Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Оценка нейротоксичности у взрослых Danio rerio с использованием батареи поведенческих тестов в одном аквариуме

2.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/65869

⸱

3 ноября 2023 г.

 ,  , 
1Institute for Environmental Assessment and Water Research (IDAEA-CSIC), 2Research and Development Center (CID-CSIC)

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем комплексную батарею поведенческих тестов, включая новый аквариум, шолинг и тесты социальных предпочтений, для эффективного определения потенциального нейротоксического воздействия химических веществ (например, метамфетамина и глифосата) на взрослых рыбок данио, использующих один аквариум. Этот метод имеет отношение к нейротоксичности и экологическим исследованиям.

Аннотация

Наличие невропатологических эффектов в течение многих лет являлось основной конечной точкой для оценки нейротоксичности химического вещества. Однако в последние 50 лет активно исследуется влияние химических веществ на поведение модельных видов. Постепенно поведенческие конечные точки были включены в протоколы нейротоксикологического скрининга, и эти функциональные результаты в настоящее время регулярно используются для выявления и определения потенциальной нейротоксичности химических веществ. Поведенческие анализы взрослых рыбок данио-рерио предоставляют стандартизированные и надежные средства для изучения широкого спектра поведения, включая тревогу, социальное взаимодействие, обучение, память и зависимость. Поведенческие анализы взрослых рыбок данио-рерио обычно включают в себя помещение рыб на экспериментальную арену, запись и анализ их поведения с помощью программного обеспечения для видеослежения. Рыбы могут подвергаться воздействию различных стимулов, а их поведение может быть количественно оценено с помощью различных показателей. Новый аквариумный тест является одним из наиболее принятых и широко используемых тестов для изучения тревожного поведения у рыб. Тесты на косяки и социальные предпочтения полезны при изучении социального поведения рыбок данио. Этот анализ особенно интересен, так как изучается поведение всего косяка. Эти анализы оказались высоковоспроизводимыми и чувствительными к фармакологическим и генетическим манипуляциям, что делает их ценными инструментами для изучения нейронных цепей и молекулярных механизмов, лежащих в основе поведения. Кроме того, эти анализы могут быть использованы при скрининге лекарств для выявления соединений, которые могут быть потенциальными модуляторами поведения.

В этой работе мы покажем, как применять поведенческие инструменты в нейротоксикологии рыб, анализируя действие метамфетамина, рекреационного наркотика, и глифосата, загрязнителя окружающей среды. Результаты демонстрируют значительный вклад поведенческих анализов на взрослых рыбках данио-рерио в понимание нейротоксикологических эффектов загрязнителей окружающей среды и лекарств, а также дают представление о молекулярных механизмах, которые могут изменять функцию нейронов.

Введение

Рыбка данио-рерио (Danio rerio) является популярным модельным видом позвоночных для экотоксикологии, разработки лекарств и фармакологических исследований безопасности. Его низкая стоимость, хорошо зарекомендовавший себя молекулярно-генетический инструментарий и сохранение ключевых физиологических процессов, участвующих в морфогенезе и поддержании нервной системы, делают рыбку данио-рерио идеальной животной моделью для исследований в области нейробиологии, включая нейроповеденческую токсикологию 1,2. Основной конечной точкой для оценки нейротоксичности химического вещества до недавнего времени было наличие невропатологических эффектов. Однако в последнее время поведенческие конечные точки были включены в протоколы нейротоксикологического скрининга, и эти функциональные исходы в настоящее время широко используются для выявления и определения потенциальной нейротоксичности химических веществ 3,4. Более того, поведенческие конечные точки очень важны с экологической точки зрения, поскольку даже очень незначительные изменения в поведении рыб могут поставить под угрозу выживание животного в естественныхусловиях.

Одним из наиболее часто используемых поведенческих тестов в исследованиях взрослых рыбок данио является новый резервуарный тест (NTT), который измеряет тревожное поведение 6,7. В этом анализе рыбы подвергаются воздействию новизны (рыбы помещаются в незнакомый аквариум), мягкого аверсивного раздражителя и наблюдаются их поведенческие реакции. НТТ используется в основном для оценки базальной локомоторной активности, геотаксиса, замерзания и беспорядочных движений рыб. Неустойчивая8 характеризуется резкими изменениями направления (зигзагами) и повторяющимися эпизодами ускорений (рывок). Это тревожная реакция, которая обычно наблюдается до или после эпизодов замерзания. Поведение замерзания соответствует полному прекращению движений рыбы (за исключением оперкулярных и глазных движений) во время нахождения на дне аквариума, в отличие от неподвижности, вызванной седацией, которая вызывает гиполокомоцию, акинезию и погружение8. Замерзание обычно связано с высоким уровнем стресса и тревоги, а также является частью покорного поведения. Сложное поведение является отличным индикатором состояния беспокойства животных. Былопоказано, что НТТ чувствительна к фармакологическим и генетическим манипуляциям, что делает ее ценным инструментом для изучения нейронной основы тревоги и связанных с ней расстройств.

Рыбки данио-рерио являются очень социальным видом, поэтому мы можем измерить широкий спектр социального поведения. Тест на мелководье (ST) и тест социальных предпочтений (SPT) являются наиболее часто используемыми тестами для оценки социального поведения10. ST измеряет склонность рыб группироватьсявместе 11 путем количественной оценки их пространственного поведения и моделей движения. ST полезен для изучения групповой динамики, лидерства, социального обучения и понимания социального поведения многих видов рыб12. SPT у взрослых рыбок данио-рерио был адаптирован из теста Кроули на социальную новизну для мышей13 и быстро стал популярным поведенческим тестом для изучения социального взаимодействия у этого модельноговида. Эти два теста также были адаптированы для использования в скрининговых тестах на наркотики и показали перспективность для выявления новых соединений, которые модулируют социальное поведение15,16.

В целом, поведенческие анализы у взрослых рыбок данио-рерио являются мощными инструментами, которые могут предоставить ценную информацию о механизмах поведения или нейрофенотипах активных соединенийи злоупотребляемых наркотиков. В этом протоколе подробно описывается, как реализовать эти поведенческие инструменты7 с базовыми материальными ресурсами и как применять их в анализах токсичности для характеристики эффектов широкого спектра нейроактивных соединений. Кроме того, мы увидим, что те же самые тесты могут быть применены для оценки нейроповеденческих эффектов острого воздействия нейроактивного соединения (метамфетамина), а также для характеристики этих эффектов после хронического воздействия концентраций пестицида (глифосата) в окружающей среде.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Строгое соблюдение этических норм гарантирует благополучие и надлежащее обращение с рыбками данио, используемыми для экспериментов. Все экспериментальные процедуры проводились в соответствии с руководящими принципами, установленными Институциональными комитетами по уходу за животными и их использованию (CID-CSIC). Протоколы и результаты, представленные ниже, выполнены в соответствии с лицензией, выданной местным самоуправлением (номер договора 11336).

1. Содержание животных для поведенческого тестирования

  1. Все тесты (представленные на рисунке 1) проводят в изолированной поведенческой комнате при температуре 27-28 °C с 10:00 до 17:00.
  2. Перед началом экспериментов промойте контрольную и подвергшуюся воздействию рыбе несколько раз в чистой рыбьей воде [очищенная обратным осмосом вода, содержащая 90 мг/л соли аквариумных систем, 0,58 мМ CaSO4·2H2O и 0,59 мМ NaHCO3] перед началом экспериментов, чтобы избежать возможного загрязнения экспериментального аквариума.
  3. Акклиматизируйте животных в комнате поведения за 1 ч до начала экспериментов.
  4. Удостоверьтесь, что животные (соотношение самцов и самок ≈50:50) экспериментально наивны и проводят все поведенческие тесты вслепую, когда наблюдатели не знают об экспериментальной группе.
  5. Чтобы получить значимые результаты в поведенческих анализах, необходимо иметь общее количество 18 испытуемых для каждого условия (n = 18), в идеале полученных между двумя или более независимыми экспериментами. Например, в отдельных тестах проанализируйте поведение 9 животных в каждом состоянии, в каждой реплике. В групповых тестах проанализируйте поведение косяка из 6-9 животных в каждом состоянии, в каждом повторении.
  6. Выполняйте все испытания в соответствии с подходом тестирования батареи (см. предложения по планированию на рисунке 2). Этически более подходящий, этот метод позволяет уменьшить количество животных, необходимых для исследования, соблюдая принцип сокращения 3R7.
  7. В большинстве случаев поведенческие анализы связаны с биологическими анализами, поэтому приносите животных в жертву в соответствии с рекомендациями по эвтаназии18 , прежде чем собирать и анализировать образцы (OMICs или химические вещества). Если конечная точка не является выборкой, восстановите контрольную группу в конце эксперимента. Повторно использовать контрольных животных в племенных или экспериментальных целях через несколько дней.

figure-protocol-1
Рисунок 1: Экспериментальные установки. Три конфигурации квадратного аквариума для изучения широкого спектра поведения взрослых рыбок данио. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

figure-protocol-2
Рисунок 2: Хронология эксперимента. Два предложения по планированию записи поведенческих анализов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

2. Экспериментальные конфигурации танка

  1. Тревожное поведение: новый танковый тест (NTT)
    1. Отрегулируйте экспериментальную установку (количество резервуаров, камер и компьютеров) для одновременной регистрации максимального количества рыб. Индивидуальные поведенческие анализы отнимают много времени, поэтому оптимизируйте время, материал и пространство.
    2. Подготовьте экспериментальные резервуары для NTT: Квадратный резервуар (20 см в длину, 20 см в ширину, 25 см в высоту), покрытый акриловыми панелями на боковых стенках и дне, чтобы избежать отражения и интерференции между объектами.
    3. Наполните экспериментальные резервуары 7 л (высота водяного столба: высота 20 см) хорошо насыщенной кислородом воды для рыб при температуре 28 °C.
    4. Отрегулируйте положение резервуара перед камерой, чтобы избежать искажения изображения.
    5. Проверьте настройку освещения. Светодиодная подсветка (10000 люкс) обеспечивает равномерное освещение всей части резервуара для видеозаписи в хороших условиях.
    6. Включите камеры и отрегулируйте их в соответствии с разделом 3.
    7. Вводите испытуемых, одного за другим, на дно экспериментальных резервуаров, прежде чем начать запись как можно быстрее.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно начинать запись с животного, находящегося на дне аквариума.
    8. Следите за тем, чтобы не беспокоить животных во время записи. Использование шторы или панели для ограничения визуального взаимодействия не только между резервуарами, но и между опорой и внешней стороной.
    9. По окончании записи (стандартное время записи 6 минут) пересадите животных, которые уже прошли тест, в другой аквариум, чтобы не перепутать их с наивными животными.
    10. Повторите процедуру со всеми доступными предметами. Для получения значимых результатов в отдельных испытаниях (из двух или более независимых повторений) рекомендуется иметь в общей сложности 18 субъектов для каждого состояния.
    11. Рандомизируйте экспериментальную группу, назначенную каждому резервуару между испытаниями, чтобы избежать любых потенциальных эффектов для резервуара (если вы регистрируете несколько состояний одновременно).
  2. Социально-групповое поведение: Тест на мелководье (ST)
    1. Экспериментальная конфигурация ST такая же, как и у NTT (одни и те же баки могут быть использованы повторно напрямую).
    2. Выполните шаги 2.1.1-2.1.6. для настройки ST.
    3. Поместите косяк (от 6 до 9 испытуемых одновременно) на дно экспериментальных аквариумов, прежде чем начать запись как можно быстрее.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно начинать запись с животного, находящегося на дне аквариума.
    4. Выполните шаги 2.1.8-2.1.11. для выполнения ST.
    5. Повторите процедуру со всеми доступными предметами. Чтобы получить значимые результаты в этом анализе, сделайте по крайней мере две независимые репликации с одинаковым размером банка в каждой репликации.
    6. Поддерживайте размер косяка одинаковым для всех экспериментальных групп и репликаций внутри одного эксперимента.
  3. Социальное индивидуальное поведение: тест социальных предпочтений (SPT)
    1. Отрегулируйте экспериментальную установку, чтобы оптимизировать экспериментальное пространство и время записи.
    2. Подготовьте экспериментальные резервуары для SPT: Квадратный резервуар (20 см в длину, 20 см в ширину, 25 см в высоту), прозрачный (стеклянный или пластиковый) для обеспечения бокового обзора. Одиночная фокальная рыба может свободно взаимодействовать с конспецифической виртуальной зоной - косяком рыбы, помещенным в односторонний внешний аквариум, или с неспецифической виртуальной зоной - односторонним внешним пустым аквариумом.
    3. Наполните экспериментальные резервуары 5 л (высота водяного столба: 15 см, такая же высота, как и столб воды во внешних резервуарах) чистой воды для рыб при температуре 28 °C.
    4. Отрегулируйте положение резервуара перед камерой, чтобы избежать искажения изображения.
    5. Убедитесь, что система получает равномерное освещение.
    6. Введите испытуемых, одного за другим, на дно экспериментальных аквариумов, прежде чем сразу же начать запись с животным внизу в центре.
    7. Избегайте визуального взаимодействия между наблюдателями и животными во время записи.
    8. По окончании 6-минутной записи пересадите присутствующих животных в другой аквариум, чтобы не смешать их с наивными животными.
    9. Повторите процедуру со всеми доступными предметами. Иметь в общей сложности 18 субъектов для каждого состояния, чтобы получить значимые результаты в отдельных испытаниях (из двух или более независимых повторений).

3. Видеозапись для поведенческих тестов

  1. Откройте диспетчер камер, чтобы проверить доступность камеры GigE на каждом компьютере.
  2. Запустите программное обеспечение для управления камерой GigE (например, uEye Cockpit, описанное здесь). Откройте опцию «Камера », выберите «Монохромный режим» и отрегулируйте размер изображения (1:2).
  3. Откройте окно «Свойства камеры»
    1. В разделе «Камера» установите для параметра «Частота пикселей » значение «Максимум», установите частоту кадров на 30 кадров в секунду (fps) и отрегулируйте экспозицию («Авто » или «Ручная настройка», если изображение слишком темное).
    2. В разделе «Изображение» установите для параметра «Усиление » значение 0 (Авто) и для получения хорошего контраста значение « Уровни черного » («Авто» или «Ручная настройка»).
    3. В разделе «Размер» отрегулируйте размер окна в соответствии с областью, которую необходимо выгравировать («Ширина: Ширина-Влево», Высота: Высота-Сверху). Этот шаг позволяет уменьшить размер изображения и, следовательно, окончательный размер видео.
    4. Закройте окно Свойства камеры.
  4. Создайте общую папку для сеанса эксперимента, чтобы сохранить настройки камеры и видео.
  5. Чтобы сохранить настройки камеры, установите Файл > Сохранить параметры > В файл и выберите недавно созданную папку эксперимента.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Таким образом, файл настроек камеры может быть перезагружен в приложение, чтобы продолжить работу с теми же параметрами изображения в любое время (например, при внезапном выключении камеры или для повторного использования тех же настроек, сокращая время настройки и унифицируя условия эксперимента). Если в какой-то момент камера зависает между видео, остановите запись, выйдите и выключите камеру. Включите его снова, перезагрузите параметры камеры, перейдя в «Файл» > «Загрузить параметры» > «В файл», и перезапустите запись. Проверьте, полностью ли получено текущее видео, чтобы отбросить или повторить рыбу (перед повторением дайте животным некоторое время на реакклиматизацию).
  6. Повторите эту процедуру настройки камеры (шаги 3.1-3.5) на всех камерах.
  7. Когда все камеры будут правильно настроены, откройте функцию «Запись видеоряда».
  8. Нажмите кнопку Создать, чтобы сохранить его как новый видеофайл, выберите недавно созданную папку эксперимента и укажите в имени видеофайла сведения об объекте, типе эксперимента и дате.
  9. Выберите Максимальное количество кадров. Введите 10800 в рамной коробке. Стандартное видео - запись 6 минут (Видео 1) с частотой 30 кадров в секунду в формате AVI; Таким образом, 6 мин x 60 с x 30 кадров в секунду = всего 10800 кадров.
  10. Выберите Calc. Frame Rate (Расчет частоты кадров) или укажите частоту кадров вручную (скорость записи: 30 кадров в секунду).
  11. Повторите процедуру создания видеофайла на всех компьютерах.
  12. Представьте испытуемых, одного за другим, на дне каждого экспериментального аквариума. Все анализы будут проведены одновременно.
  13. Быстро запустите записи, нажав на кнопку «Запись », и подождите, пока не будет получено максимальное количество запрошенных кадров (шаг 3.10).
  14. После того, как видео будет записано, появится окно чата с сообщением Достигнуто максимальное количество кадров!. Выберите Принять.
  15. Нажмите кнопку Закрыть, чтобы завершить запись и закрыть видеофайл.
  16. Удалите рыбок, которые только что были замечены. Будьте осторожны, чтобы отделить их от наивных рыбок.
  17. Выберите Создать и повторите процесс, чтобы продолжить запись видео.
  18. Когда все записи будут завершены, выберите Выйти.
  19. Чтобы выключить камеры, выберите «Закрыть камеру » и «Выйти из программы».

4. Анализ записанных видео

  1. Запустите программное обеспечение для анализа (см. Таблицу материалов).
  2. Чтобы подробнее рассказать о новом шаблоне, нажмите « Создать из шаблона» > «Применить предопределенный шаблон» > «Из видеофайла» и выберите видео, чтобы начать настройку шаблона. Постарайтесь выбрать репрезентативное видео эксперимента с испытуемым, демонстрирующим хорошую подвижность и хорошие условия записи.
  3. В разделе Параметры настройте параметры в следующих окнах (от 1 до 4/7). Выберите модель Fish > Adult Zebrafish, арену Open Field Square > One Arena, количество объектов на арене (для ST требуется пакет мультитрекинга [отслеживание различных объектов на одной арене]) тип Detection by Center-Point и, наконец, отрегулируйте частоту кадров до 30 кадров в секунду. В следующих окнах (от 5 до 7/7) не изменяйте параметры; Конфигурация по умолчанию — ОК.
  4. Назовите эксперимент шаблоном и поместите его в ту же папку, что и остальное сохраненное видео. Шаблон будет создан в виде папки эксперимента с несколькими подразделениями, содержащими всю информацию о настройке.
  5. В разделе «Настройки эксперимента» проверьте заданные настройки (видеофайл, арена, количество испытуемых, кадр в секунду). Здесь можно модифицировать системные блоки.
  6. В разделе «Настройки арены» щелкните правой кнопкой мыши по центру экрана и выберите «Захват». Из файла на дисплее. Выберите видеоизображение хорошего качества и нажмите кнопку Принять , чтобы захватить это изображение для настроек фона. Сначала откалибруйте изображение, создав откалиброванное правило. В качестве шкалы используйте ширину емкости (19 см). Затем нарисуйте арену. Будьте осторожны, чтобы сделать квадрат ровно настолько, чтобы избежать отражений животного, когда оно приближается к поверхности, или любой возможной путаницы между программным обеспечением рыб и черными областями аквариума. Наконец, нарисуйте зоны фигуры с помощью функции Рамка .
    1. Для NTT и ST разделите переднюю часть резервуара на две равные виртуальные зоны: верхнюю и нижнюю (см. рис. 1). Нарисуйте две равные горизонтальные рамки. Боксы покрывают половину арены для каждого из них. Назовите Верхнюю и Нижнюю зоны для верхней и нижней зон соответственно. Следите за тем, чтобы коробки имели одинаковую ширину (9-10 см) и длину (8-9 см), не выходили за границы арены (оранжевый квадрат) и не перекрывали друг друга, проверяя, чтобы каждая стрелка зоны точно указывала на свои зоны.
    2. Для SPT концептуально разделите экспериментальную арену на три равные по размеру зоны: пустую, центральную и конспецифическую (см. рис. 1). Нарисуйте три одинаковых вертикальных прямоугольника. Коробку, ориентированную на мелководный аквариум, назовите Conspecific, коробку, ориентированную на пустой аквариум, как Empty, а среднюю — Center. Следите за тем, чтобы боксы имели одинаковую ширину (6 см) и длину (18-19 см), не выходили за пределы манежа и не перекрывали друг друга.
  7. В разделе «Настройки обнаружения» укажите, с каким видео будет работать в видеофайле. Затем проверьте качество обнаружения (рыба желтого цвета, красная центральная точка). Нажмите « Автоопределение », чтобы настроить обнаружение, перефокусировав животное (выберите изображение, на котором животное плавает в профиль на белом фоне, нарисуйте картинку, взяв все его тело, и подтвердите обнаружение нажатием «Да»). Откройте «Дополнительно», чтобы улучшить обнаружение, выбрав «Динамическое вычитание», «Темный объект», «Настройки фона», «Фоновое обучение», «Размер объекта», «Шумоподавление» и т. д.
  8. В разделе «Настройки пробных версий» поместите одну пробную версию и удалите другие (щелкните правой кнопкой мыши и удалите).
  9. В разделе "Параметры данных" создайте диалоговые окна "Результаты ". Параметризация результатов по времени и по зонам. Например, создайте одно окно Результаты для вывода данных по минутам, а другое — для вывода данных по общему времени (6 минут). Запросите вывод данных для каждой зоны (запросите его, если требуется расстояние в каждой зоне). Свяжите различные окна результатов с начальным окном с помощью стрелок.
  10. В разделе "Параметры анализа" выберите параметры для анализа и тип статистики для каждого параметра. Эти параметры будут автоматически рассчитаны на основе данных, полученных в результате отслеживания.
    1. Для NTT и SPT выберите параметры, как определено ниже:
      1. Выберите «Перемещенное расстояние» (выберите «Общее»), чтобы получить расстояние, пройденное на арене (см) и расстояние, пройденное в соответствующих зонах (см).
      2. Выберите «В зонах» (выберите «Зоны», «Частота», «Кумулятивный» и «Задержка до первой»), чтобы получить время, проведенное в зонах (зонах), и задержку до первого входа в зону (зоны).
      3. Выберите "Переход зоны" (выберите "Пороговое значение: 0 см", "Добавить зону 1" > "Зону 2"; Зона 2 > Зона 1, в любых зонах, Частота) для получения количества входов в зонах.
      4. Выберите Mobility Sate (Состояние мобильности) (заполните поля High mobile выше 70%, Immobile ниже 3%, минимум 150 кадров и выберите частоту, кумулятивность и задержку до первого), чтобы получить продолжительность гипермобильности (s), продолжительность замораживания (s).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Смотрите раздел «Обсуждение» для получения более подробной информации об аппроксимации поведения замораживания с помощью автоматизированного анализа, а также о количестве и продолжительности эпизодов замораживания.
      5. Выберите «Ускорение и угол поворота» (выберите частоту и кумулятивный), чтобы оценить возникновение сложных поведений, таких как рывки и беспорядочные (движения с быстрым ускорением).
    2. Для ST, в дополнение к вышеуказанным исследовательским параметрам, выберите опцию Distance Between Subjects (выделите все объекты, среднее, максимальное, минимальное), чтобы получить среднее расстояние между рыбами (см), среднее расстояние между ближайшим соседом (см) и среднее расстояние между самым дальним соседом.
  11. Шаблон готов к использованию. Сохраните последние изменения и закройте шаблон, не получая никаких данных из видео (поддерживайте файл шаблона; он легкий и простой в управлении и копировании). Если лицензий на программное обеспечение несколько, проанализируйте видео из одного шаблона, скопированные на каждый компьютер.
  12. Скопировать и использовать шаблон можно двумя способами:
    1. Откройте файл шаблона с помощью программного обеспечения для анализа поведения, перейдите в Файл > Сохранить как , чтобы создать новый идентичный файл.
    2. В интерфейсе приветствия выберите «Создать из шаблона» > «Применить пользовательский шаблон» > «Из видеофайла» (выберите «Шаблон. EthXV). Присвойте новому эксперименту имя и выберите его расположение. Программному обеспечению может потребоваться несколько минут, чтобы скопировать информацию из файла шаблона.
  13. Перейдите в «Настройки арены », чтобы повторно настроить шаблон, если видео было записано другой камерой (выполните шаги 4.6 и 4.7).
  14. Перейдите в раздел «Настройки обнаружения» или «Сбор», чтобы проверить, какое видео выбрано, и при необходимости измените видеофайл.
  15. В разделе Acquisition (Приобретение) выберите DDS > Ready to Start (Готово к запуску). Программное обеспечение может обработать видео в течение нескольких минут.
  16. Когда сбор данных будет завершен, перейдите в редактор треков. Выберите ускорение x16, чтобы быстрее прочитать обработанное видео и проверить правильность отслеживания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Иногда могут быть «потери» в отслеживании (из-за отражений или путаницы в самом программном обеспечении). Их можно отредактировать вручную из этой части, если их немного; В противном случае предпочтительнее повторно обработать весь эксперимент, улучшив определение холста и обнаружение.
  17. В разделе «Статистика» нажмите «Вычислить > экспортировать данные». Экспорт данных находится непосредственно в папке эксперимента.
  18. В разделе «Визуализация отслеживания » или «Тепловые карты» создайте и экспортируйте (щелкните правой кнопкой мыши, экспортируйте изображение, выберите папку «Файлы экспорта » эксперимента, чтобы сохранить эти данные с отчетом по электронной таблице) изображения отслеживания животного.
  19. Перейдите в раздел Файл, чтобы закрыть активный эксперимент, и повторите эту процедуру для следующего видео.

5. Статистический анализ

  1. Проанализируйте нормальность (критерий Шапиро-Уилка) данных в каждой группе.
  2. Оценивают гомоскедастичность с помощью критерия Левена.
  3. Используйте одностороннюю дисперсию, а затем множественные сравнительные тесты Даннета и Тьюки для проверки различий между группами, когда критерии нормальности и гомоскедастичности не могут быть отвергнуты.
  4. Используйте критерий Краскела-Уоллиса с последующим попарным сравнением с использованием поправки Бонферрони для проверки различий между группами, когда критерии нормальности и гомоскедастичности отвергаются.
  5. Построение графиков данных с помощью графического программного обеспечения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В этом разделе мы рассмотрим некоторые возможные применения этих поведенческих инструментов в нейротоксикологии рыб. Следующие результаты соответствуют характеристике острых или запойных эффектов метамфетамина (МЕТАМ), рекреационного наркотика, и субхронических эффектов глифосата, одного из основных гербицидов, обнаруженных в водных экосистемах.

Характеристика модели нейротоксичности метамфетамина у взрослых рыбок данио-рерио
При оценке влияния 40 мг/л метамфетамина на НТТ ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Характерное тревожное поведение, наблюдаемое при НТТ, положительно коррелировало с уровнями серотонина, проанализированными в мозге21. Например, после воздействия парахлорфенилаланина (PCPA), ингибитора биосинтеза 5-НТ, у рыб наблюдался положительный геотаксис, а также снижение уровня 5-НТ в мозге22, результаты, очень похожие на те, которые были получены при приеме метамфетамина. Таким образом, снижение уровня серотонина в головном мозге и проявление положительного геотакси...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что исследование проводилось в отсутствие каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана "Agencia Estatal de Investigación" Министерства науки и инноваций Испании (проект PID2020-113371RB-C21), IDAEA-CSIC, Центром передового опыта Северо Очоа (CEX2018-000794-S). Джульетт Бедроссианц получила грант (PRE2018-083513), софинансируемый правительством Испании и Европейским социальным фондом (ESF).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Аквариум Кубическая формаBlau Aquaristic7782025Cubic Panoramic 10  ( 10 L, 20 см x 20 см x 25 см, 5 мм)
Программное обеспечение EthovisionNoldusEthovision XTVersion 12.0 или новее
GigE cameraDevelopment SystemsUI-5240CP-NIR-GL
GraphPad Prism 9.02GraphPad software IncGraphPad Prism 9.02  Для Windows
IDS Camera ManagerСистемы обработки изображений Светодиодная
подсветкаQuirumedGP-G2
SPSS SoftwareIBMIBM SPSS v26
uEye Cockpit Software Системы обработки изображенийверсии 4.90

Ссылки

  1. Raldúa, D., Piña, B. In vivo zebrafish assays for analyzing drug toxicity. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 10 (5), 685-697 (2014).
  2. Faria, M., Prats, E., Bellot, M., Gomez-Canela, C., Raldúa, D. Pharmacological modulation of serotonin levels in zebrafish larvae: Lessons for identifying environmental neurotoxicants targeting the serotonergic system. Toxics. 9 (6), 118(2021).
  3. Faria, M., et al. Zebrafish models for human acute organophosphorus poisoning. Scientific Reports. 5, 15591(2015).
  4. Faria, M., et al. Glyphosate targets fish monoaminergic systems leading to oxidative stress and anxiety. Environment International. 146, 106253(2021).
  5. Faria, M., et al. Screening anti-predator behaviour in fish larvae exposed to environmental pollutants. Science of the Total Environment. 714, 136759(2020).
  6. Faria, M., et al. Acrylamide acute neurotoxicity in adult zebrafish. Scientific Reports. 8 (1), 7918(2018).
  7. Kalueff, A. V., Stewart, A. M. Zebrafish Protocols for Neurobehavioral Research. Neuromethods. , Springer Prtocols, Humana Totowa, NJ. (2012).
  8. Kalueff, A. V., et al. Towards a comprehensive catalog of zebrafish behavior 1.0 and beyond. Zebrafish. 10 (1), 70-86 (2013).
  9. Egan, R. J., et al. Understanding behavioral and physiological phenotypes of stress and anxiety in zebrafish. Behavioural Brain Research. 205, 38-44 (2009).
  10. Noldus. Social behavior in Zebrafish. , https://www.noldus.com/applications/social-behavior-zebrafish (2012).
  11. Green, J., et al. Automated high-throughput neurophenotyping of zebrafish social behavior. Journal of Neuroscience Methods. 210 (2), 266-271 (2012).
  12. Miller, N., Gerlai, R. Quantification of shoaling behaviour in zebrafish (Danio rerio). Behavioural Brain Research. 184 (2), 157-166 (2007).
  13. Landin, J., et al. Oxytocin receptors regulate social preference in zebrafish. Scientific Reports. 10 (1), 5435(2020).
  14. Ogi, A., et al. Social preference tests in zebrafish: A systematic review. Frontiers in Veterinary Science. 7, 590057(2021).
  15. Bedrossiantz, J., et al. A zebrafish model of neurotoxicity by binge-like methamphetamine exposure. Frontiers in Pharmacology. 12, 770319(2021).
  16. Hamilton, T. J., Krook, J., Szaszkiewicz, J., Burggren, W. Shoaling, boldness, anxiety-like behavior and locomotion in zebrafish (Danio rerio) are altered by acute benzo[a]pyrene exposure. Science of the Total Environment. 774, 145702(2021).
  17. Kane, A. S., Salierno, J. D., Brewer, S. K. Chapter 32. Fish models in behavioral toxicology: Automated Techniques, Updates, and Perspectives Methods in Aquatic Toxicology. Volume2, Lewis Publishers, Boca Raton, FL. (2005).
  18. Leary, S. L., et al. AVMA guidelines for the euthanasia of animals: 2020 edition. , www.avma.org/sites/default/files/2020-02/Guidelines-on-Euthanasia-2020.pdf (2020).
  19. Grieco, F., Krips, O. Help (PDF version) EthoVision ® XT. , www.noldus.com (2017).
  20. Faria, M., et al. Glyphosate targets fish monoaminergic systems leading to oxidative stress and anxiety. Environment International. 146, 106253(2021).
  21. Maximino, C., Costa, B., Lima, M. A review of monoaminergic neuropsychopharmacology in zebrafish, 6 years later: Towards paradoxes and their solution. Current Psychopharmacology. 5 (2), 96-138 (2016).
  22. Maximino, C., et al. Role of serotonin in zebrafish (Danio rerio) anxiety: Relationship with serotonin levels and effect of buspirone, WAY 100635, SB 224289, fluoxetine and para-chlorophenylalanine (pCPA) in two behavioral models. Neuropharmacology. 71, 83-97 (2013).
  23. Faria, M., et al. Therapeutic potential of N-acetylcysteine in acrylamide acute neurotoxicity in adult zebrafish. Scientific Reports. 9 (1), 16467(2019).
  24. Homer, B. D., Solomon, T. M., Moeller, R. W., Mascia, A., DeRaleau, L., Halkitis, P. N. Methamphetamine abuse and impairment of social functioning: A review of the underlying neurophysiological causes and behavioral implications. Psychological Bulletin. 134 (2), 301-310 (2008).
  25. Linker, A., et al. Assessing the maximum predictive validity for neuropharmacological anxiety screening assays using zebrafish. Neuromethods. 51, 181-190 (2011).
  26. Hartung, T. From alternative methods to a new toxicology. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 77 (3), 338-349 (2011).
  27. Cachat, J. M., et al. Video-Aided Analysis of Zebrafish Locomotion and Anxiety-Related Behavioral Responses. Zebrafish Neurobehavioral Protocols. Neuromethods. Kalueff, A., Cachat, J. 51, Humana Press. (2011).
  28. Rosemberg, D. B., et al. Differences in spatio-temporal behavior of zebrafish in the open tank paradigm after a short-period confinement into dark and bright environments. PLoS ONE. 6 (5), e19397(2011).
  29. Blaser, R., Gerlai, R. Behavioral phenotyping in Zebrafish: Comparison of three behavioral quantification methods. Behavioral Research Methods. 38 (3), 456-469 (2006).
  30. Cachat, J., et al. Three-dimensional neurophenotyping of adult zebrafish behavior. PLoS ONE. 6 (3), e17597(2011).
  31. Cachat, J. M., et al. Deconstructing adult zebrafish behavior with swim trace visualizations. Neuromethods. 51, 191-201 (2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Взрослые особи данио-рериоповеденческие тестытест «новый аквариум»тест на стайное поведениетест на социальные предпочтениявоздействие метамфетаминавоздействие глифосатавидеоотслеживаниетревожное поведение
Оценка нейротоксичности у взрослых Danio rerio с использованием батареи поведенческих тестов в одном аквариуме
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.