Lauritano, D., Iquebal, H., Romano, A., Gentile, E., Lucchese, A. Measurement of oral epithelial thickness by optical coherence tomography. Diagnostics. 9 (3), 90(2019).
  17. Zorina, A., Zorin, V., Kudlay, D., Kopnin, P. Age-related changes in the fibroblastic differon of the dermis: role in skin aging. Int J Mol Sci. 23 (11), 6135(2022).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Выделение вагинальных фибробластовопущение тазовых органовткань влагалища человекамеханическая диссоциацияферментативное расщеплениеобъединение клеточных суспензийткань женщин в постменопаузефазово-контрастная микроскопияиммунофлуоресцентный анализ
Тканевая обработка и выделение первичных фибробластов из влагалища человека
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.