Хронический непредсказуемый легкий стресс у крыс на основе монгольской медицины

Большое депрессивное расстройство (БДР) является распространенным психическим заболеванием, занимающим третье место среди ведущих причин инвалидности во всем мире и затрагивающим более 300 миллионов человек^1,2,3. Примечательно, что, по оценкам, по крайней мере половина пострадавших людей не получает адекватного лечения⁴. Учитывая этот пробел, животные модели служат важным инструментом для исследования этиологии депрессии. На сегодняшний день существует более 20 различных животных моделей депрессии⁵. Среди них наиболее часто используется модель хронического непредсказуемого легкого стресса (CUMS), усовершенствованная Полом Уайнером в 1987 году⁶. Модель CUMS основана на предпосылке, что воздействие на грызунов разнообразного спектра социально-экологических стрессоров приводит к симптомам, похожим на тревогу, напряжение и депрессию. Методология включает в себя воздействие на животных различных умеренных стрессоров в течение нескольких недель, кульминацией которых является ряд поведенческих изменений, включая ангедонию и депрессивное поведение^7,8. Эти изменения сопровождаются сдвигами в эндокринных и нейротрансмиттерных профилях, такими как снижение 5-HT^9,10. Эти результаты очень похожи на те, которые наблюдаются у людей с диагнозом БДР, тем самым подтверждая полезность модели. Модель CUMS особенно ценится за ее эффективность в оценке антидепрессантов, демонстрируя высокий уровень поверхностной, структурной и прогностической валидности^11,12. В отличие от других моделей, CUMS чувствителен к последствиям хронического приема моноаминергических антидепрессантов. Например, было показано, что селективные ингибиторы обратного захвата серотонина (СИОЗС), такие как циталопрам, пароксетин и флуоксетин, предотвращают и обращают вспять ангедонию в условиях хронического стресса^12,13. Кроме того, новые быстродействующие антидепрессанты, такие как кетамин, также продемонстрировали эффективность в этой модели^14,15. Напротив, другие тесты, такие как тест на форсированное плавание (FST) и тест на подвешивание хвоста (TST), менее надежны для моделирования долгосрочных изменений в поведении, часто отражая адаптацию к острому стрессу, а не длительные симптомы депрессии¹⁶. Эти характеристики подчеркивают надежную валидность модели CUMS в исследованиях депрессии. Одной из наиболее заметных особенностей модели CUMS, признанной за ее высокую надежность в классических исследованиях, является ангедония — неспособность испытывать удовольствие или интерес к повседневной деятельности^17,18. Это явление обычно оценивается с помощью тестов на предпочтение сахарозы, и было показано, что многие антидепрессанты обращают вспять снижение потребления сахарозы. В литературе по CUMS также широко используются некоторые другие показатели, в том числе тест в открытом поле (OFT), который оценивает произвольное двигательное поведение, исследовательские тенденции и напряжение, тем самым измеряя тяжесть депрессии¹⁹. Другие тесты, такие как лабиринт с повышением плюс (EPM), оценивают тревожное поведение, тест водного лабиринта Морриса (MWM) исследует когнитивное функционирование²⁰, а FST оценивает восприимчивость к негативным эмоциям и поведенческому отчаянию²⁰. Кроме того, большинство стрессоров, влияющих на человека, носят социальный характер. Люди с неоптимальными социальными отношениями, характеризующиеся ограниченной социальной активностью, связями и поддержкой, подвергаются повышенному риску развития различных заболеваний^21,22. Это актуально и в случае с грызунами, которые являются социальными животными, живущими группами. Например, крысы, которые содержатся в изоляции, демонстрируют характеристики так называемого синдрома изоляции, который вызывает социальный стресс и ускоряет наступление депрессии²³.

Монгольская медицина, важная ветвь китайской медицины, утверждает, что возникновение болезни является сложным взаимодействием между внутренними и внешними факторами. Эти внешние факторы, называемые четырьмя вспомогательными условиями, включают в себя изменение климата, диету, образ жизни и внезапные события, такие как инфекции, поразительные инциденты и психологические расстройства. Процесс заболевания концептуализируется как непрерывное взаимодействие между тремя элементами, называемыми тремя типами гоморов, и семью составляющими тела в сочетании с четырьмя вспомогательными^{состояниями}. Монгольская медицина считает, что человеческое тело функционирует как единое целое, поддерживаемое относительным балансом между тремя гоморами. Нарушение этого равновесия считается предвестником болезни²⁴. Учитывая ключевую роль экспериментов на животных в установлении связей между традиционной и современной медициной, крайне важно разработать модели животных, которые имеют отношение к исследованиям в области монгольской медицины. Соответственно, мы использовали методологию 28-дневной изоляции в сочетании с CUMS для моделирования этих физиологических и психологических стрессоров. Мы выбрали девять конкретных непредсказуемых стрессоров и попытались подкрепить этот метод с помощью теории трех гоморов монгольской медицины. Создание надежной модели на животных имеет основополагающее значение для продвижения фундаментальных исследований в монгольской медицине и внесет значительный вклад в ее фундаментальные исследования.

Экспериментальные протоколы были одобрены Комитетом по этике экспериментального ухода за животными Медицинского университета Внутренней Монголии (YKD202301172) и соответствовали рекомендациям Национальных институтов здравоохранения по уходу за животными и этике. Номер лицензии нашего центра для животных - NO.110324230102364187. Двадцать четыре самца крысы породы Спрэг-Доули (SD), возраст каждого из которых составлял 8 недель (200 г ± 20 г), были приобретены и помещены в контролируемую среду с температурой от 22°C ± 2°C и влажностью от 55% ± 15%. Кормите крыс кормом для грызунов и чистой водой с кукурузными початками для подстилки. Крысы были подвергнуты циклу «свет/темнота» продолжительностью 12 ч/12 ч в течение 1 недели до начала эксперимента.

1. Создание модели крысы CUMS

1. Группировка
   1. Случайным образом разделите 24 крысы на 2 группы: контрольную (CON), которая не будет подвергаться изоляции или стрессу, и модельную (MOD). Каждая группа содержит по 12 крыс.
   2. Размещайте крыс в стандартных клетках размером 55 см x 40 см x 20 см, по 6 крыс в клетке. Сохраняйте место в клетке в течение всего периода акклиматизации, если не указано иное.
   3. Заполните каждую клетку для выращивания свежей подстилкой и заменяйте ее два раза в неделю.
   4. Проведите 1-недельный период акклиматизации. Предоставьте крысам неограниченный доступ к пище и воде, за исключением случаев применения стрессора CUMS. Поддерживайте постоянную окружающую среду с температурой от 22°C ± 2°C, влажностью от 55% ± 15% и циклом свет/темнота 12 ч/12 ч с 08:00 до 20:00, если не указано иное.
   5. Перед началом эксперимента ежедневно обрабатывайте крыс, чтобы приучить их к исследователю и свести к минимуму дополнительный стресс во время экспериментальной фазы.
2. Изоляция с хроническим непредсказуемым легким стрессом
   1. Одновременно размещайте группы MOD и CON в отдельных комнатах. Размещайте крыс группы MOD по отдельности, в то время как крысы группы CON держатся вместе. Поддерживайте все остальные условия постоянными.
   2. Внедрите 28-дневный режим приема стрессоров²⁵. Чтобы предотвратить привыкание и обеспечить непредсказуемость стрессора, вводите один случайный стрессор в день, избегая использования одного и того же стрессора в последующие дни.
   3. Произвольно применяйте один из следующих девяти стрессоров^26,27 в разные дни: 24 часа лишения воды, 24 часа лишения пищи, мокрая прокладка, наклон клетки, инверсия цикла света/темноты, воздействие холода при 4 °C, тепловое воздействие при 45 °C, 1 минута зажим хвоста или 15 минут встряхивание при 160 об/мин. Конкретная конструкция изложена в таблице 1.
   4. Во время применения стрессора ограничьте доступ к пище и воде для группы MOD до тех пор, пока стресс не закончится, за исключением периодов инверсии цикла свет/темнота. От группы CON не требовалось ограничивать воду и диету.
3. Стрессовые методы
   1. Начните эксперимент с применения стимулов депрессии в сочетании с 28-дневной изоляцией ко всем крысам, за исключением контрольной группы. Содержат этих крыс в индивидуальных клетках. В таблице 2 приведены состояния, связанные с депрессивными стимулами.
   2. Для выполнения метода хвостового зажима необходимо закрепить хвост крысы из группы MOD, зажав хвост стандартной скрепкой на расстоянии 1-2 см от корня хвоста крысы. Измерьте время зажима в течение 1 минуты (n = 12).
   3. При методе лишения воды не дайте воде крысе группы MOD, вынув у нее бутылку с водой, и заведите рекорд в течение 24 часов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Время начала отвержения воды было записано таким образом, чтобы можно было точно рассчитать время окончания; Наблюдалось поведение крыс в этот период, включая активность, аппетит и психическое состояние.
   4. При методе лишения пищи откажите от пищи крысе группы MOD и зарегистрируйте ее в течение 24 часов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Запишите время, когда начинается лишение пищи, чтобы можно было точно рассчитать время окончания; следить за тем, чтобы крысы получали достаточную гидратацию в этот период; и наблюдать за поведением крыс в этот период, включая активность и психическое состояние и т.д.
   5. Для холодной стимуляции при 4 °C поместите крысу из группы MOD в ведро с холодной водой и запишите в течение 5 минут. Следите за тем, чтобы температура воды оставалась постоянной на протяжении всего испытания. По завершении эксперимента высушите крысу с помощью воздуходувки и верните ее в исходную клетку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживайте температуру холодной воды на уровне 4 °C с помощью термометра и кубиков льда для регулирования температуры воды при ее повышении. Воду следует регулярно менять, чтобы обеспечить чистоту воды и постоянную температуру. При плавании в холодную воду должны быть погружены все конечности и туловища крыс, кроме головы. Глубина воды должна быть больше длины тела крысы, чтобы крыса не выпрыгнула из воды из-за контакта со дном ведра.
   6. Чтобы вызвать тепловой стресс при температуре 45 °C, поместите крысу группы MOD в инкубатор и записывайте в течение 5 минут, следя за тем, чтобы температура оставалась стабильной на протяжении всего теста.
   7. В инверсии цикла свет-темнота оберните клетку черной тканью на 1 ч, чтобы имитировать дневную темноту. Затем освещайте клетку в течение 12 часов в течение ночи, чтобы имитировать дневной свет. Запишите поведение крысы, потребление пищи и воды, а также режим сна в течение 24 часов.
   8. Для эксперимента с влажной прокладкой введите 200 мл воды в клетку, содержащую 100 г прокладки. Поместите крысу группы MOD во влажную клетку и записывайте поведение крыс в условиях стресса влажной подстилки, включая активность, аппетит, потребление воды и т. д. Понаблюдайте, есть ли какие-либо отклонения от нормы поведения или неприятные реакции, такие как состояние кожи и шерсти крыс, которые могут быть вызваны влажной подкладкой, и запишите их своевременно для последующего анализа в течение 24 часов. После теста обсушите крысу с помощью воздуходувки и верните ее в клетку со свежей древесной стружкой.
   9. При методе наклона клетки поместите крысу группы MOD в клетку, наклоненную под углом 45° к стене, и ведите запись в течение 24 часов. Используйте конструкцию рамы каркаса клетки, чтобы отрегулировать угол наклона и закрепить каркас на месте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рассчитайте время от начала до конца и понаблюдайте за поведением крыс в период наклона клетки, включая активность, аппетит и психическое состояние, и убедитесь, что угол наклона клетки установлен правильно и остается стабильным, чтобы обеспечить точность и воспроизводимость эксперимента.
   10. Для высокоскоростного встряхивания поместите крысу группы MOD в механический встряхиватель, установленный на 160 об/мин, и записывайте крысу в течение 15 минут. Методы поведенческого тестирования впоследствии используются для оценки успешности создания модели.
   11. После применения стрессоров переместите клетки группы MOD из комнаты CUMS обратно в жилую комнату. В течение 4-недельного периода воздействия стресса поддерживайте группу CON в их домашних клетках, расположенных в помещении для животных.
4. Меры предосторожности во время экспериментов
   1. Перенос клеток группы MOD обратно в общую жилую комнату после применения стрессора в комнате CUMS.
   2. Мониторинг животных при моделировании CUMS
      1. Во время зажимания хвоста животное, скорее всего, будет испытывать трудности из-за наведенной стимуляции. На протяжении всего этого периода непрерывно контролируйте хомут. Если он сместился, приостановите таймер, снова наложите зажим, а затем возобновите таймер на 1 минуту.
      2. Не подвергайте одновременно обездоленность воды и стрессоры от влажного постельного белья.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Избегание одновременного наложения влажной прокладки и лишения воды помогает сохранить целостность эксперимента, снижает количество искажающих переменных и способствует благополучию животных.
      3. Температура тела животного и температура окружающей среды в помещении могут повышать температуру воды во время купания в холодной воде. Поэтому регулируйте, добавляя ледяную воду или кубики льда, чтобы поддерживать постоянную температуру воды.
      4. Наблюдайте за крысами с интервалом в 30 минут во время применения стрессоров, за исключением суточного переключения. Обратите особое внимание на признаки необычного дистресса, такие как дрожь, вялость или отсутствие движения. Если наблюдаются такие симптомы, особенно возможное переохлаждение при температуре 4 °C, купание в холодной воде и мокрая подстилка, немедленно избавьте крысу от стрессора.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Исключите подопытных животных из исследования, если у них есть проблемы со здоровьем, такие как инфекция, тяжелая травма, агрессивное поведение, аномальная подвижность и т. д. Условия для исключения животных из исследования обычно связаны с защитой их здоровья и безопасности при одновременном обеспечении целостности результатов эксперимента.
      5. Проводите ежедневные осмотры на предмет ран или других физических или поведенческих аномалий у каждой крысы. Если наблюдаются какие-либо отклонения от нормы, обратитесь к ветеринарному врачу лаборатории, чтобы определить, следует ли исключить крысу из эксперимента.
      6. Взвешивайте каждую крысу каждые 3 дня. Если животное теряет более 20% от своей основной массы тела перед кормлением, его необходимо исключить из эксперимента.

2. Поведенческие тесты

1. Для начала вводите стимулы депрессии в сочетании с изоляцией на 28 дней всем крысам, за исключением контрольной группы. Разместите крыс в индивидуальных клетках. В таблице 2 приведены конкретные сведения о состояниях депрессивных стимулов.
2. Для испытания в открытом поле разделите черный ящик на 25 квадратных секций равной площади. Установите в коробку систему анализа видеослежения. Поместите крысу в центральную площадь и наблюдайте за ее горизонтальной и вертикальной активностью в течение 5 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Размеры коробки составляют 500 мм x 500 мм x 300 мм. Данные об активности будут собираться с помощью системы видеослежения для оценки тревожного поведения грызунов при воздействии новой среды.
3. Затем подсчитайте количество квадратов, пройденных крысой, используя все лапы, чтобы количественно оценить горизонтальную активность. Подсчитайте случаи стояния и ухода за собой как индикаторы вертикальной активности. После каждого теста дезинфицируйте коробку с использованием 75% спирта, чтобы устранить любые остаточные крысиные запахи для последующих тестов.
4. Затем ангедония оценивается с помощью теста на предпочтение сахарозы. Поместите две бутылки на крышку клетки: бутылка А содержит чистую воду, а бутылка Б содержит 1% раствор сахарозы. Предоставьте крысе свободный доступ к обоим решениям. Взвесьте флаконы до и после употребления, чтобы рассчитать 60-минутную норму сахарозы в дни 0, 7, 14, 21 и 28. Формула следующая:
   Расход сахарозы = × 100%
5. Чтобы измерить пространственную память и способности к обучению, используйте тест Морриса в водном лабиринте. Разделите бассейн на четыре квадранта, пронумеровав их от одного до четырех. Поместите погружную платформу для отдыха на 1 см ниже поверхности воды в третьем квадранте.
6. Вводите молоко в бассейн, чтобы увеличить непрозрачность воды и поддерживать температуру воды примерно 23 °C на протяжении всей экспериментальной процедуры.
7. Разместите каждую крысу в разных квадрантах лабиринта, чтобы дать им 120 секунд на обнаружение скрытой платформы. Крысы должны полагаться на пространственную память и навыки обучения, чтобы запомнить местоположение платформы. Как только они узнают местоположение платформы, они могут плыть прямо к ней. Записывайте время задержки с помощью системы видеослежения за водным лабиринтом Morris.
8. Расположите крысу в фиксированном месте в бассейне. Если субъекту не удается найти скрытую платформу в течение 120 с, запишите задержку как 120 с.
9. Наконец, уберите скрытую платформу, поместите крысу обратно в воду и запишите количество пересечений зоны за период в 120 секунд.

3. Статистический анализ

1. Чтобы оценить значимые различия в биохимических параметрах, используйте односторонний дисперсионный анализ (ANOVA) с последующим апостериорным тестом Дункана. Представьте данные как среднее значение ± стандартной ошибки (SE) и рассматривайте p-значение менее 0,05 как статистически значимое.

Результаты поведенческих тестов в модели депрессии крыс, вызванной CUMS
Чтобы подтвердить эффективность процедуры CUMS для индуцирования поведения, похожего на депрессию, была проведена манипуляционная проверка. Самцы крыс Спрэга-Доули (SD) были случайным образом распределены либо в группу MOD, либо в группу CON на период в 4 недели, как описано в шаге 1.2.3. Впоследствии крыс умерщвляли, а их гиппокампы были полностью препарированы для оценки 5-HT, нейромедиатора, тесно связанного с патофизиологией депрессии10, с использованием иммуноферментного анализа (ИФА)28.

До индукции CUMS не наблюдалось существенных различий между испытуемыми группами в шкале OFT, предпочтении сахарозы или анализе MWM.

После создания модели CUMS односторонний дисперсионный анализ (ANOVA) выявил значительное влияние CUMS на тревожное поведение крыс. В частности, в ОФТ наблюдались значимые различия между группами. Группа MOD показала более низкие вертикальные и горизонтальные баллы по сравнению с группой CON (**P < 0,01; Рисунок 1A, B, E), что позволяет предположить, что процедура CUMS была эффективна в вызывании тревоги.

Впоследствии тест на предпочтение сахарозы (SPT) проводили в течение 5 дней, как описано на шаге 2.4, чтобы оценить, проявлялись ли у крыс признаки ангедонии после воздействия CUMS. Результаты показали отсутствие существенных различий в процентном соотношении сахарозы между группами в 0-й день. Тем не менее, односторонняя ANOVA выявила значительную разницу в потреблении сахарозы между группами на 28-й день. В частности, процент предпочтения сахарозы в группе MOD был ниже, чем в группе CON (**P < 0,01; Рисунок 1C), подтверждающие эффективность протокола CUMS в индуцировании ангедонии.

Односторонняя ANOVA показала, что CUMS значительно влияет на пространственную память и способности к обучению крыс, что было оценено с помощью теста MWM. Задержка для группы MOD для определения местоположения платформы была заметно больше, чем для группы CON (**P < 0,01). С точки зрения времени пересечения, группа MOD пересекала меньше раз, чем группа CON (**P < 0.01; Рисунок 1D, F). Эти результаты подтверждают эффективность протокола CUMS в индуцировании ухудшения памяти у крыс.

Результаты измерения уровня 5-HT в гиппокампе в модели депрессии крыс, вызванной CUMS
Односторонний ANOVA на уровнях 5-HT в гиппокампе показал значимую разницу между группами (**P < 0,01). В группе MOD наблюдалось снижение уровня 5-HT в гиппокампе по сравнению с группой CON (Рисунок 2). Эти результаты свидетельствуют о том, что протокол CUMS эффективно снижает уровень 5-HT в гиппокампе, явление, обычно наблюдаемое при депрессии человека29.

Рисунок 1: Эффекты модели депрессии крыс, вызванной CUMS. (A) Вертикальные баллы теста в открытом поле (OFT). (B) Горизонтальные баллы по результатам теста в открытом поле. (C) Уровни потребления сахарозы (%) в дни 0 и 28. CUMS-индуцированная ангедония и снижение предпочтения сахарозы у крыс. (D) Задержки во времени и числа пересечений зон в тесте MWM. Результаты представлены в виде среднего значения ± SE (n = 12 крыс в группе). **P < 0,01 указывает на значительные изменения в группе модели (MOD) по сравнению с контрольной группой (CON), рассчитанной с помощью одностороннего дисперсионного анализа (ANOVA). (E) Треки OFT для крыс в каждой группе. (F) MWM-треки для каждой группы крыс. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Влияние на уровни 5-HT в мозге в модели депрессии, вызванной CUMS, у крыс. Крысы, подвергшиеся 4-недельному воздействию CUMS, продемонстрировали значительное снижение уровня 5-HT в гиппокампе по сравнению с контрольной группой (CON). Результаты представлены в виде среднего значения ± SE (n = 12 крыс в группе). **P < 0,01 указывает на значительные изменения в группе модели (MOD) по сравнению с группой CON, рассчитанной с помощью одностороннего дисперсионного анализа (ANOVA). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Таблица 1: График хронического непредсказуемого легкого стресса (CUMS). Факторы стресса и сроки проведения индукции CUMS у крыс.

Таблица 2. Девять стрессоров с четырьмя вспомогательными условиями и теория трех гоморов в монгольской медицине. Внутренняя взаимосвязь между девятью стрессорами, теория трех гоморов и четыре вспомогательных состояния в монгольской медицине.

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.