Тканевая обработка и выделение первичных фибробластов из влагалища человека

Summary

Этот протокол демонстрирует надежную и эффективную технику выделения первичных фибробластов из тканей влагалища человека в пременопаузе или постменопаузе. Существующие протоколы выделения вагинальных фибробластов не учитывают проблемы выделения клеток из стареющих тканей. Ткань влагалища была получена от женщин после операции по удалению пролапса тазовых органов.

Abstract

Пролапс тазовых органов – это заболевание, которое серьезно влияет на качество жизни женщин. Он возникает, когда мышцы и связки ослабевают и заставляют органы малого таза опускаться ниже в области таза, создавая выпуклость во влагалище. Хирургическое вмешательство по коррекции пролапса тазовых органов является основным методом лечения. В последнее время растет интерес к изучению состава тканей пациентов с пролапсом на клеточном уровне.

В настоящее время нет единого мнения относительно влияния возраста донора или пациента на клеточную терапию. В настоящее время опубликованные протоколы выделения вагинальных фибробластов либо концентрируются на ткани пременопаузы, либо пренебрегают комментариями о возрасте донорской ткани. В большинстве существующих протоколов используются животные модели. Консистенция тканей влагалища человека более плотная, чем ткани, используемые в большинстве протоколов. В этом исследовании ткань человеческого влагалища была получена в основном от пожилых доноров, что, вероятно, способствовало провалу существующих протоколов.

Целью данного исследования является описание стандартного протокола надежного получения вагинальных фибробластов человека, независимо от возраста донора и менопаузального статуса. Результаты были воспроизведены с использованием тканей девяти отдельных доноров, перенесших операцию по удалению пролапса тазовых органов. Шесть пациенток находились в постменопаузе, самому старшему донору было 78 лет. Средний возраст доноров тканей составил 59 лет.

В данной статье мы описываем надежный метод получения обогащенной фибробластами одноклеточной суспензии с использованием комбинации ферментативной и механической диссоциации и объединения клеточных суспензий нескольких вагинальных биопсий от одного донора. Надежная изоляция первичных фибробластов влагалища человека может быть полезна при изучении пролапса тазовых органов, а также взаимодействий микробиома и хозяина.

Introduction

Гендерное неравенство в науке и исследованиях является постоянной проблемой. Исследования расстройств, которые в первую очередь поражают людей женского пола, недостаточно финансируются¹. Пролапс тазовых органов – это заболевание, тесно связанное с женским полом. Он возникает, когда мышцы и связки ослабевают и заставляют органы малого таза опускаться ниже в области таза, создавая выпуклость во влагалище². Мало что известно о клеточных взаимодействиях в контексте этой патофизиологии, а также о том, как факторы на уровне тканей влияют на успех хирургических^{вмешательств.}

Первичные клетки, а не клеточные линии, широко признаны важными для трансляционных клинических исследований, обеспечивая большую физиологическую значимость⁴. Первичные клетки берутся непосредственно из интересующей ткани тела и могут более точно имитировать физиологию in vivo . Выделение первичных фибробластов из влагалища человека может быть полезным для изучения биологических механизмов опущения тазовых органов и моделирования заболевания с учетом ключевых характеристик донора, таких как возраст и менопаузальный статус.

Пролапс тазовых органов обычно поражает пожилых людей или лиц в постменопаузе. Выделение и пролиферация первичных клеток фибробластов при изучении этого состояния затруднены из-за снижения популяций клеток и клоногенной способности от более старых доноров⁵. По нашему опыту, использование ранее описанных протоколов диссоциации тканей влагалища не привело к извлечению фибробластов из стандартной биопсии ткани размером 1^см2 .

Благодаря обзору литературы мы обнаружили, что подобные исследования были разделены на две группы: животные модели, такие как мышиные⁶, и человеческие модели ^7,8. При следовании мышиному протоколу использование ножниц для тканевой обработки тканей влагалища человека приводило к недостаточному механическому пищеварению. Экстраполяция протоколов с использованием мышиной ткани и других тканевых участков⁹ не увенчалась успехом.

В большинстве работ с использованием образцов влагалища человека использовалась ткань женщин в пременопаузе с пролапсом тазовых органов ^7,10. Несмотря на^{то, что} в нескольких работах сообщалось об использовании образцов как в пременопаузе, так и в постменопаузе, они не описывали достаточно подробно протокол, используемый для успешной изоляции фибробластов от более старых доноров или доноров в постменопаузе. Выделение и моделирование заболевания с использованием фибробластов из тканей постменопаузы может иметь важное значение для понимания клеточной патофизиологии пролапса тазовых органов, поскольку это состояние имеет наибольшую распространенность у людей в течение десятилетия после менопаузы^.

Описан способ выделения и культивирования обогащенной фибробластами одноклеточной суспензии из ткани влагалища человека с использованием комбинации механической и ферментативной диссоциации. В этой статье описан надежный протокол о том, как приобрести вагинальные фибробласты человека в постменопаузе или стареющем состоянии. Выделенные клетки были подтверждены как фибробласты с помощью морфологического исследования с использованием фазово-контрастной микроскопии и иммунофлуоресценции (ИФ) для оценки экспрессии виментина, F-актина и α-гладкомышечного актина (α-СМА).

Protocol

Ткань влагалища была получена от женщин, перенесших операцию по удалению пролапса тазовых органов. Вагинальная ткань, собранная после операции, считалась отходами и в противном случае была бы выброшена. Исследование было выполнено в соответствии с Институциональными руководящими принципами и было одобрено Институциональным наблюдательным советом штата Массачусетс имени генерала Бригама.

1. Забор тканей влагалища у пациентки

1. Диагностируйте пролапс тазовых органов путем сбора анамнеза и использования данных гинекологического осмотра: в клинике были получены измерения количественного определения пролапса тазовых органов (POP-Q), которые показали признаки пролапса тазовых органов.
2. Используйте следующие критерии включения: старше 18 лет; симптоматический пролапс тазовых органов в анамнезе; отбор на хирургическую коррекцию опущения тазовых органов.
3. Исключите следующее: Беременные женщины и пациенты, отказывающиеся от донорства тканей.
4. Обрезка избыточной ткани влагалища в качестве необходимого этапа операции по удалению пролапса тазовых органов. Этот эпителий влагалища иссекается по общей толщине после следующих операций: передняя кольпорафия, задняя кольпорафия и кольпоклез.
5. Транспортировка ткани в лабораторию в стерильном стаканчике для сбора образцов с обычным физиологическим раствором или не содержащим сыворотки средой DMEM/F12 (Gibco). Держите на льду.

2. Обработка и переваривание тканей

1. Подготовка тканей
   1. Измерьте и разрежьте ткань так, чтобы она охватывала всю толщину эпителия влагалища, создавая сегменты размером примерно 1^см2.
   2. Обеспечьте точное измерение размера биопсии 1 см².
      ПРИМЕЧАНИЕ: Завышение размера биопсии ткани может ухудшить переваривание тканей.
   3. Подготовьте 2-3 дополнительные биопсии влагалища размером 1 см² каждая от одного донора и отложите биопсию в сторону.
2. Механическое сбраживание
   1. Поместите биопсию влагалища в чашку Петри для клеточной культуры толщиной 10 см. Пипетку 500-1 000 мкл бессывороточной среды с добавлением 100 ЕД/мл пенициллина/стрептомицина, 2,5 мкг/мл амфотерицина Бонто во влагалищную ткань для предотвращения высыхания ткани.
   2. Измельчите ткани влагалища на мелкие фрагменты с помощью двух стерильных скальпелей (No11 или No15) в обеих руках.
   3. Убедитесь, что кончики лезвий расположены перпендикулярно поверхности ткани. Равномерное и равномерное давление надавите на поверхность ткани с помощью двух скальпелей. Выполняйте попеременное тянущее действие, чтобы разрезать ткань на очень мелкие кусочки.
   4. Повторяйте эту технику измельчения, используя технику двух скальпелей до тех пор, пока образец не станет однородным по консистенции с кусочками 1-2 мм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Механическое разложение с использованием этой двухскальпельной техники биопсии размером 1 см² должно занять примерно 15-20 минут.
   5. Добавьте в тарелку 2-3 мл бессывороточной среды DMEM/F12 с добавлением 100 ЕД/мл пенициллина/стрептомицина, 2,5 мкг/мл амфотерицина В, суспендируя измельченную ткань. Пипеткой впрыскивайте раствор, содержащий фрагменты ткани, вверх и вниз, чтобы разбить любые комки.
3. Ферментативное сбраживание
   1. Перелейте раствор, содержащий фрагменты ткани, в коническую пробирку объемом 15 мл. Добавьте бессывороточную среду DMEM/F12 в чашку для культивирования тканей, где была измельчена вагинальная ткань, чтобы собрать любые оставшиеся фрагменты ткани. Переложите раствор, содержащий фрагменты ткани, в коническую трубку. Добавляйте дополнительные бессывороточные среды DMEM/F12 до тех пор, пока общий объем не достигнет 10 мл.
   2. Растворите 5 мг либеразы в 1 мл стерильной воды (5 мг/мл). Хранить в аликвотах объемом 230 мкл при температуре −20 °C до месяца или при температуре −80 °C в течение 6 месяцев.
   3. Добавьте в пробирку 230 μЛ Либеразы (запас 13 Ед/мл) с конечной концентрацией 0,3 Ед/мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Активность Liberase может варьироваться в зависимости от партии. Разморозьте каждую аликвоту непосредственно перед применением с помощью водяной бани. Избегайте многократного замораживания и размораживания.
   4. Повторите шаги 2.1-2.3 для 2-3 дополнительных биопсий влагалища того же донора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Храните каждый раствор, содержащий фрагменты ткани из одной биопсии, в отдельных конических пробирках. Например, 4 биопсии влагалища в 4 пробирках. Это важно для оптимального гранулирования клеток после центрифугирования.
   5. Инкубируйте пробирки в течение 3 ч при 37 °C при постоянном энергичном перемешивании с помощью смесителя для проб.
   6. Поместите смеситель для образцов в инкубатор с_CO2 . Поддерживайте постоянное возбуждение. (Настройки смесителя образцов: 25 об/мин вращательного движения в течение 5 с, 30° обратного (наклонного вращения) в течение 5 с и 2° вибрационного (вихревого) движения в течение 3 с).
   7. Во время инкубации делайте трубки вихревыми с интервалом в 30 минут.
   8. Центрифугируйте образцы при давлении 3 000 x g в течение 5 минут. Удалите и выбросьте надосадочную жидкость.
   9. Ресуспендируйте гранулу в 1-2 мл DMEM/F12 среды с 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) и 100 ЕД/мл пенициллина/стрептомицина, 2,5 мкг/мл амфотерицина B для разбавления фермента либеразы. Энергично пипетируйте до тех пор, пока гранула не будет полностью суспендирована.

3. Культура клеток

1. Удаление непереваренных фрагментов тканей
   1. Поместите клеточное фильтр 100 мкм над стерильным коническим контейнером объемом 50 мл.
   2. Объедините клеточную суспензию из нескольких биопсий тканей одного и того же донора.
   3. Процедите суспензию ткани/фермента, продавливая через нее поршенем шприца объемом 5 мл. Повторяйте этот шаг до тех пор, пока оставшиеся фрагменты ткани не будут полностью продавлены.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Может быть некоторое количество слизи из фрагментов ткани влагалища, которая не полностью прорабатывается через ситечко. Слейте слизь с помощью клеточного ситечка.
2. Объединение клеточных культур
   1. Планшет с объединенной клеточной суспензией из нескольких биопсий влагалища (от одного и того же донора) на чашке Петри (60 мм x 15 мм).
   2. Инкубируйте чашку Петри в инкубаторе с_CO2 при температуре 37 °C в течение ночи.
   3. Наблюдайте и подтверждайте наличие неадгезивных клеток с помощью фазово-контрастного микроскопа.
   4. Убедитесь, что фокус микроскопа находится в нижней части пластины.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На переднем плане может быть много иммунных клеток. Меньшее количество фибробластов будет прикреплено к нижней части пластины.
   5. Подождите 18-24 часа перед сменой среды для клеточных культур, чтобы обеспечить адекватную адгезию клеток.
   6. Меняйте питательную среду каждые три дня до тех пор, пока не произойдет 80% слияние. Когда клетки достигнут 80-90% слияния, разложите до колбы большего размера или заморозьте аликвоты клеток для дальнейшего использования.

Results

Ткань влагалища была собрана у 10 независимых доноров, перенесших операцию по удалению пролапса тазовых органов. С помощью описанного протокола клетки были выделены из тканей влагалища человека. Клеточные популяции имели характерный удлиненный, плоский и веретенообразный вид. Как и в других исследованиях, мы наблюдали значительно более медленное удвоение клеточной способности и снижение клоногенной способности фибробластов с увеличением возраста донора. Эти различия были отмечены при сравнении фибробластов, выделенных от пожилых людей (75-78 лет), с фибробластами, выделенными от молодых людей (35-47 лет). Клетки доноров среднего возраста демонстрировали промежуточный профиль (56-61 год). Скорость пролиферации клеток первоначально оценивалась путем прямой визуализации с помощью фазово-контрастного микроскопа с той же известной плотностью затравки.

Рисунок 1: Схематическое представление протокола. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

На рисунке 1 показано схематическое представление протокола диссоциации и изоляции. Следуя этим шагам, этот протокол показал 90% успешность выделения первичных фибробластов у девяти из десяти доноров в количестве, достаточном для субкультивирования клеток. Средний возраст доноров составил 59 лет.

Протокол (Автор, год)	Донорская ткань оригинального протокола	Количество доноров	Возраст донора в годах	Полученные фибробласты	Морфология
Руис-Сапата и др., 2013	Влагалище человека	3	56-78	Нет	Н/Д
Khan et al., 2016	Мышиное ухо и хвост	2	48-65	Нет	Н/Д
Waise et al., 2019	Ткани человека	3	56-75	Нет	Н/Д
Nadalutti et al., 2020	Крайняя плоть человека	1	65	Нет	Н/Д
Текущий	Влагалище человека	10	35-79	Да	Веретенообразный

Таблица 1: Сравнение протоколов для успешной изоляции вагинальных фибробластов человека. Сравнение различных существующих протоколов с нашим и подтверждено морфологическими результатами.

В таблице 1 представлены результаты использования других протоколов для попытки выделения вагинальных фибробластов в этом исследовании. Нами был разработан стандартный протокол выделения первичных фибробластов из слизистой оболочки влагалища и у более старых доноров⁵.

Мы протестировали несколько установленных протоколов, в том числе перечисленных в таблице 1, и не обнаружили успеха в выделении клеток с использованием этих протоколов в нашем исследовании. Мы предлагаем следующие причины их ограничения.

Протокол, опубликованный Ruiz et ^al.3 , включает в себя соскабливание фасции и разрезание ткани на мелкие кусочки. По нашему опыту, различить фасцию сложно, и попытки выскабливания могут привести к значительному снижению выхода клеток. Несмотря на то, что этот метод прост, в нем отсутствуют критические детали, что ограничивает его обобщаемость. Кроме того, механическое пищеварение в этом протоколе оказывается недостаточным для ткани постменопаузы, которая имеет тенденцию быть более плотной.

В протоколах, опубликованных Khan et ^al.9 и Waise et ^al.13 , используются ножницы для измельчения тканей, которые не создают значительных разнонаправленных сил сдвига по сравнению с техникой скальпеля. По нашему опыту, метод ножниц также не работал эффективно.

Наконец, протокол Nadalutti et ^al.14 , в котором использовался метод экспланта, не привел к получению фибробластов в наших руках. Этот метод может быть менее эффективным из-за особенностей ткани в постменопаузе, которая может потребовать более агрессивной механической и ферментативной обработки для успешной диссоциации фибробластов.

Рисунок 2: Фазово-контрастное изображение взвешенных клеток в день 0. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

На рисунке 2 показаны взвешенные клетки в день 0 с использованием нашего протокола.

Рисунок 3: Фазово-контрастное изображение первичных вагинальных фибробластов на 14-й день посева при 100-кратном увеличении из объединенной клеточной суспензии трех биопсий ткани размером 1^см2 . Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

На рисунке 3 показаны первичные фибробласты при 100-кратном увеличении из объединенной клеточной суспензии из 3 биопсий ткани размером 1 см².

Идентичность фибробластов исследовали с помощью иммунофлуоресцентных методов, описанных ранее, с незначительными изменениями. Для верификации клеточного происхождения первичных клеток влагалища мы использовали специфические биомаркеры фибробластического происхождения с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания. Клетки были идентифицированы как фибробласты на основе положительного окрашивания виментина (рис. 4), F-актина и α-СМА из образцов тканей в пременопаузе и постменопаузе (рис. 5). Фибробласты культивировали до экспансии с высокой жизнеспособностью (>90%) для использования в экспериментах.

Рисунок 4: Положительное окрашивание виментина вагинальных фибробластов. Изолированные первичные фибробласты тканей в пременопаузе и постменопаузе подвергали анализу ИФ, и изображения были сделаны с 200-кратным увеличением. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 5: Положительное окрашивание F-актина и α-СМА вагинальных фибробластов. Результаты экспрессии белка сравнивались с контролем IgG. Изображения были собраны при 200-кратном увеличении. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Discussion

Во многих предыдущих исследованиях сообщалось о том, как выделить первичные фибробласты из влагалища человека ^3,7. В нескольких исследованиях использовали ткани человеческого влагалища у женщин в пременопаузе с пролапсом тазовых органов. Хотя в нескольких работах сообщалось об использовании тканей от лиц в пременопаузе и постменопаузе ^7,11, они не описывали достаточно подробно протокол, используемый для успешного выделения фибробластов от более старых доноров или доноров в постменопаузе. Стенка влагалища толще у женщин в постменопаузе с пролапсом гениталий, чем у женщин в пременопаузе, что может объяснять повышенные трудности с изоляцией в^{этой популяции}. Успешная изоляция от доноров в постменопаузе имеет важное значение для моделирования и исследования заболевания, поскольку расстройства тазового дна наиболее распространены в постменопаузе или старших возрастных группах.

Мы разработали протокол для успешного и последовательного сбора и культивирования вагинальных фибробластов человека у доноров в возрасте 35-78 лет. Клеточное происхождение первичных клеток влагалища было подтверждено биомаркерами фибробластического происхождения с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания.

Представленная здесь процедура выделения вагинальных фибробластов человека позволяет выделить и культивировать клетки первичных фибробластов. По нашему опыту, использование ранее опубликованных протоколов для тканей животного⁹и человека ^3,14,16 для диссоциации первичных клеток не привело к извлечению фибробластов из образцов влагалища человека в этом исследовании¹⁴.

Мы предположили две вероятные причины проблем диссоциации клеток из ткани влагалища человека: (1) толщина слизистой оболочки кожи кожи у пожилых доноров больше у пожилых доноров и по сравнению с толщиной слизистой оболочки от старых доноров^13,17 что затрудняет диссоциацию клеток и (2) плотность фибробластов может быть заметно снижена у пожилых людей¹⁷.

Учитывая эти проблемы, в этом протоколе есть несколько критически важных шагов, которые не следует изменять. Первым важным этапом является осуществление очень строгого механического разложения. Здесь мы используем технику двух скальпелей. По нашему опыту, замена ножницами для измельчения ткани не дает достаточно мелких фрагментов для диссоциации фибробластов из ткани влагалища человека.

Другим важным этапом является объединение клеточной суспензии и объединение 3-4 биопсий полной толщины (1 см² дюйма) от одного донора. Это необходимо для получения достаточного количества клеток для постоянного культивирования. Во всех случаях мы собрали значительно больше ткани, чем 1 см² , так как избыток вагинального эпителия обрезается как необходимая часть хирургии пролапса тазовых органов. В этом исследовании мы объединяли только клеточные суспензии, полученные от одного и того же донора, поскольку мы стремились изучить и дифференцировать клеточные характеристики и пролиферацию между различными донорами.

Наш протокол имеет явное преимущество: механическое и ферментативное расщепление приводит к лучшему выходу для тканей в постменопаузе, но не оказывает негативного влияния на образцы в пременопаузе.

Мы признаем несколько ограничений нашего протокола. Доступ к тканям влагалища человека может быть затруднен в ситуациях, когда операция по пролапсу влагалища не проводится. Необходимость объединения клеточных суспензий нескольких образцов биопсии тканей также может быть ограничением.

В заключение, этот протокол для получения вагинальных фибробластов человека станет полезным инструментом для будущих исследований заболеваний тазового дна, особенно у лиц в постменопаузе, а также важным дополнением к исследованиям в области женского здоровья.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Амфотерицин B	Bio Techne	B23192
Клеточный фильтр (100 μ m)	ThermoFisher Scientific	22363549
конические центрифужные пробирки (15 мл)	Fisher Scientific	14-959-53A
DMEM/F12	ThermoFisher Scientific	11320033
Перо одноразовый скальпель No15	Socorex	FB.15
Фетальная бычья сыворотка	Sigma Aldrich	NC1983075
конические центрифужные пробирки высокой прозрачности (50 мл)	Fisher Scientific	14-432-22
Смеситель образцов HulaMixer	ThermoFisher Scientific	15920D
Фибронектин человека DuoSet ELISA	R& D Systems	DY1918-05
Human Pro-Collagen I alpha 1 DuoSet ELISA	R& D Systems	DY6220-05
Liberase Research Grade	Sigma Aldrich	05 401 119 001
Пенициллин/стрептомицин (5000 ед/мл)	ThermoFisher Scientific	15070063
чашки Петри, полистирол (100 мм x 20 мм)	Millipore Sigma	P5606
(10 мл)	ThermoFischer Scientific	170356N
Стерильные шприцы (5 мл)	Fischer Scientific	14-955-458