Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Выделение чистых астроцитов и микроглии из спинного мозга взрослой мыши для анализов in vitro и транскриптомных исследований

3.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/65893

⸱

20 октября 2023 г.

 ,  , 
1Department of Anatomy and Cell Biology, The George Washington University School of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

В этом протоколе описывается выделение очищенных астроцитов и микроглии из спинного мозга взрослой мыши, что облегчает последующие применения, такие как анализ РНК и культивирование клеток. Он включает в себя подробные методы и процедуры клеточной диссоциации, предназначенные для повышения качества и выхода изолированных клеток.

Аннотация

Астроциты и микроглия играют ключевую роль в развитии центральной нервной системы, реакциях на травмы и нейродегенеративных заболеваниях. Эти высокодинамичные клетки демонстрируют быструю реакцию на изменения окружающей среды и демонстрируют значительную гетерогенность с точки зрения морфологии, транскрипционных профилей и функций. Несмотря на то, что наше понимание функций глиальных клеток в норме и при болезнях значительно продвинулось, по-прежнему существует потребность в клеточно-специфическом анализе in vitro, проводимом в контексте повреждений или травм, чтобы всесторонне охарактеризовать отдельные клеточные популяции. Изоляция клеток взрослой мыши имеет ряд преимуществ по сравнению с клеточными линиями или новорожденными животными, поскольку позволяет проводить анализ клеток в патологических условиях и в определенные моменты времени. Кроме того, сосредоточение внимания на специфической изоляции спинного мозга, исключая поражение головного мозга, позволяет исследовать патологии спинного мозга, включая экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит, травму спинного мозга и боковой амиотрофический склероз. Этот протокол представляет собой эффективный метод выделения астроцитов и микроглии из спинного мозга взрослой мыши, облегчающий немедленный или будущий анализ с потенциальными приложениями в функциональных, молекулярных или протеомных исследованиях.

Введение

Астроциты и микроглия являются универсальными глиальными клетками, которые играют жизненно важную роль в центральной нервной системе (ЦНС), выполняя такие обязанности, как регуляция функции нейронов, содействие развитию ЦНС, поддержание гематоэнцефалического барьера и участие в других критических процессах 1,2,3,4 . Помимо своей роли в поддержании гомеостаза, эти глиальные клетки также играют ключевую роль в механизмах повреждения и восстановления. Микроглия хорошо известна своими фагоцитарными, воспалительными и миграционными способностями после инсультов или травм 5,6,7. Реакция астроцитов при заболевании столь же разнообразна, включая вклад в воспаление, образование глиальных рубцов и нарушение гематоэнцефалического барьера 8,9. Несмотря на то, что наше понимание пагубной и репаративной роли микроглии и астроцитов в ЦНС выросло, присущая им гетерогенность как в структуре, так и в функциях требует надежных инструментов для их изучения в различных контекстах.

Для получения более глубокого понимания роли микроглии и астроцитов в здоровье и заболевании требуется комбинированный подход исследований in vivo и in vitro . Методы in vivo используют сложные перекрестные помехи между глиальными клетками и нейронами в ЦНС, в то время как методологии in vitro оказываются полезными при оценке функций или ответов отдельных клеток под конкретными стимулами. Каждый метод обладает уникальными преимуществами; Исследования in vitro необходимы для понимания специфической роли этих типов клеток без прямого или косвенного влияния соседних клеток. Кроме того, анализы in vitro с использованием бессмертных клеточных линий имеют определенные преимущества, включая способность к бесконечному размножению, экономическую эффективность и простоту обслуживания. Тем не менее, важно отметить, что первичные клетки более точно имитируют нормальные физиологические реакции по сравнению с клеточными линиями. Эта физиологическая значимость имеет решающее значение в функциональных анализах и транскриптомных анализах.

Одна из проблем при получении первичных клеток, особенно из спинного мозга взрослой мыши, заключается в количестве и жизнеспособности образцов. Спинной мозг взрослого человека, будучи меньше головного мозга и содержащий значительное количество миелина, представляет собой уникальные трудности. Несмотря на то, что существует несколько опубликованных протоколов с подробным описанием выделения чистых, жизнеспособных глиальных клеток из неонатальных животных или головного мозга взрослой мыши 10,11,12,13, эти методики могут не подходить для изучения заболеваний и травм, специфичных для спинного мозга. В этом протоколе мы предлагаем комплексную процедуру эффективного выделения чистой, жизнеспособной микроглии и астроцитов из спинного мозга взрослой мыши, облегчая последующее применение в клеточных культурах и транскриптомных анализах. Этот протокол был успешно использован для изоляции этих клеток от взрослых мышей в возрасте от 10 недель до 5 месяцев, демонстрируя его полезность в различных контекстах, включая исследования с участием мышей с условным нокаутом, реакцию на лекарственные препараты, исследования развития и возрастные модели.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры по уходу за животными и экспериментальные процедуры были проведены после одобрения Комитета по уходу за животными и их использованию в Школе медицины и медицинских наук Университета Джорджа Вашингтона (Вашингтон, округ Колумбия, США; IACUC#2021-004). В исследовании использовались самцы и самки мышей дикого типа C57BL/6J (WT) в возрасте от 10 недель до 5 месяцев, которые были получены от коммерческого поставщика (см. таблицу материалов) и размещены в Университете Джорджа Вашингтона. Обзор рабочего процесса протокола представлен на рисунке 1.

1. Подготовка спинного мозга

  1. Обезболивайте животных препаратом Авертин (12,5 мг/мл 2,2,2-трибромэтанола и 2,5% 2-метил-2-бутанола в стерильной воде) (см. таблицу материалов). Подтвердите отсутствие реакции на пощипывание пальцев ног и хвостов у мышей.
  2. Выполняйте сердечную перфузию с помощью холодного 1x фосфатно-солевого буфера Dulbecco (DPBS) для удаления мононуклеарных клеток периферической крови.
    1. Поместите животное на неглубокий лоток и сделайте боковой разрез, чтобы обнажить плевральную полость. Введите перфузионную иглу 23 G, подключенную к перистальтическому насосу (см. таблицу материалов), в левый желудочек и активируйте помпу. После того, как холодный ДПБС пройдет через сердце, сделайте небольшой разрез в правом предсердии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе предпочтительна более высокая скорость перфузии для повышения жизнеспособности клеток. Кровь должна быть смыта менее чем за 1 минуту. Очищение печени свидетельствует об успешной перфузии.
  3. Обезглавьте животное большими ножницами и удалите позвоночный столб14. Погрузите его в холодный 1x DPBS с Ca2+/Mg2+/0,2% глюкозы в чашке Петри на льду для полоскания тканей.
  4. Начиная с этого момента, убедитесь, что все этапы выполняются в стерильной среде. Используйте гидравлическую экструзию14 для изоляции всего спинного мозга. Используйте иглу 18 G и шприц объемом 10 мл, наполненный холодным 1x DPBS с Ca2+/Mg2+/0,2% глюкозы. Перенесите спинной мозг в чашку Петри, помещенную на пакеты со льдом, содержащие достаточное количество холодного 1x DPBS с Ca2+/Mg2+/0,2% глюкозы, чтобы погрузить всю ткань.
  5. Осторожно удалите мозговые оболочки под микроскопом в ламинарном колпаке. Перенесите спинной мозг в пустую чашку Петри на пакетах со льдом и с помощью хирургического скальпеля с лезвием No 10 разрежьте весь спинной мозг на отрезки по 2-3 мм.

2. Ферментативная диссоциация клеток

  1. Добавьте смесь ферментов 1 и смесь ферментов 2 из коммерчески доступного набора для диссоциации мозга у взрослых в соответствии с протоколом производителя (см. таблицу материалов). Перемешайте ферменты в чашке несколько раз, чтобы обеспечить равномерное покрытие спинного мозга, затем инкубируйте при 37 °C в течение 30 минут. Каждые 5 минут аккуратно встряхивайте чашку, чтобы предотвратить слипание тканей и способствовать равномерному распределению реагентов.
  2. Извлеките чашку из инкубатора и добавьте 350 мкл 0,46 мг/мл ДНКазы I в минимальную эссенциальную среду (МЭМ) (см. таблицу материалов). Перемешайте, аккуратно взбивая.
  3. Добавьте 1 мл холодной сыворотки DMEM/0,5% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и перемешайте, слегка взбалтывая. Сразу же перелейте все содержимое в пробирку объемом 5 мл.

3. Механическая диссоциация клеток

  1. С помощью пипетки P1000 аккуратно растирайте ткань три раза, каждый раз следя за тем, чтобы кусочки ткани вытягивались для дальнейшего диссоциирования ткани. Затем, используя заткнутую стеклянную пипетку Пастера диаметром 9 дюймов, осторожно разотрите еще пять раз, следя за тем, чтобы во время процесса не образовывались пузырьки.
  2. Поместите пробирку объемом 5 мл вертикально и дайте ткани осесть на дне в течение 30 с. После того, как ткань осядет, наберите надосадочную жидкость с помощью пипетки P1000 и пропустите ее через фильтр 30 мкм в коническую пробирку объемом 15 мл.
  3. В ту же пробирку объемом 5 мл с оставшейся тканью добавляют 1 мл холодного ДМЕМ/0,5% FBS. С помощью пипетки Пастера аккуратно разотрите три раза.
  4. Дайте ткани осесть на дне в течение 30 с, затем пропустите надосадочную жидкость через фильтр 30 мкм и соберите ее в ту же пробирку объемом 15 мл, что и раньше. Повторите шаги 3.3 и 3.4 еще раз.
  5. Центрифугируют отфильтрованную клеточную суспензию при 300 x g в течение 10 мин при комнатной температуре (RT). Аккуратно извлеките и выбросьте образовавшуюся надосадочную жидкость с помощью вакуумного аспиратора.

4. Удаление миелина

  1. Удалите миелин с помощью раствора для удаления мусора (DRS), входящего в комплект для диссоциации мозга взрослого человека, в соответствии с протоколом производителя. После удаления мусора добавьте 5 мл холодного DMEM/0,5% FBS к грануле ячейки и осторожно переверните пробирку три раза. Центрифугируйте клеточную суспензию при 300 x g в течение 10 мин при комнатной температуре (RT).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если клетки будут использоваться для исследований in vitro и останутся в культуре, вместо них следует использовать предварительно подогретый DMEM/0,5% FBS.
  2. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 1 мл DPBS/0,5% FBS (холодный для исследований РНК и теплый для анализов in vitro ). Подсчитайте клетки и оцените жизнеспособность с помощью Trypan Blue.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клеточные суспензии нескольких животных могут быть объединены для увеличения концентрации клеток.
  3. Промойте клетки, добавив DPBS/0,5% FBS до общего объема 5 мл. Центрифугу суспензии при 300 х г в течение 10 мин при комнатной температуре и выбросьте надосадочную жидкость с помощью пипетки.

5. Выделение микроглии и астроцитов

  1. Пометьте клетки микрогранулами анти-CD11b или анти-ACSA-2 в соответствии с протоколом производителя (см. таблицу материалов).
  2. Отсортируйте ячейки методом положительного отбора с помощью столбцов MS в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу материалов). После сортировки центрифугируют отсортированные клетки при 300 x g в течение 10 мин и выбрасывают надосадочную жидкость.

6. Гальванические ячейки для анализов in vitro

ПРИМЕЧАНИЕ: Если клетки не будут покрыты плакировкой и будут использоваться сразу для анализа РНК, перейдите к шагу 8.

  1. Ресуспендант клеток в 1 мл теплого ДМЭМ/0,5% FBS. Подсчитайте количество клеток и оцените их жизнеспособность с помощью гемацитометра (см. таблицу материалов).
  2. Отрегулируйте концентрацию клеток до 75 000 клеток на 50 мкл. Добавьте 50 мкл клеточной суспензии к каждому покрытию 11 с поли-L-лизиновым покрытием11 в 24-луночном планшете.
  3. Инкубируют при 37 °C в течение 2 ч, чтобы клетки прилипли к покровному стеклу.
  4. Осторожно добавьте в каждую лунку 450 мкл теплого DMEM/5% FBS/пенициллина-стрептомицина (Pen-Streptoctin, см. таблицу материалов).
  5. Через 3 дня замените половину носителя 250 мкл теплого DMEM/5% FBS/Pen-Strep. Для обслуживания полностью заменяйте носитель 500 мкл теплого DMEM/5% FBS/Pen-Strep каждые 4-5 дней.

7. Иммуногистохимия

ПРИМЕЧАНИЕ: Иммуногистохимический анализ лучше всего проводить не менее чем через 3 дня, когда среда была заменена хотя бы один раз. Это гарантирует, что мусор будет удален, а ячейки полностью прилипнут к покровному стеклу.

  1. Удалите носитель и пометьте клетки антимышиным mAb O4 (1:100) (см. Таблицу материалов) в теплой DMEM/5% FBS/10% обычной козьей сыворотке (NGS) в течение 15 минут при комнатной температуре (RT) или при 37 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пропустите этот шаг и перейдите к шагу 7.3, если ячейки не будут помечены O4.
  2. Аккуратно промойте покровные стекла, трижды окунув их в теплый DMEM/5% FBS. Добавьте козий антимышиный 594 IgM (1:300) (см. таблицу материалов) в теплый DMEM/5% FBS/10% NGS и инкубируйте при RT в течение 15 мин в темноте. Аккуратно прополощите три раза в теплом ДМЕМ/5% FBS.
  3. Зафиксируйте клетки холодной 5%-ной уксусной кислотой/метанолом в течение 15 мин при 4 °C. Промойте три раза 1x PBS, затем пометьте соответствующими антителами: антикроличий GFAP (1:500), антимышиный GFAP (1:500) или антикроличий Iba1 (1:500) в 1% Triton-X100/10% NGS в 1x DPBS (см. Таблицу материалов). Инкубируют в течение 1 ч при РТ.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Храните покровные листы в темноте, если они уже были испачканы O4.
  4. Аккуратно смойте три раза PBS. Метка с соответствующими вторичными антителами: антимышиный 594 IgG (1:500), антикроличий 488 IgG (1:500) (см. таблицу материалов). Инкубируют в течение 30 мин при РТ в темноте.
  5. Аккуратно смойте три раза PBS. Контрокрашивать DAPI (1:1000) в течение 1 мин при RT. Трижды промыть PBS, добавить монтажную среду (см. Таблицу материалов) и установить покровные стекла на предметные стекла.

8. Экстракция РНК

ПРИМЕЧАНИЕ: В идеале должно быть не менее 100 000 клеток, чтобы извлечь достаточное количество РНК для анализа. При необходимости могут быть объединены клетки из 2-3 спинного мозга.

  1. Экстрагируйте РНК с помощью коммерчески доступного набора для выделения РНК в соответствии с протоколом производителя (см. таблицу материалов). Для каждого этапа промывки с помощью буфера для промывки RW1, входящего в комплект, оставляйте ячейки в буфере для стирки еще на 2 минуты.
  2. Удалите всю оставшуюся геномную ДНК с помощью ДНКазы I в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу материалов). Инкубируют с ДНКазой при RT в течение 15 мин, затем промывают буфером RW1.
  3. Для увеличения выхода РНК перед элюированием образцы инкубируют в воде, не содержащей РНКазы, при РТ в течение 10 мин. Оценивают целостность и количество РНК с помощью биоанализатора15 (см. таблицу материалов).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Методы, описанные в этом протоколе, позволяют выделять чистую и жизнеспособную микроглию и астроциты из спинного мозга взрослой мыши, облегчая различные последующие применения, включая функциональные или гистологические анализы in vitro и анализ РНК.

Успешная изоляция для исследований in vitro приведет к непрерывной пролиферации клеток в течение нескольких дней. Взрослые клетки демонстрируют более медленную скорость пролиферации по сравнению с клетками, выделенными от новорож...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Выделение чистых, жизнеспособных первичных клеток имеет первостепенное значение для изучения структуры и функций конкретных типов клеток. У взрослых мышей, особенно в спинном мозге, эта задача представляет значительные трудности, поскольку существующие протоколы часто не адаптированы к спинному мозгу взрослого человека 10,17. Этот протокол представляет собой эффективный и экономичный метод, применимый к различным последующим приложениям, включая клеточные культур...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Благодарности

Мы благодарим Castle Raley из Центра геномики Университета Джорджа Вашингтона за анализ РНК и Q2 Lab Solutions за анализ секвенирования РНК. Эта работа была поддержана Национальным институтом неврологических расстройств и инсульта [грант No F31NS117085] и Исследовательским фондом Вивиан Гилл доктору Роберту Х. Миллеру. Рисунок 1 был создан с помощью BioRender.com.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
2,2,2-трибромэтанолSigma AldrichT48402
24-луночный планшет для культуры тканейAvantor10861-558
2-метил-2-бутанол, 98%Thermo FisherA18304-0F
4',6-диамидино-2-фенилиндол, дигидрохлоридинвитрогенD13061:1000
45% раствор глюкозыCorning25-037-CI
Пробирки с крышками 5 млEppendorf30122305
уксусной кислотойSigma-AdlrichA6283
Набор для диссоциации мозга взрослогоMiltenyi103-107-677
Набор для микрогранул Anti-ACSA2Miltenyi130-097-679
Anti-Iba1Wako019-1974
БиоанализаторAgilent ТехнологииG2939BA
мышей дикого типа C57BL/6J (WT)Jackson Laboratories
CD11b (Microglia) MicroBeadsMiltenyi130-093-634
Celltrics 30 µ m фильтрSysmex Partec04-004-2326
Счетная камера (гемацитометр)Hausser Scientific Co3200
Дезоксирибонуклеаза I из бычьей поджелудочной железыSigma AldrichD4527-40KU
Дистиллированная водаTMO15230001
DMEM/F12Thermo Fisher11320074
DNase для очистки РНКQiagen79254
Фосфатно-солевой буферный раствор ДульбеккоThermo Fisher14040117
фетальная бычья сывороткаThermo FisherA5209401
антитела к GFAP (мышь)Santa Cruzsc-336731:500
GFAP антитела (кролик)DakoZ03341:500
Козий антимышь 594 IgGInvitrogena110321:500
Козий анти-мышь 594 IgMInvitrogena210441:300
Козий анти-кролик 488 IgGInvitrogena110081:500
Iba1 антитело (кролик)Wako019-19741:500
MACS СепараторMiltenyi130-042-303
Насосная система Masterflex C/LThermo Fisher77122-22
MEMCorning15-015-CV
МетанолSigma-Adlrich439193
монтаж MediumVector LaboratoriesH-1000-10
MSКолонки Miltenyi130-042-401
O4 антителаR& DMAB1326
Пенициллин-стрептомицинGibco15070063
Закупоренная 9-дюймовая стеклянная пипеткаПастера VWR14672-412
RNeasy Plus Micro KitQiagen74034
Royal-tek Лезвие хирургического скальпеля No 10Fisher scientific22-079-683
Набор для инфузии малых вен, 23 г x 19 ммKawasumiД3К2-23Г

Ссылки

  1. Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nat Rev Neurosci. 7, 41-53 (2006).
  2. Heithoff, B. P., et al. Astrocytes are necessary for blood-brain barrier maintenance in the adult mouse brain. Glia. 69 (2), 436-472 (2021).
  3. Badimon, A., et al. Negative feedback control of neuronal activity by microglia. Nature. 586, 417-423 (2020).
  4. Yanuck, S. F. Microglial phagocytosis of neurons: diminishing neuronal loss in traumatic, infectious, inflammatory, and autoimmune CNS disorders. Front Psychiatry. 10, 712(2019).
  5. Xu, Y. J., Au, N. P. B., Ma, C. H. E. Functional and phenotypic diversity of microglia: implication for microglia-based therapies for alzheimer’s disease. Front Aging Neurosci. 14, 896852(2022).
  6. Song, S., et al. Microglial-oligodendrocyte interactions in myelination and neurological function recovery after traumatic brain injury. J Neuroinflammation. 19 (1), 246(2022).
  7. Butler, C. A., et al. Microglial phagocytosis of neurons in neurodegeneration, and its regulation. J Neurochem. 158 (3), 621-639 (2021).
  8. Voskuhl, R. R., et al. Reactive astrocytes form scar-like perivascular barriers to leukocytes during adaptive immune inflammation of the CNS. J Neurosci. 29 (37), 11511-11522 (2009).
  9. Bordon, Y. MAFG activity in astrocytes drives CNS inflammation. Nature Reviews Immunology. 20, 205(2020).
  10. Agalave, N. M., Lane, B. T., Mody, P. H., Szabo-Pardi, T. A., Burton, M. D. Isolation, culture, and downstream characterization of primary microglia and astrocytes from adult rodent brain and spinal cord. J Neurosci Methods. 340, 108742(2020).
  11. Kerstetter, A. E., Miller, R. H. Isolation and culture of spinal cord astrocytes. Methods in Molecular Biology. 814, 93-104 (2012).
  12. Hersbach, B. A., Simon, T., Masserdotti, G. Isolation and direct neuronal reprogramming of mouse astrocytes. J Vis Exp. (185), 64175(2022).
  13. Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. J Neuroinflammation. 9, 147(2012).
  14. Richner, M., Jager, S. B., Siupka, P., Vaegter, C. B. Hydraulic extrusion of the spinal cord and isolation of dorsal root ganglia in rodents. J Vis Exp. (119), e55226(2017).
  15. Davies, J., Denyer, T., Hadfield, J. Bioanalyzer chips can be used interchangeably for many analyses of DNA or RNA. Biotechniques. 60 (4), 197-199 (2016).
  16. Ahn, J. J., Islam, Y., Miller, R. H. Cell type specific isolation of primary astrocytes and microglia from adult mouse spinal cord. J Neurosci Methods. 375, 109599(2022).
  17. Pan, J., Wan, J. Methodological comparison of FACS and MACS isolation of enriched microglia and astrocytes from mouse brain. J Immunol Methods. 486, 112834(2020).
  18. Neuschulz, A., et al. A single-cell RNA labeling strategy for measuring stress response upon tissue dissociation. Mol Syst Biol. 19, 11147(2023).
  19. CB, S., et al. One brain-all cells: a comprehensive protocol to isolate all principal cns-resident cell types from brain and spinal cord of adult healthy and EAE mice. Cells. 10 (3), 1-25 (2021).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Выделение астроцитоввыделение микроглииклетки спинного мозгавыделение глиальных клетокмагнитная сепарация клетокферментативная диссоциацияоценка жизнеспособности клетокпатология спинного мозга
Выделение чистых астроцитов и микроглии из спинного мозга взрослой мыши для анализов in vitro и транскриптомных исследований
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.