Методическая статья

Визуализация in vivo спонтанной активности в сенсорной коре новорожденных мышей с разрешением одного нейрона

1.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/65899

⸱

21 ноября 2023 г.

 ,  ,  , 
1Department of Physiology, Graduate School of Medical and Dental Sciences, Kagoshima University, 2Laboratory of Multi-Dimensional Imaging, International Research Center for Medical Sciences (IRCMS), Kumamoto University, 3Graduate School of Medical Sciences, Kumamoto University, 4Cedars-Sinai Medical Center

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Первичные сенсорные области в неокортексе демонстрируют уникальную спонтанную активность во время развития. В этой статье описывается, как визуализировать активность отдельных нейронов и первичных сенсорных областей для анализа синхронной активности, специфичной для конкретных областей, у неонатальных мышей in vivo.

Аннотация

Мозг млекопитающих претерпевает динамические изменения в развитии как на клеточном, так и на сетевом уровнях на протяжении пренатального и постнатального периодов. После открытия многочисленных генов, способствующих этим изменениям в развитии, теперь известно, что нейронная активность также существенно модулирует эти процессы. В развивающейся коре головного мозга нейроны демонстрируют синхронизированные паттерны активности, которые специализированы для каждой первичной сенсорной области. Эти паттерны заметно отличаются от тех, которые наблюдаются в зрелой коре, подчеркивая их роль в регуляции процессов развития, специфичных для данной области. Дефицит нейронной активности во время развития может привести к различным заболеваниям головного мозга. Эти результаты подчеркивают необходимость изучения регуляторных механизмов, лежащих в основе паттернов активности в развитии нейронов. В этой статье обобщен ряд протоколов для визуализации первичных сенсорных областей и нейронной активности у неонатальных мышей, для визуализации активности отдельных нейронов в корковых подполях с помощью двухфотонной микроскопии in vivo, а также для анализа корреляций активности, связанных с подполем. Мы демонстрируем репрезентативные результаты лоскутной синхронной активности в отдельных бочках соматосенсорной коры. Мы также обсудим различные потенциальные применения и некоторые ограничения этого протокола.

Введение

Кора головного мозга содержит несколько сенсорных областей с различными функциями. Эти области получают входные сигналы, поступающие от соответствующих органов чувств, в основном передаваемые через спинной мозг или ствол головного мозга и ретранслируемые через таламус 1,2. Примечательно, что нейроны в каждой первичной сенсорной области демонстрируют уникально синхронизированную активность на ранних стадиях развития, которая также исходит от органов чувств или нижних нервных центров, но существенно отличается от активности, наблюдаемой в зрелой коре головногомозга.

У неонатальных грызунов, например, первичная зрительная область (V1) проявляет волнообразную активность, которая зарождается в сетчатке (волна сетчатки) и распространяется по всему зрительному пути, сохраняя при этом ретинотопию4. Первичная слуховая область (А1) демонстрирует синхронную активность, организованную в полосчатые субобласти, которые соответствуют изочастотным полосам в зрелом мозге. Активность исходит от внутренних волосковых клеток улитки 5,6. Кора ствола головного мозга в первичной соматосенсорной области (S1) демонстрирует лоскутную картину активности, при которой нейроны слоя 4 внутри отдельных бочек, а именно нейроны, реагирующие на отдельные усы, синхронно активируются7. Хотя предполагается, что он происходит из тройничного ганглия, источник активности остается неизвестным7. Следовательно, паттерны неонатальной активности специализированы как в каждой первичной сенсорной области, так и во внутриареальных подобластях. Одновременная визуализация нейронной активности и структуры первичных сенсорных областей может облегчить исследование вклада этих паттернов активности в развитие сенсорных систем.

В этой статье мы обобщили ряд протоколов: (1) визуализировать индивидуальную активность нейронов с помощью разреженной маркировки GCaMP и первичных сенсорных областей с использованием мышей TCA-RFP, экспрессирующих красный флуоресцентный белок в таламокортикальных аксонах7, (2) визуализировать активность на уровне одиночных клеток у неонатальных мышей с помощью двухфотонной микроскопии in vivoи (3) для анализа корреляций активности в коре ствола S1. Репрезентативные результаты показывают лоскутную синхронизированную активность в отдельных бочонках мыши после родового дня (P)6. Несмотря на некоторые ограничения, этот метод может быть использован для хронической визуализации, широкоугольной визуализации в нескольких сенсорных областях и различных экспериментов по манипулированию. Многогранный анализ нейронной активности во время развития обогатит наше понимание механизмов формирования мозговых цепей.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все эксперименты проводились в соответствии с руководящими принципами экспериментов на животных Университета Кумамото и Национального института генетики и были одобрены комитетами по экспериментам на животных.

1. Внутриутробная электропорация (ИУЭ)

  1. Спаривание самцов мышей TCA-RFP на фоне ICR с самками мышей ICR дикого типа. Наблюдайте за вагинальной пробкой, чтобы проверить наличие случки рано утром следующего дня. Понаблюдайте за животом, чтобы проверить беременность через 2 недели.
  2. Приготовьте плазмидный раствор, содержащий 5 нг/мкл TRE-nCre, 1 мкг/мкл CAG-loxP-stop-loxP-GCaMP6s-ires-tTA-WPRE и 0,02 % Trypan Blue в ddH2O для разреженной маркировки нейронов GCaMP с помощью системы Supernova8.
  3. Приготовьте обезболивающий раствор, содержащий 0,5 мг/мл карпрофена и 0,01 мг/мл бупренорфина. Защищайте его от света и храните при комнатной температуре.
  4. На эмбриональный день (E)14 выполните ВМЭ следующим образом. Методы IUE по существу те же, что и в предыдущих отчетах 9,10,11.
    1. Протрите лабораторный стол 70% раствором этанола или глутаральдегида. Стерилизуйте все хирургические инструменты путем автоклавирования. Носите маску и лабораторный халат, чтобы снизить риск заражения мыши.
    2. Подготовьте стеклянные микропипетки с помощью съемника микропипеток. Наберите раствор плазмидной смеси в стеклянную микропипетку с помощью аспираторной трубки.
    3. Вызвать анестезию беременным мышам на уровне Е14 с использованием изофлурана (2,0% на воздухе). Держите мышей под наркозом во время процедуры с изофлураном (1,2% на воздухе). Зажмите палец ноги, чтобы убедиться, что анестезия достаточно глубокая. Используйте офтальмологическую мазь для профилактики сухости глаз.
    4. Продезинфицируйте область живота не менее трех раз, чередуя раунды скраба на основе йода и 70% этанола. Накройте операционную область стерильной простыней. Сделайте разрез по средней линии и обнажите матку на простыне.
    5. Повторите капание теплого физиологического раствора на матку, чтобы предотвратить ее высыхание или охлаждение до закрытия брюшной полости (Шаг 1.4.8).
    6. Вводите плазмидный раствор в одну сторону бокового желудочка эмбрионов поочередно с помощью микропипетки и аспираторной трубки.
    7. С помощью электрода типа щипцов защемите головки эмбриона и подайте квадратные электрические импульсы (40 В, 50 мс) пять раз с интервалом в 1 с с помощью электропоратора.
    8. Вернуть матку в брюшную полость. Нанесите ~3 мл теплого физиологического раствора в полость. Зашиваем перитонеальную оболочку и кожу живота. Вводите обезболивающий раствор в концентрации 10 мкг/г (карпрофен в концентрации 5 мкг/г и бупренорфин в концентрации 0,1 мкг/г) под кожу в задней части шеи.
  5. Поместите мышь в клетку для восстановления на грелку (37 °C), чтобы восстановиться после анестезии. Положите мышь на брюхо, чтобы язык и слюна не захлебнули горло. Держите мышь отдельно от других мышей и следите за ней, пока она не восстановится, чтобы нормально двигаться. Верните мышь в клетку.
  6. После рождения проведите генотипирование для проверки аллеля RFP и усыпьте щенков без аллеля. Этот шаг рекомендуется, особенно если визуализация проводится в течение второй послеродовой недели, когда сигнал TCA-RFP слабый и его трудно проверить на шаге 2.2.7.

2. Хирургия черепных окон

  1. Приготовьте корковый буфер, содержащий 125 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 10 мМ глюкозу, 10 мМ HEPES, 2 мМ CaCl2 и 2 мМ MgSO4 в ddH2O (pH скорректирован до 7,4 с 1 М NaOH)12 до дня операции. Стерилизуйте буфер с помощью вакуумного фильтра.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер можно хранить при температуре 4 °C до 3 месяцев. Необходимый объем составляет 5-10 мл на одного щенка.
  2. Выполните следующие шаги на стр. 3-12. Также смотрите предыдущие отчеты, в которых описывалась эта процедура13,14.
    1. Смешайте 50 мг агарозы с 5 мл буфера коры головного мозга и полностью растворите агарозу путем нагревания. Возьмите немного раствора в пробирку объемом 1,5 мл и поддерживайте ее при температуре 42 °C.
    2. Возьмите немного коркового буфера в коническую пробирку объемом 50 мл и держите ее при комнатной температуре. Возьмите немного физиологического раствора в емкость (например, крышку конической пробирки объемом 50 мл) и держите ее при комнатной температуре.
    3. Приготовьте обезболивающий раствор, содержащий 0,01 мг/мл бупренорфина. Защищайте его от света и храните при комнатной температуре.
    4. Стерилизуйте все хирургические инструменты путем автоклавирования. Продезинфицируйте флуоресцентный стереомикроскоп 70% этанолом.
    5. Используйте испаритель изофлурана, чтобы вызвать анестезию у щенка с изофлураном (2,0% на воздухе). Обратите внимание на щенка и вынимайте его, когда его дыхание немного замедлится.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если анестезия длительная, дыхание щенка может остановиться на несколько секунд. Даже если дыхание щенка возобновится, длительная анестезия может уменьшить мозговой кровоток щенка и вызвать необратимое повреждение мозга.
    6. Продезинфицируйте голову щенка не менее трех раз, чередуя раунды скраба на основе йода и 70% этанола. Поместите щенка на грелку (35 °C) под флуоресцентным стереомикроскопом. Всегда держите щенка под наркозом изофлурана (1,5%-2,5% на воздухе).
    7. Выберите детенышей, экспрессирующих TCA-RFP и GCaMP, наблюдая за флуоресценцией через череп. Усыпляйте щенков, у которых не проявляется и то, и другое.
    8. Удаляйте волосистую часть головы над полушариями головного мозга как можно шире осторожно, чтобы не вызвать кровотечение. Потрите череп стерильным ватным тампоном, смоченным в физрастворе, чтобы удалить соединительную ткань.
    9. После того, как череп высохнет, приклейте надрезанную поверхность кожи головы к черепу тканевым клеем.
    10. Переложите щенка на грелку с температурой 37 °C, чтобы восстановиться после анестезии. Подождите не менее 15 минут, чтобы клей застыл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сделайте паузу на 1 час, прежде чем переходить к следующему шагу. Подготовьте других щенков аналогичным образом, если это необходимо в течение этого времени.
    11. Обезболите щенка изофлураном. Поместите щенка на грелку (37 °C) под флуоресцентным стереомикроскопом под наркозом под наркозом (1,5%-2,5% изофлурана на воздухе).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если анестезия длится дольше, чем время до конечной точки (60 минут), усыпьте щенка путем обезглавливания во время анестезии изофлураном.
    12. Отметьте на черепе место, экспрессирующее GCaMP, стерильным перманентным маркером. Нанесите на место буфер коры головного мозга.
    13. Вставьте уголок лезвия бритвы в череп. Медленно надавливайте на лезвие, чтобы сбрить череп и сделать отверстие. Отщипните пинцетом треснувший череп и удалите его.
    14. Убедитесь, что черепное отверстие успешно выполнено, наблюдая за кровеносными сосудами в отверстии. При возникновении кровотечения быстро промойте отверстие корковым буфером с помощью микропипетки. Повторяйте полоскание до полной остановки кровотечения.
    15. Нанесите каплю коркового буфера на отверстие черепа и поместите на отверстие стерильное круглое покровное стекло диаметром 3 мм. Излишки буфера сотрите нетканым материалом. Подождите, пока область вокруг стекла высохнет.
    16. Нанесите теплый раствор агарозы по краю стекла с помощью микропипетки. Поскольку слишком большое количество агарозы может снизить флуоресцентные сигналы, удалите излишки раствора под стеклом, осторожно надавливая на стекло сверху.
    17. Удалите агарозу на стекле или в отдалении от края стекла с помощью пинцета. Агарозу оставьте только по периметру внешнего стекла.
    18. Подождите, пока агароза застынет. Если агарозная усадка создает пространство под стеклом, добавьте раствор агарозы сбоку, чтобы покрыть весь край стекла. Удалите любую жидкость с поверхности черепа с помощью нетканого материала.
    19. Смешайте порошок акриловой смолы и жидкость в резиновой емкости. Отсадите смесь с помощью микропипетки и залейте ее, чтобы покрыть смолой агарозу, окружающую стеклянный край.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку смола затвердевает вскоре после смешивания порошка и жидкости, их необходимо многократно перемешать перед нанесением. Количество, необходимое для каждого смешивания, составляет ~500 μL для жидкости и ~0,15 г для порошка.
    20. Закрепите титановый брусок со смолой на контралатеральной полусфере. Угол стержня должен быть параллельен покровному стеклу. Зафиксируйте смолой всю поверхность черепа.
    21. Вводите обезболивающий раствор в концентрации 10 л/г (бупренорфин в концентрации 0,1 мкг/г веса) под кожу на задней части шеи. Верните щенка к грелке при температуре 37 °C для восстановления после анестезии. Подождите >60 минут, чтобы смола застыла, прежде чем делать вывод.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сделайте паузу на 1-5 часов перед визуализацией. В течение этого времени проводите операции на других щенках аналогичным образом.

3. Двухфотонная визуализация кальция

  1. Прикрепите двухосевой угломеритель с титановой пластиной к пластине предметного стола с расположением XY под микроскопом. Установите на сцене грелку (35 °C).
  2. Включите программу сканирования со следующими условиями: Пиксели, 512 x 512; Двунаправленный, ВКЛ; Усреднение, нет; Область визуализации, 600 x 600 μм с 20-кратным объективом. Установите настройки так, чтобы частота сканирования была выше 1 Гц.
  3. Поместите щенка на грелку, а титановый стержень закрепите на титановой пластине винтами. Держите щенка под наркозом, поместив трубочный порт для изофлурана (1,5-2,0% на воздухе).
  4. Отрегулируйте угол наклона окна по горизонтали с помощью угломера. Включите подсветку и наблюдайте за поверхностью мозга с помощью объектива с 5-кратным увеличением, а затем выберите область изображения по оси XY.
  5. Нанесите глазные капли на черепное окно. Переключите объектив на 20-кратную линзу с водяным погружением. Понаблюдайте за поверхностью коры головного мозга, чтобы убедиться, что на поверхности мозга виден кровоток.
  6. Выключите подсветку и сканируйте поверхность мозга в однофотонном режиме. Увеличьте мощность лазера, чтобы сделать видимой зеленую автофлуоресценцию стекла и поверхности мозга.
  7. Снизьте концентрацию изофлурана до 1,0%-1,5%. Накройте микроскоп крышкой, чтобы избежать утечки света. Переключите программное обеспечение сканирования в двухфотонный режим.
  8. Отрегулируйте мощность лазера и коэффициент усиления детектора, подходящие для сканирования сигналов GCaMP и RFP. Найдите глубину, на которой видны сигналы TCA-RFP. Убедитесь, что глубина слоя 4, ~300 мкм ниже, чем поверхность мозга в точке P6. Выберите область визуализации, в которой видно много GCaMP-экспрессирующих нейронов.
  9. Запуск таймлапс-визуализации сигналов GCaMP и RFP. Если двухканальное одновременное сканирование неприменимо, захватите изображения GCaMP и TCA-RFP перед созданием изображения.
  10. Прекратите прием изофлурана для ослабления анестезии и наблюдайте за спонтанной активностью в течение ~20 минут. Следите за движениями щенка во время съемки с помощью инфракрасной камеры. Немедленно возобновите анестезию изофлураном (2% на воздухе) при возникновении какой-либо реакции, указывающей на дистресс.
  11. После того как щенок перестанет двигаться, повторите визуализацию, полученную в шаге 3.9. При необходимости измените область изображения.
  12. Усыпьте щенка с помощью передозировки изофлурана. Фиксация головного мозга путем транскардиальной перфузии физиологического раствора и 4% PFA с последующей фиксацией в 4% PFA в течение ночи для приготовления тангенциальных срезов и выполнения иммуногистохимии. В противном случае усыпьте щенка с помощью передозировки анестетика с последующей обезглавливанием.
  13. Если у матери нет других детенышей, усыпьте мышь-мать с помощью передозировки анестетика с последующим вывихом шейки матки.

4. Анализ

  1. Запустите MATLAB и запустите EZcalcium toolbox15, чтобы открыть графический интерфейс пользователя (GUI) 'Initial GUI'.
  2. Компенсируйте смещение кадра изображения из-за движений мыши или по другим причинам.
    1. Нажмите «Коррекция движения » в исходном графическом интерфейсе, чтобы открыть графический интерфейс «Коррекция движения». Нажмите «Добавить файлы...», чтобы загрузить файл TIF с данными изображения.
    2. Установите следующие настройки: Коррекция нежесткого движения, пусто; Повышающий коэффициент дискретизации, 50; Макс Шифт, 15 лет; Начальный размер партии, 200; Ширина бункера, 200. Нажмите «Запустить коррекцию движения», чтобы выполнить коррекцию. Данные изображения с коррекцией движения будут сохранены автоматически.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Настройки должны быть отрегулированы в соответствии со свойствами данных изображения. Если дрейф некоторых кадров не компенсируется из-за нелинейных искажений кадров или движения коры головного мозга в направлении глубины, откройте исходные данные изображения без коррекции в ImageJ Fiji и удалите кадры, а затем перезапустите шаг 4.2.
  3. Обнаруживайте нейроны и рисуйте области интереса (ROI).
    1. Нажмите «Автоматическое определение ROI » в начальном графическом интерфейсе, чтобы открыть графический интерфейс «Обнаружение ROI». Нажмите кнопку «Добавить файлы...», чтобы загрузить данные изображения с коррекцией движения.
    2. Установите следующие настройки: Инициализация, Жадность; метод поиска, эллипс; Деконволюция, ограниченный FOOPSI-SPGL1; Авторегрессия, Распад; Предполагаемый # ROI, 60 (рекомендуется более чем в два раза больше визуально обнаруженного числа); Предполагаемая ширина ROI, 17 (~20 μм); порог слияния, 0,95; фактор помадки, 0,95; Пространственное понижение дискретизации, 1; Временная даунсэмплинг, 1; Временные итерации, 5.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Настройки должны быть отрегулированы в соответствии со свойствами данных изображения.
    3. Нажмите кнопку Run ROI Detection, чтобы выполнить обнаружение. Данные ROI будут сохранены автоматически.
    4. Нажмите кнопку ROI Refinement в начальном графическом интерфейсе, чтобы открыть графический интерфейс ROI Refinement. Нажмите кнопку Загрузить данные , чтобы загрузить данные ROI. Выберите ROI, которые имели низкую частоту активности (<1 Гц), располагались под черепом или содержали невриты других нейронов. Нажмите кнопку Исключить ROI , чтобы исключить ROI из анализа.
    5. Выберите формат экспорта данных в XLSX и нажмите кнопку Экспорт данных , чтобы получить файл Excel с необработанными значениями dF/F. dF/F использует уравнение (1), где F — средняя интенсивность пикселей в каждом кадре, F0 — интенсивность сигнала на базовой линии, а Fb — фоновая флуоресценция.
      figure-protocol-1(1)
  4. Рассчитаем коэффициент корреляции Пирсона dF/F между ROI и построим матрицу коэффициентов корреляции. Используйте dF/F только после ослабления анестезии и начала возникать спонтанная активность (~10 минут после прекращения приема изофлурана).
  5. Определите кромки ствола на изображении TCA-RFP с помощью Fiji. Классифицируйте ROI по соответствующим бочкам или перегородкам. Сравните попарную корреляцию в пределах одной бочки и корреляцию между разными бочками.
  6. Генерируйте от 1 000 до 10 000 суррогатных данных, случайным образом перетасовывая соответствие между ROI и трассировками Ca2+ . Рассчитайте средний коэффициент корреляции в пределах отдельных баррелей в каждом суррогатном данных и оцените статистическую значимость корреляции в реальных данных.
    Примечание: Если один из 10 000 суррогатов имеет значение выше действительного, статистическая значимость равна 0,0001. Анализы, описанные на шагах 4.5 и 4.6, могут быть проведены для объединенных данных от нескольких животных, как это было выполнено в других разделах 7,16.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

На рисунке 1 представлены репрезентативные результаты активности нейронов 4-го слоя в коре головного мозга щенка P6, визуализированные с использованием настоящего протокола. Двухфотонные изображения зеленого канала (GCaMP) и красного канала (TCA-RFP) были усреднены по времени и показаны на рисунке 1A. Поскольку флуоресценция TCA-RFP была намного слабее, чем флуоресценция GCaMP, сигнал GCaMP просачивался в красный канал (рис. 1A1,A2<...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Учитывая, что спонтанные действия исходят из органа чувств или низшей нервной системы и перемещаются в первичную сенсорную область попути, эквивалентному пути зрелой нервной системы, крайне важно определить первичную сенсорную область и расположение визуализируемых нейронов в этой области. В этом протоколе мы удовлетворили это требование, используя трансгенных мышей, которые визуализируют таламокортикальные аксоны, и систему Supernova, которая экспрессирует GCaMP ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конкурирующих финансовых интересов, о которых они могли бы заявить.

Благодарности

Эта работа была поддержана Японским обществом содействия научным грантам в помощь для трансформационных областей исследований (B) (22H05092, 22H05094) и грантами на научные исследования 20K06876, AMED под номером гранта 21wm0525015, Научным фондом Такеда, Фондом Найто, Мемориальным фондом бионауки Като, Фондом науки о жизни Кова, NIG-JOINT (24A2021) (Х.М.); и Японское общество содействия научным грантам на научные исследования 19K06887 и 22K06446, Мемориальный фонд медицинских исследований Кодама, Мемориальный фонд Уэхара, Мемориальный фонд бионауки Като и Научный фонд Такэда (N.N-T.). Мы благодарим доктора Такудзи Ивасато за мышей TCA-RFP.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
20-кратный объектив (погружение в воду)
250 мл вакуумный фильтр/система хранения бутылокCorning431096
4% буферный раствор параформальдегидфосфата (4% PFA)Nacalai09154-85
Акриловая смола (UNIFAST II)GCN/A
AgaroseSigmaA9793
Трубка аспиратора в сбореDrummond2-040-000
CaCl2• 2H2ONacalai06731-05
ЭлектропораторBEXGEB14
Глазные капли (Scopisol)Senju PharmaceuticalN/A
Флуоресцентный стереомикроскопLeicaM165FC
GlucoseNacalai16806-25
ГрелкаMuromachi KikaiFHC-HPS
HEPESGibco15630-080
ИзофлуранPfizerн/д
28514-75
MgSO4• 7H2OWako131-00405
Съемник микропипетокNarishigePC-100
Многофотонный лазерSpectra-PhysicsMai Tai eHP DeepSee
Многофотонный микроскопZeissLSM 7MP
NaClNacalai31320-05
Нетканый материал (Kimwipe)Kimberly ClarkS-200
Фосфатный буферный раствор (PBS)Nacalai27575-31
Плазмида: CAG-loxP-STOP-loxP-GCaMP6s-ires-tTA-WPREAddgenepK175
Плазмида: TRE-nCreAddgenepK031
Прецизионно откалиброванная микропипеткаDrummond2-000-050
Бритвенное лезвиеFeatherFA-10
Римадил (50 мг/мл карпрофена)Zoetis JPN/A
Круглое защитное стекло, диаметр 3 мм МацунамиCS01078
Физиологический растворОцука035175315
Пентобарбитал натрияNacalai26427-72
Столик для визуализации живого щенка (два одноосевых столика для позиционирования XY, двухосевой угломер, опорная пластина, регулируемая стойка для позиционирования по оси Z)ThorLabsLT1/M, GN2/M, BM2060/M, MLP01/M
TCA-RFP мышьН/ДN/ AMizuno et al., 2018a
Тканевый клей (Vetbond)3M1469SB
Титановый стерженьEndo Scientific InstrumentN/ACustom made (Mizuno et al., 2018b)
Титановая планка крепежная пластинаN/ACustom made (Mizuno et al., 2018b)
Трипановый синийПинцет SigmaT8154
с электродом из платиновой пластины, диаметр 5 ммBEXCUY650P5
Мышь ICR дикого типаNihon SLCSlc:ICR
KCl Nacalai

Ссылки

  1. Rao, M. S., Mizuno, H. Elucidating mechanisms of neuronal circuit formation in layer 4 of the somatosensory cortex via intravital imaging. Neuroscience Research. 167, 47-53 (2021).
  2. Iwasato, T., Erzurumlu, R. S. Development of tactile sensory circuits in the CNS. Current Opinion in Neurobiology. 53, 66-75 (2018).
  3. Martini, F. J., Guillamón-Vivancos, T., Moreno-Juan, V., Valdeolmillos, M., López-Bendito, G. Spontaneous activity in developing thalamic and cortical sensory networks. Neuron. 109 (16), 2519-2534 (2021).
  4. Ackman, J. B., Burbridge, T. J., Crair, M. C. Retinal waves coordinate patterned activity throughout the developing visual system. Nature. 490 (7419), 219-225 (2012).
  5. Tritsch, N. X., Yi, E., Gale, J. E., Glowatzki, E., Bergles, D. E. The origin of spontaneous activity in the developing auditory system. Nature. 450 (7166), 50-55 (2007).
  6. Babola, T. A., et al. Homeostatic control of spontaneous activity in the developing auditory system. Neuron. 99 (3), 511-524.e5 (2018).
  7. Mizuno, H., et al. Patchwork-type spontaneous activity in neonatal barrel cortex layer 4 transmitted via thalamocortical projections. Cell Reports. 22 (1), 123-135 (2018).
  8. Mizuno, H., et al. NMDAR-regulated dynamics of layer 4 neuronal dendrites during thalamocortical reorganization in neonates. Neuron. 82 (2), 365-379 (2014).
  9. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
  10. Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294 (5544), 1071-1074 (2001).
  11. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental Biology. 240 (1), 237-246 (2001).
  12. Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).
  13. Mizuno, H., Nakazawa, S., Iwasato, T. In vivo two-photon imaging of cortical neurons in neonatal mice. Journal of Visualized Experiments. 140, e58340(2018).
  14. Egashira, T., et al. In vivo two-photon calcium imaging of cortical neurons in neonatal mice. STAR Protocols. 4 (2), 102245(2023).
  15. Cantu, D. A., et al. EZcalcium: Open-source toolbox for analysis of calcium imaging data. Frontiers in Neural Circuits. 14, 25(2020).
  16. Maruoka, H., et al. Lattice system of functionally distinct cell types in the neocortex. Science. 358 (6363), 610-615 (2017).
  17. Antón-Bolaños, N., et al. Prenatal activity from thalamic neurons governs the emergence of functional cortical maps in mice. Science. 364 (6444), 987-990 (2019).
  18. Guillamón-Vivancos, T., et al. Input-dependent segregation of visual and somatosensory circuits in the mouse superior colliculus. Science. 377 (6608), 845-850 (2022).
  19. Cardin, J. A., Crair, M. C., Higley, M. J. Mesoscopic imaging: Shining a wide light on large-scale neural dynamics. Neuron. 108 (1), 33-43 (2020).
  20. Chen, J. L., Voigt, F. F., Javadzadeh, M., Krueppel, R., Helmchen, F. Long-range population dynamics of anatomically defined neocortical networks. eLife. 5, e14679(2016).
  21. Ota, K., et al. cell-resolution, contiguous-wide two-photon imaging to reveal functional network architectures across multi-modal cortical areas. Neuron. 109 (11), 1810-1824 (2021).
  22. Zariwala, H. A., et al. A Cre-dependent GCaMP3 reporter mouse for neuronal imaging in vivo. The Journal of Neuroscience. 32 (9), 3131-3141 (2012).
  23. Murakami, T., Matsui, T., Uemura, M., Ohki, K. Modular strategy for development of the hierarchical visual network in mice. Nature. 608 (7923), 578-585 (2022).
  24. Pnevmatikakis, E. A., et al. Simultaneous denoising, deconvolution, and demixing of Calcium imaging data. Neuron. 89 (2), 285-299 (2016).
  25. Shemesh, O. A., et al. Precision calcium imaging of dense neural populations via a cell-body-targeted calcium indicator. Neuron. 107 (3), 470-486 (2020).
  26. Giovannucci, A., et al. CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis. Elife. 8, e38173(2019).
  27. Pachitariu, M., et al. Suite2p: beyond 10,000 neurons with standard two-photon microscopy. BioRxiv. , (2017).
  28. Sitdikova, G., et al. Isoflurane suppresses early cortical activity. Annals of Clinical and Translational Neurology. 1 (1), 15-26 (2014).
  29. Marques-Smith, A., et al. A Transient translaminar GABAergic interneuron circuit connects thalamocortical recipient layers in neonatal somatosensory cortex. Neuron. 89 (3), 536-549 (2016).
  30. Tuncdemir, S. N., et al. Early somatostatin interneuron connectivity mediates the maturation of deep layer cortical circuits. Neuron. 89 (3), 521-535 (2016).
  31. Nakazawa, S., Yoshimura, Y., Takagi, M., Mizuno, H., Iwasato, T. Developmental phase transitions in spatial organization of spontaneous activity in postnatal barrel cortex layer 4. The Journal of Neuroscience. 40 (40), 7637-7650 (2020).
  32. Yu, Y. -C., et al. Preferential electrical coupling regulates neocortical lineage-dependent microcircuit assembly. Nature. 486 (7401), 113-117 (2012).
  33. Siegel, F., Heimel, J. A., Peters, J., Lohmann, C. Peripheral and central inputs shape network dynamics in the developing visual cortex in vivo. Current Biology. 22 (3), 253-258 (2012).
  34. Nakagawa, N., Hosoya, T. Slow dynamics in microcolumnar gap junction network of developing neocortical pyramidal neurons. Neuroscience. 406, 554-554 (2019).
  35. Valiullina, F., et al. Developmental changes in electrophysiological properties and a transition from electrical to chemical coupling between excitatory layer 4 neurons in the rat barrel cortex. Frontiers in Neural Circuits. 10, 1(2016).
  36. Avitan, L., et al. Spontaneous and evoked activity patterns diverge over development. Elife. 10, e61942(2021).
  37. Mölter, J., Avitan, L., Goodhill, G. J. Detecting neural assemblies in calcium imaging data. BMC Biology. 16 (1), 143(2018).
  38. Nakazawa, S., Mizuno, H., Iwasato, T. Differential dynamics of cortical neuron dendritic trees revealed by long-term in vivo imaging in neonates. Nature Communications. 9 (1), 3106(2018).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

GCaMPROI

Похожие статьи