Методическая статья

Анализ нейронных связей между кишечником и мозгом в реальном времени: динамика кальция в всей коре головного мозга в ответ на стимуляцию кишечника глюкозой

1.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/65902

⸱

29 декабря 2023 г.

 , 
1Department of Biology, Faculty of Science, Ochanomizu University

В этой статье

Краткое содержание

Коммуникация между кишечником и мозгом, облегченная блуждающим нервом, имеет решающее значение для связи между желудочно-кишечной эндокринной системой и мозгом. Тем не менее, может ли внутрижелудочная инъекция глюкозы изменить активность коры головного мозга, до сих пор не изучено. Здесь мы предлагаем комплексный протокол наблюдения за изменениями активности коры головного мозга после введения глюкозы в двенадцатиперстную кишку.

Аннотация

Связь между желудочно-кишечным трактом и мозгом после усвоения питательных веществ играет важную роль в пищевых предпочтениях, метаболизме и пищевом поведении. В частности, что касается конкретных питательных веществ, многие исследования выяснили, что ассимиляция глюкозы в эпителиальных клетках кишечника провоцирует активацию многих сигнальных молекул. Такие гормоны, как глюкагоноподобный пептид-1, известны как квинтэссенция сигнальных медиаторов. Поскольку гормоны преимущественно влияют на мозг через циркуляторные пути, они медленно модулируют мозговую активность.

Тем не менее, недавние исследования показали два быстрых пути кишечник-мозг, которым способствует вегетативная нервная система. Один из них действует через спинномозговой афферентный нервный путь, в то время как блуждающий нерв опосредует другой. Следовательно, реакции мозга после усвоения глюкозы в желудочно-кишечном тракте усложняются. Более того, поскольку стимуляция кишечника в конечном итоге вызывает различные активности коры головного мозга, включая сенсорные, ноцицептивные, реакции на вознаграждение и двигательные реакции, необходимо использовать методологии, которые облегчают визуализацию локализованных мозговых цепей и панкорковой активности, чтобы полностью понять нейронную передачу между кишечником и мозгом. Некоторые исследования показали резкие изменения концентрации ионов кальция (Ca2+) в гипоталамусе и вентральной тегментальной области независимо друг от друга через различные пути после стимуляции кишечника. Однако о том, происходят ли изменения в активности коры головного мозга, не известно.

Для наблюдения за активностью коры головного мозга после внутрижелудочного введения глюкозы мы разработали метод визуализации для визуализации динамикиCa2+ в коре головного мозга в режиме реального времени через полностью интактный череп с использованием трансгенных мышей, экспрессирующих генетически закодированные показателиCa2+ . В этом исследовании представлен комплексный протокол для метода, предназначенного для мониторинга визуализации широкого Ca2+ коры головного мозга, вызванной стимуляцией кишечника, после внутрижелудочного введения глюкозы через имплантированный катетер. Предварительные данные свидетельствуют о том, что введение раствора глюкозы в кишечник активирует лобную кору, которая остается невосприимчивой к введению воды.

Введение

В первую очередь, восприятие глюкозы в кишечнике происходит через рецепторы сладкого вкуса (Tas1r2, Tas1r3) и натрий-глюкозный котранспортер 1 (SGLT-1), расположенные в энтероэндокринных клетках в просвете кишечника 1,2,3,4,5,6. Ощущение глюкозы в мозге — это процесс, который обычно длится от нескольких минут до нескольких часов после ее всасывания из кишечника, в основном из-за повышенного уровня сахара в плазме крови и высвобождения гормонов 7,8,9,10,11 (например, глюкагоноподобного пептида-1 [GLP-1], пептида YY (PYY) и глюкозозависимого инсулинотропного полипептида [GIP]). Они достигают дугообразного ядра гипоталамуса (ARC), где связывают нейроны проопиомеланокортина (POMC) и нейроны, связанные с агути (AgRP), посредством кровотока и блуждающего нерва (парасимпатического нерва)12,13,14. Изменение активности этих нейронов приводит к контролю метаболизма и пищевого поведения15,16.

В современной литературе все чаще подчеркивается важность нейронной сигнализации кишечника и мозга после всасывания глюкозы. Этот сложный путь можно в целом разделить на два основных механизма. Первый включает в себя активацию спинальных афферентов, что в конечном итоге влияет на активность нейронов AgRP в ARC. Второй механизм заключается в стимуляции блуждающего нерва за счет связей с эпителиальными клетками. Учитывая многогранность способов, с помощью которых эпителиальные клетки кишечника могут активировать блуждающий нерв13, его роль считается универсальной.

Значительная часть активности кишечного блуждающего нерва и спинномозгового афферентного нерва связана с пищевым поведением 17,18,19. Тем не менее, новые данные свидетельствуют о том, что определенные волокна блуждающего нерва, проецируемые на «клетки нейропода», участвуют в предпочтении глюкозы. Нейроподные клетки, подмножество энтероэндокринных клеток, экспрессируют SGLT-1 на своей люминальной стороне и передают сенсорные стимулы блуждающему нерву через глутаматергические синапсы 2,20,21,22. Активация блуждающего нерва запускает дофаминергические нейроны в вентральной тегментальной области (ВТА) в течение19 секунд. Примечательно, что ингибирование активации блуждающего нерва, особенно в двенадцатиперстной кишке, с использованием антагониста глутамата снижает предпочтение сахарозы у мышей1. Это подчеркивает критическую роль активации клеток нейропода в модулировании поведения при выборе пищи после приема глюкозы2.

Несмотря на эти достижения, глубокое понимание механизмов быстрого восприятия глюкозы в кишечнике и их влияния на активность коры головного мозга остается сложной загадкой. Хотя активация мозга, контролируемая нейронами AgRP, не включает в себя кору головного мозга23, известно, что дофаминергические нейроны в VTA проецируются в кору головного мозга. Тем не менее, неизвестно, действительно ли быстрая активация дофаминергических нейронов VTA после определения уровня глюкозы активирует кору головного мозга. Чтобы выяснить этот механизм, мы исследовали возможность быстрого влияния внутрижелудочного введения глюкозы на динамику CorticalCa2+ у трансгенных мышей, экспрессирующих генетически кодируемый показатель кальция.

В этой статье представлен недорогой и менее инвазивный метод всестороннего понимания изменений активности коры головного мозга после внутрижелудочного введения глюкозы с использованием визуализацииCa2+ в широкой коре головного мозга у мышей В последнее время набирает популярность метод визуализации Ca2+ в широкой коре головного мозга через интактный череп с использованием трансгенных мышей, экспрессирующих генетически кодируемые показатели кальция24. Примечательно, что трансгенная линия мышей BAC GLT-1-G-CaMP7 #817 (также известная как мышь G7NG817), используемая в этом исследовании, экспрессирует сенсор Ca2+ , G-CaMP7, в нейронах и астроцитах25. Благодаря высокой плотности экспрессии в коре головного мозга эта трансгенная линия мышей особенно подходит для визуализации широкого Ca2+ транскраниальной коры головного мозга с помощью стандартного эпифлуоресцентного микроскопа.

Протокол

Все протоколы экспериментов были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию Университета Отяномидзу, Япония (протоколы исследований на животных 22017 года). Все эксперименты на животных проводились в соответствии с Руководством по проведению экспериментов на животных Университета Отяномидзу, которое соответствует Фундаментальным рекомендациям по надлежащему проведению экспериментов на животных и связанной с ними деятельности в академических научно-исследовательских учреждениях (Министерство образования, культуры, спорта, науки и техники, Япония). Были предприняты усилия для минимизации количества используемых животных. Данное исследование проводилось в соответствии с рекомендациями ARRIVE.

1. Подготовка трансгенных мышей

  1. Для проведения данного эксперимента использовали взрослых самцов и самок BAC трансгенной линии BAC GLT-1-G-CaMP7 #817, а именно G7NG817 мышей24,25 (старше 8 недель). Фоновой штамм G7NG817 мышей25 — C57BL/6J.
  2. Поместите мышей в 12-часовой цикл свет/темнота и выращивайте их в группы до пяти мышей.

2. Создание катетера

  1. С помощью ножниц отрегулируйте силиконовую трубку (внутренний диаметр 0,5 мм, внешний диаметр 1,0 мм) до точной длины 7 см (рисунок 1A-a).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перед процедурами ножницы и силиконовая трубка были стерилизованы.
  2. Приклейте миниатюрные пластиковые шарики (внутренний диаметр 3 мм, внешний диаметр 5 мм) к изготовленной трубке, следя за тем, чтобы они располагались на расстоянии 3 мм от ее конца (рис. 1A-b). Надежно закрепите бусины с помощью цианоакрилатного клея (допустимы медицинские или стандартные варианты).
  3. Вырежьте верхушку иглы 23 G и затем отрежьте 1,5 см от кончика иглы (Рисунок 1A-c).
  4. Введите секционную иглу 23 G из шага 2.3 в конец силиконовой трубки, противоположный месту, где были прикреплены бусины (Рисунок 1A-d).

3. Создание инжектора

  1. С помощью стерильных плоскогубцев иссеките 1 см от кончика иглы (рисунок 1B-a).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что отверстие на отрезанном конце сохраняет свою целостность и не деформируется, так как любое искажение может препятствовать потоку инъекционного раствора.
  2. Соедините адаптированную инъекционную иглу 23 G с шага 3.1.1 со шприцем объемом 2,5 мл (рисунок 1B-b).
  3. Сегментируйте силиконовую трубку до необходимой длины (в этом эксперименте это была силиконовая трубка длиной 15 см) и оболочьте ее над иглой для инъекций 23 G (рис. 1B-c).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Объем выдаваемого раствора будет колебаться в зависимости от длины трубки. Например, при использовании 15-сантиметровой трубки примерно 50 μл раствора будет задерживаться после эксперимента.
  4. Отрежьте иглу для инъекций 23 G на расстоянии 1,5 см от кончика иглы.
  5. Соедините секционную часть из шага 3.4 с силиконовым катетером, изготовленным на шаге 3.3 (рисунок 1B-d).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что отверстия, созданные на этапах 3.1 и 3.4, остаются неискаженными после разреза. Если требуется ректификация, используйте плоскогубцы для восстановления его круглой конфигурации.

4. Локализация желудка

  1. Введение анестезии мыши путем ингаляции с 3,0% изофлураном в указанной камере. Применяйте офтальмологическую мазь для профилактики сухости глаз.
  2. Осторожно перенесите мышь под наркозом из ингаляционной камеры на операционный стол после проверки состояния мыши под наркозом. Обеспечьте тепловую поддержку на протяжении всей процедуры.
  3. Положите мышь на спину, выровняв ее рот близко к ингаляционному аппарату, и модулируйте концентрацию изофлурана от 3,0% до 2,0%.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Отделите нижний сегмент изофлурановой маски от ее верхнего аналога и закрепите отделенную маску (верхний сегмент) на хирургическом столе с помощью клейкой ленты.
  4. Дополните ротовую полость, передние и задние конечности мыши к хирургическому столу с помощью лейкопластыря.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Закрепив мышь на столе, можно предотвратить хирургические ошибки, связанные с движением, даже если мышь находится под наркозом.
  5. Удалите шерсть мыши с верхней левой части живота (150% области вокруг места операции) с помощью крема для депиляции. Нанесите местный анальгетик местно на место операции и подождите 5 минут, прежде чем продолжить.
  6. Нанесите местный обезболивающий гель на кожу живота и подождите от 5 до 10 минут. Затем 3 раза продезинфицируйте операционную область, чередуя циклы йодофора и 70% этанола. Подтвердите глубину анестезии с помощью щипка для пальцев ног и накройте животное стерильными хирургическими простынями. Сделайте разрез кожи длиной примерно 1,5 см (рисунок 1C-b), расположенный на 1 см справа от срединной области живота и на 5 мм ниже мечевидного отростка (рисунок 1C-c). Затем сделайте разрез 1,5 см в брюшной стенке в том же месте, где был сделан первоначальный разрез кожи.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Соблюдайте осторожность, чтобы не нанести вред основной части печени.
  7. Аккуратно переместите левую печеночную долю в сторону с помощью щипцов с тупым концом, обнажая живот под ней.

5. Введение катетера

  1. Приподнимите живот и осторожно вытащите его через разрез.
    Примечание: Проявляйте крайнюю осторожность для сохранения целостности соседних органов, особенно печени, и воздерживайтесь от чрезмерного воздействия на желудок.
  2. С помощью ножниц создайте миниатюрную перфорацию (примерно 1,5 мм в диаметре) в антральном отделе привратника.
  3. Введите конец катетера в перфорацию, убедившись, что шарик находится в прямом контакте с антральным отделом привратника.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перед введением катетер дезинфицируется раствором глюконата хлоргексидина от 0,1 до 0,5%.
  4. Приклейте бусину катетера к животу с помощью медицинского цианоакрилатного клея.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что желудок не прикреплен к окружающим органам.
  5. Убедитесь в надежном прикреплении катетера к желудку, затем аккуратно переместите желудок в его естественное расположение под левой долей печени.
  6. Сшите брюшную стенку, позволив катетеру расшириться наружу, с помощью полидиоксанонового (PDS) шва. После этого закройте разрез кожи способом, аналогичным закрытию брюшной полости.
  7. Аккуратно переместите мышь в продезинфицированную клетку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Послеоперационные мыши должны содержаться отдельно. Нанесите местный анальгетик местно на закрытие раны и следуйте планам обезболивания в соответствии с рекомендациями местных учреждений.
  8. Минимальный период восстановления составляет 48 часов в стандартной среде.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Один конец катетера, вставленного в желудок мыши, закрывается иглой 23G с герметичным наконечником, чтобы предотвратить попадание инородных веществ и избежать укуса. Поскольку катетер, выступающий из брюшной полости, короткий, он не позволяет мыши протащить его через подстилку, что может привести к его раскрытию или запутыванию.

6. Подготовка к транскраниальной визуализацииCa2+ in vivo

  1. Введение анестезии мышам с использованием изофлурана (индукция в дозе 2%; поддержание в диапазоне от 0,8% до 1,0%).
  2. Закрепите мышь на стереотаксической платформе с помощью вспомогательных ушных накладок, чтобы смягчить последствия пульсации и дыхания. Затем поместите мышь под флуоресцентный стереомикроскоп.
  3. Используйте комплект широкополосных синих флуоресцентных фильтров (с возбуждением на длине волны 460-490 нм и излучением на длине волны 520 нм) в сочетании с ртутным источником света.
  4. Захватывайте изображения с помощью камеры и обрабатывайте их с помощью специального программного обеспечения для обработки изображений.
  5. Аккуратно удалите волосы с кожи головы с помощью электробритвы или крема для эпиляции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если вы используете бритву, убедитесь, что она тщательно продезинфицирована, и будьте осторожны, чтобы не порезать кожу.
  6. Продезинфицируйте поверхность волосистой части головы с помощью ватного тампона или аналогичного средства раствором хлоргексидина глюконата, разведенным до 0,1-0,5%. Далее продезинфицируйте спиртом и повторите этот чередующийся раунд 3 раза.
  7. Нанесите местный обезболивающий гель и подождите 5-10 минут.
  8. Приготовьтесь к нанесению стоматологического акрилового цемента.
    1. Используйте стерильное лезвие скальпеля, чтобы разрезать кожу головы. Либо полностью снимите скальп, либо сделайте прямой разрез от затылка ко лбу.
    2. Используйте зажимы, чтобы обнажить череп, удлинив лишнюю кожу.
    3. С помощью ватного тампона удалите соединительную ткань надкостницы.
    4. Сразу после удаления надкостницы нанесите акриловый цемент. Действуйте быстро, чтобы предотвратить помутнение поверхности черепа из-за испарения из обнаженной кости.
    5. Подождите около 5 минут, пока цемент высохнет.

7. Транскраниальная визуализацияCa2+ с интрадуоденальным введением глюкозы

  1. Уравновесьте как экспериментальный раствор, так и физиологический раствор к температуре окружающей среды. Подвергайте мышей диетическим ограничениям в течение определенного периода времени (например, 2 часа).
  2. Перед началом инъекции удалите все остаточное содержимое в катетере со стороны мыши, используя ~0,03 мл физиологического раствора.
  3. Отасуньте экспериментальный раствор (например, 10% раствор глюкозы, приготовленный в 300 мкл воды, дополненный дополнительными 300 мкл воды) в шприц, затем соедините его с катетером. Определите оптимальную дозировку раствора в соответствии с конкретной целью эксперимента.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Во время этой фазы соблюдайте осторожность, чтобы не допустить чрезмерной нагрузки на катетер, которая может поставить под угрозу внутреннюю анатомию мыши. Постарайтесь манипулировать трубкой со стороны мыши с максимальной осторожностью. Кроме того, убедитесь, что шприц не содержит воздуха после аспирации раствора, так как захваченный воздух и пузырьки могут вызвать вздутие желудочно-кишечного тракта.
  4. Оцените физиологическое состояние мыши и активируйте функцию записи программного обеспечения для обработки изображений, нажав на кнопку процесса записи в программном приложении.
  5. Снимайте изображения с разрешением 512 x 512 пикселей, глубиной цвета 16 бит и частотой кадров 10 Гц.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры записи могут быть отрегулированы в соответствии с конкретными экспериментальными требованиями.
  6. Получите спонтанные данные (например, в течение 50 с) с последующим постепенным вливанием экспериментального раствора со скоростью, адаптированной к эксперименту (в данном случае 0,035 мл/с).
    ПРИМЕЧАНИЕ: В конце эксперимента мышь будет немедленно усыплена путем вывиха шейки матки под анестезией изофлураном.

8. Обработка и анализ данных изображений

  1. Сгруппируйте данные изображения в формат 64 x 64 пикселей.
  2. Определите нарисованные от руки области интереса (ROI) с помощью ImageJ. Обратитесь к атласу мозга мыши, чтобы обозначить ROI как лобная область (M2), соматосенсорная область, включающая бочку (Somato), затылочная область (Visual) и ретроспленальная область (RSC).
  3. Используйте функцию MATLAB ReadImageJROI для извлечения координат, соответствующих ROI. Доступ к функции MATLAB осуществляется по предоставленной ссылке: https://jp.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/32479-readimagejroi
  4. Рассчитайте среднюю скорость изменения интенсивности флуоресценции в пределах ROI с помощью MATLAB.
    1. Определим скорость изменения интенсивности флуоресценции (ΔF/F) с помощью уравнения (1):
      figure-protocol-1(1)
      Где Ft представляет значение интенсивности флуоресценции в определенный момент времени, а среднее значение интенсивности с начала регистрации до 50 с момента инжекции обозначается как F0.
  5. Объясняют задержку поступления инъекционного раствора к органу. В качестве исходного уровня используйте среднее значение интенсивности, охватывающее три секунды после инъекции. Целевые осциллограммы, превышающие базовое значение интенсивности + 1 SD для анализа, если они возникают через 3 с или позже после впрыска.

Результаты

Визуализация широкого Ca2+ в транскраниальной коре головного мозга с помощью G7NG817 мыши, анестезируемой изофлураном
Мы создали катетер в соответствии с процедурой, показанной на рисунке 1. После тщательного определения положения желудка мы прикрепили катетер к этому месту (рисунок 1). После достаточного времени восстановления после введения катетера (примерно 48 ч) мы измерили спонтанную нейронную активность под мягкой изофлурановой анестезией (0,8-1,0%), чтобы установить исходные изменения интенсивности флуоресценции для последующих наблюдений за стимуляцией кишечника. В результате мы подтвердили случайные паттерны колебаний Ca2+ , которые охватили всю кору головного мозга (рис. 2A). На рисунке 2 представлены репрезентативные примеры спонтанной активности мозга с предварительно вставленными катетерами. Время первого наблюдаемого переходного пикаCa2+ в области M2 после инжекции было определено как 0,0 с. В псевдоцветовом представлении пик этого переходного процесса Ca2+ отображается как максимальное значение, а среднее значение плюс одно стандартное отклонение (1 SD) — как минимальное значение. Было ясно, что левое и правое полушария проявляли синхронную активность во всех областях.

Затем мы установили ROI, чтобы охарактеризовать волны в каждой функциональной зоне. Как показано на рисунке 2B, мы представили временные изменения интенсивности флуоресценции для каждого ROI (рисунок 2B). Эти наблюдаемые поверхностные колебания Ca2+ следовали схеме подавления всплесков, чередуясь между периодами низкой активности и высокоамплитудными изменениями флуоресценции. Этот паттерн активности согласуется с предыдущими результатами, которые одновременно измеряли ЭЭГ корковой поверхности и динамику Ca2+ 26.

Несмотря на глобальные или региональные колебания поверхностногоCa2+ между состояниями подавления и всплеска, конкретная область коры головного мозга, инициирующая всплеск кальция, может различаться. Как сообщалось ранее, когда сигнал стимулирует локальную корковую область, ожидается, что эта область активируется, что впоследствии приводит к глобальному сдвигу в корковом состоянии 27,28.

Изменения динамики Са2+ коры головного мозга после внутрижелудочного введения глюкозы
Затем, чтобы выяснить, как введение глюкозы или воды влияет на активность коры головного мозга, мы наблюдали за динамикойCa2+ в коре головного мозга во время и после инъекции. В результате мы обнаружили изменения в динамике Са2+ коры головного мозга после внутрижелудочного введения глюкозы. В отличие от спонтанной активности, проиллюстрированной в различных областях активации коры головного мозга, мы наблюдали немедленную активацию в префронтальной области или вторичной моторной коре (М2) при прямом введении глюкозы в кишечник через катетер, эффект, не вызванный внутрижелудочной инъекцией воды (рис. 3A-C). Более того, мы заметили, что эти преходящие, выраженные событияCa2+ имеют тенденцию происходить непрерывно в течение примерно 10 с после внутрижелудочного введения глюкозы. Такие стойкие явления не были очевидны при введении воды (рисунок 3D-F).

События Ca2+ в каждом ROI характеризовали путем расчета коэффициента изменения интенсивности флуоресценции с использованием слуховой коры (Reference) в качестве эталона, причем первый пик приходился на период 4-8 с после завершения введения глюкозы. В результате, значительное изменение наблюдалось при введении глюкозы после сравнения ответа в области М2 с использованием слуховой коры в качестве эталона до и после инъекции.

Напротив, при введении воды такого изменения не наблюдалось (рис. 3G, вода N = 7: до и после инъекции 2,38 ± 2,53 против 2,05 ± 1,84, p > 0,05; глюкоза N = 7: до и после инъекции 2,48 ± 0,97 против 3,76 ± 2,76, p < 0,01, критерий Вилкоксона со знаком ранга). Далее, определяя уровни активации в каждой области коры по отношению величины после инъекции к до инъекции, значимая разница наблюдалась только в области М2 (рис. 3H, М2: 0,92 ± 0,89 против 1,30 ± 0,32, p = 0,006; Сомату: 0,95 ± 0,076 против 1,04 ± 0,13, p = 0,27; Визуальные: 0,92 ± 0,3 против 1,00 ± 0,06, p = 0,89; RSC: 0,97 ± 0,27 против 1,10 ± 0,27, p = 0,60, t-критерий).

figure-results-1
Рисунок 1: Обзор метода. (А) Создание катетера: (а) Разрежьте силиконовую трубку. (b) Прикрепите пластиковую бусину к силиконовой трубке с помощью медицинского цианоакрилатного клея. (c) Отрежьте иглу 23 G на расстоянии 1,5 см от кончика. d) Присоедините отрезанный конец иглы к силиконовой трубке. (B) Узел инъектора: (a) Обрежьте инъекционную иглу 23 G на 1 см. (b) Подсоедините обрезанную инъекционную иглу к шприцу объемом 2,5 мл. (c) Оберните отрезанную часть инъекционной иглы в ножны с помощью силиконовой трубки. (d) Отрежьте иглу 23 G на расстоянии 1,5 см от кончика. (e) Прикрепите отрезанный конец иглы к силиконовой трубке. (C) Хирургическая процедура: (a) Депиляция в области операции. (b) Разрежьте кожу и брюшную стенку длиной примерно 1,5 см. (c) Создайте небольшую перфорацию (около 1,5 мм в диаметре) в привратном отделе с помощью ножниц и вставьте катетер (силиконовую трубку). Закрепите катетер на привратном антральном отделе с помощью медицинского цианоакрилатного клея. (d) Прострочите брюшную стенку и кожу с помощью шелкового шовного материала 5/0 и иглы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Спонтанные колебания Ca2+ в широкой коре головного мозга у G7NG817 мышей с подключенным катетером. (A) Репрезентативный пример колебаний Ca2+ в широкой коре, отображаемых с интервалом 0,2 с. Изменения интенсивности флуоресценции представлены с помощью наложения псевдоцвета. Временное окно, обведенное пунктирной линией в B , показывает первый появляющийся переходный процесс Ca2+ , пик которого установлен как время 0. Псевдоцветовое представление использует пик этого переходного процесса Ca2+ в качестве максимального значения и среднее значение +1 SD в качестве минимального значения. (B) Изменения интенсивности флуоресценции во временных рядах для каждого ROI в примере. Цвета линий соответствуют различным областям коры головного мозга: красный представляет M2; пурпурный представляет соматосенсорную область (Somato); синим цветом обозначена визуальная область (Visual); А зеленый цвет олицетворяет ретро-селезенку. Полоска лососевого цвета показывает время впрыска. (C) Один пик в пределах пунктирного контура изолируется и отображается в увеличенном виде. Сокращения: SD = стандартное отклонение; ROI = область интереса; RSC = ретро селезеночная область. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: Реакция Са2+ в широкой коре головного мозга во время/после инъекции глюкозы или воды. (А) Репрезентативный пример введения глюкозы, отображаемый с интервалом 0,2 с. Изменения интенсивности флуоресценции представлены с помощью наложения псевдоцвета. Временное окно, обведенное пунктирной линией в B , показывает первый возникающий после инжекции переходный процесс Ca2+ , пик которого установлен как время 0. Представление псевдоцвета основано на пике первого переходного процесса Ca2+ после инжекции в качестве максимального значения и среднем +1 SD в качестве минимального значения. (B) Изменения интенсивности флуоресценции во временных рядах для каждого ROI в примере. Цвета линий соответствуют различным областям коры головного мозга: красный представляет M2, пурпурный представляет соматосенсорную область (Somato), синий представляет визуальную область (Visual), а зеленый представляет ретро-область селезенки. (C) Один пик в пределах пунктирного контура изолируется и отображается в увеличенном виде. Анализ целевой кальциевой волны – это самая ранняя волна, появившаяся в течение 4-8 с после инъекции. (D) Репрезентативный пример впрыскивания воды в качестве данных контроля уровня глюкозы. (E) Изменения интенсивности флуоресценции во временных рядах для каждого ROI в примере. Цвета линий такие же, как в B. (F) Один пик в пределах пунктирного контура изолируется и отображается в увеличенном виде. Анализ целевой кальциевой волны – это самая ранняя волна, появившаяся в течение 4-8 с после инъекции. (G) Сравнение спонтанной активности М2 (до) и ответа после инъекции (инъекции). Средняя интенсивность флуоресценции изменяется за 50 с до инъекции, а пиковый отклик в области M2 между 4 с и 8 с после инъекции рассчитывали с использованием слуховой коры в качестве эталона. (H) Сравнение уровней активации в каждой области коры головного мозга при введении воды или глюкозы. Для каждого региона рассчитывали отношение значения после инъекции к значению до инъекции, как определено в G. N.S. представляет собой незначимые (p > 0,05). ** <0.01. Полосы погрешностей определяются как стандартная погрешность среднего значения. Сокращения: SD = стандартное отклонение; ROI = область интереса; RSC = ретро селезеночная область. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Обсуждение

В этой статье рассказывается о том, как прикрепить катетер к кишечнику и наблюдать за транскраниальными сигналами Ca2+ в широкой коре головного мозга у трансгенных мышей, экспрессирующих генетически закодированный показатель Ca2+ . В этом эксперименте мы не получили данных визуализации, в которых используется вторичная длина волны источника света. Это связано с тем, что трансгенные мыши, которых мы использовали в этом исследовании, демонстрируют очень высокую скорость изменения интенсивности флуоресценции (~ несколько десятков процентов) в ответ на сенсорные стимулы из-за свойств используемого белка-индикатора Ca2+ (G-CaMP7). Следовательно, мы думали, что загрязнение от гемодинамики было незначительным. Кроме того, нейронные реакции, на которых мы сосредоточились, происходили быстро в течение нескольких секунд, поэтому мы посчитали ненужным учитывать впоследствии генерируемую локальную функциональную гиперемию. Этот метод имплантации катетера способен сочетаться с другими генетически модифицированными мышами для наблюдения за нейронной активностью в других областях мозга и в разных временных масштабах. Однако, если используются другие генетически модифицированные мыши, следует провести описанный выше контрольный эксперимент.

Этот метод прикрепления катетера к кишечнику подходит для однократной инъекции с низкими затратами и является простым и менее инвазивным, чем метод, предложенный ранее29. Традиционно впитывающую вату прикладывают к пищеварительному органу и зашивают. Тем не менее, наложение швов может ухудшить послеоперационное восстановление у мышей. Поэтому мы взяли на вооружение метод крепления. Причина, по которой мы выбрали пластиковые бусины, заключается в том, что они лучше прилегают к силикону с помощью цианоакрилатного клея, который мы используем.

Традиционно считается, что мозг воспринимает глюкозу на основе повышения уровня глюкозы в плазме крови и сопутствующего высвобождения гормонов. Следовательно, мозгу требуется от нескольких минут до нескольких часов, чтобы обнаружить глюкозу после ее всасывания изкишечника. Некоторые исследования показали, что кишечная сенсорика контролирует вкусовые предпочтения мышей в дополнение к пероральному восприятию сладкого вкуса 1,3,17,22. В качестве иллюстративного примера исследователи представили доказательства того, что внутрижелудочный (ИГ) ароматизированный непитательный раствор в паре глюкозы и неметаболизируемый ИГ ароматизированный непитательный раствор в паре α-метил-д-глюкопиранозид (МДГ) могут вызывать предпочтение у каждого ароматизированного непитательного раствора по сравнению с группой, состоящей из ИГ в паре воды. Поскольку внутрибрюшинное введение глюкозы не стимулировало потребление непитательных растворов30, ожидалось, что восприятие питательных веществ в кишечнике будет играть решающую роль в выборе пищи мышами 1,19,22.

Недавнее исследование показало наличие электрически возбудимой клетки в кишечнике, называемой «нейроподовой клеткой», которая использует молекулярные рецепторы для обнаружения и передачи сенсорных стимулов на блуждающий нерв через глутаматергический синапс. В то время как предыдущие исследования в основном были сосредоточены на роли GLP-1 в контроле кормления мышей, недавние исследования показали, что активация блуждающего нерва клетками нейроподов модулирует аппетит мышей. Блуждающий нерв впоследствии активирует Nucleus Tractus Solitarius, что приводит к последующей активации дофаминергических нейронов19. Тем не менее, неизвестно, активирует ли дофаминергическая активация нейронов также кору головного мозга. Чтобы классифицировать церебральные реакции после внутрижелудочной инфузии глюкозы, мы усовершенствовали технику прикрепления катетера для целей визуализации. При использовании этой технологии необходимо проявлять осторожность, чтобы предотвратить повреждение органов, особенно печени, которая подвержена травмам во время манипуляций, необходимых для определения местоположения желудка.

Наши результаты показывают, что внутрижелудочная инъекция глюкозы активирует префронтальную кору в течение нескольких секунд. Тем не менее, внутрижелудочное введение глюкозы запускает несколько сигнальных путей одновременно, таких как гормональные пути, блуждающий нерв и спинномозговой афферентный нерв. Эти сигналы обрабатываются в стволе мозга в разных временных масштабах. Таким образом, будущие исследования должны изучить, как эти сложные сигналы обрабатываются и интегрируются в мозге.

Кроме того, трансгенная линия мышей BAC GLT-1-G-CaMP7, которую мы использовали в настоящем исследовании, экспрессирует сенсор Ca2+ , G-CaMP7, как в нейронах, так и в астроцитах. В принципе, префронтальное повышение Ca2+ , полученное с помощью визуализации Ca2+ в широкой транскраниальной коре, получено из нейронов и/или астроцитов. Однако, поскольку астроциты экспрессируют дофаминовые рецепторы, если задействована передача сигналов дофамина, это предполагает потенциальную активацию астроцитарной передачи сигналов IP3/Ca2+ . Поскольку астроцитарная передача сигналов IP3/Ca2+ регулирует синаптическую пластичность, она также может играть важную роль в изменениях предпочтения сахарозы и изменениях в пищевом поведении после приема глюкозы. Следовательно, потребуется визуализация с клеточным разрешением с использованием двухфотонной микроскопии, чтобы определить, происходит ли реакция, наблюдаемая в префронтальной коре после введения глюкозы, от нейронов или астроцитов в будущих исследованиях. Другой эффективный метод включает наблюдение за клеточно-специфической экспрессией индикатораCa2+ у мышей с использованием аденоассоциированного вируса (AAV) с помощью волоконной фотометрии. Кроме того, необходимо с помощью электрофизиологических методов проверить, действительно ли стимул глюкозы в кишечнике стимулировал блуждающий нерв. Если нейроподные клетки передают сигналы блуждающему нерву, получая глюкозу, мы не ожидаем никакой реакции со стороны блуждающего нерва при введении ингибитора SGLT-1. Наконец, необходима валидация с использованием различных антагонистов дофаминовых рецепторов, чтобы подтвердить, активирует ли проекции блуждающего нерва в Nucleus Tractus Solitarii (NTS) дофаминергические нейроны, увеличивая сигналы Ca2+ префронтальной коры. В целом, эта система позволяет всесторонне исследовать эффекты быстрой нейронной передачи от кишечника к мозгу. В нем представлена очень многообещающая методология, которая потенциально может пролить свет на механизмы, такие как то, как стресс изменяет предпочтения сахарозы в отношении взаимодействия кишечника и мозга.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

Эта работа была поддержана Университетом Отяномидзу, грантами KAKENHI (18K14859, 20K15895), программой JST FOREST, грантом No JPMJFR204G, Исследовательским фондом оптонауки и технологий, Исследовательским советом Као по изучению науки о здравоохранении, Японской ассоциацией химических инноваций и фондом TERUMO в области наук о жизни. Автор благодарит доктора Такаси Цубои, Казуки Хараду и Акиё Нацубори за их руководство экспериментами. Автор также благодарит сотрудников лаборатории за поддержку.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
2,5 мл шприц TERUMOTERUMOss-02Sz
23 G игла для инъекцийTERUMO4987350390691
Анестетик (раствор для ингаляций ИЗОФЛУРАНА)viatris871119
ватный тампонместной фирмы
Цианоакрилатный клей (AronArufa A)TOAGOSEI7990700Q1022
стоматологический акриловый цемент C& Б Сан Медикал 221AABZX00115000
Крем для депиляцииKracieместной компании
Цифровая CMOS камера Хамамацу Фотоника ORCA-Spark
Ушной вкладышNARISHIGEEB-5N
Набор фильтров (U-MWB2)EvidentU-MWB2 
Тонкие ножницыFine Dcience Tools14040-10
G7NG817 мышиRIKEN BRCRBRC09650
Программное обеспечение для работы с изображениямиHamamatsu Photonics HC Программное обеспечение
Изофлуран ваполизаториспользованияSN-487-0T
Источник света (U-HGLGPS)Очевиднаямикроскопия U-HGLGPS
(MVX10)Evident
Пластиковые шарики (внутренний диаметр 3 мм, внешний диаметр 5 мм)местная компания
Плоскогубцыместная компания
Полидиоксаноновый шовный материал, монодиоксAlfresa PharmaHR1305MV45-KF2RЭтот рассасывающийся монофиламентный шовный материал PDS используется для закрытия хирургического разреза
Круглые щипцы с круглым концомF.S.T. 11617-12
солевой растворОцука Фармацевтическая фабрика35061311
Силиконовая трубка (внутренний диаметр 0,5 мм, внешний диаметр 1,0 мм)AS ONE  CORPORATIO33151413местная компания
малая хирургическая иглаNatsume Seisakusho Co., Ltd.
Стереотаксический столикNARISHIGEMA-6N
Xylocaine Jelly 2%Sandoz K.K.614429303Этот желе используется в качестве местного анальгетика для облегчения хирургической боли
для обработки изображений для AC03DNT

Ссылки

  1. Buchanan, K. L., et al. The preference for sugar over sweetener depends on a gut sensor cell. Nature Neuroscience. 25 (2), 191-200 (2022).
  2. Reimann, F. Molecular mechanisms underlying nutrient detection by incretin-secreting cells. International Dairy Journal. 20 (4), 236-242 (2010).
  3. Kreuch, D., et al. Gut mechanisms linking intestinal sweet sensing to glycemic control. Frontiers in Endocrinology. 9, 741(2018).
  4. Gorboulev, V., et al. Na(+)-D-glucose cotransporter SGLT1 is pivotal for intestinal glucose absorption and glucose-dependent incretin secretion. Diabetes. 61 (1), 187-196 (2012).
  5. Harada, N., Inagaki, N. Role of sodium-glucose transporters in glucose uptake of the intestine and kidney. Journal of Diabetes Investigation. 3 (4), 352-353 (2012).
  6. Kaelberer, M. M., Rupprecht, L. E., Liu, W. W., Weng, P., Bohórquez, D. V. Neuropod cells: The emerging biology of gut-brain sensory transduction. Annual Review of Neuroscience. 43, 337-353 (2020).
  7. Stanley, S., Wynne, K., McGowan, B., Bloom, S. Hormonal regulation of food intake. Physiological Reviews. 85 (4), 1131-1158 (2005).
  8. Larsen, P. J., Tang-Christensen, M., Jessop, D. S. Central administration of glucagon-like peptide-1 activates hypothalamic neuroendocrine neurons in the rat. Endocrinology. 138 (10), 4445-4455 (1997).
  9. Alhadeff, A. L., Rupprecht, L. E., Hayes, M. R. GLP-1 neurons in the nucleus of the solitary tract project directly to the ventral tegmental area and nucleus accumbens to control for food intake. Endocrinology. 153 (2), 647-658 (2012).
  10. Raybould, H. E. Gut chemosensing: interactions between gut endocrine cells and visceral afferents. Autonomic Neuroscience: Basic & Clinical. 153 (1-2), 41-46 (2010).
  11. Routh, V. H. Glucose-sensing neurons: are they physiologically relevant. Physiology & Behavior. 76 (3), 403-413 (2002).
  12. Secher, A., et al. The arcuate nucleus mediates GLP-1 receptor agonist liraglutide-dependent weight loss. The Journal of Clinical Investigation. 124 (10), 4473-4488 (2014).
  13. Williams, E. K., et al. Sensory neurons that detect stretch and nutrients in the digestive system. Cell. 166 (1), 209-221 (2016).
  14. Borgmann, D., et al. Gut-brain communication by distinct sensory neurons differently controls feeding and glucose metabolism. Cell Metabolism. 33 (7), 1466-1482.e7 (2021).
  15. Krashes, M. J., et al. Rapid, reversible activation of AgRP neurons drives feeding behavior in mice. The Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1424-1428 (2011).
  16. Aponte, Y., Atasoy, D., Sternson, S. M. AGRP neurons are sufficient to orchestrate feeding behavior rapidly and without training. Nature Neuroscience. 14 (3), 351-355 (2011).
  17. Zhang, L., Han, W., Lin, C., Li, F., de Araujo, I. E. Sugar metabolism regulates flavor preferences and portal glucose sensing. Frontiers in Integrative Neuroscience. 12, 57(2018).
  18. Goldstein,, et al. Hypothalamic detection of macronutrients via multiple gut-brain pathways. Cell Metabolism. 33 (3), 676-687.e5 (2021).
  19. Fernandes, A. B., et al. Postingestive modulation of food seeking depends on vagus-mediated dopamine neuron activity. Neuron. 106 (5), 778-788.e6 (2020).
  20. Kaelberer, M. M., et al. A gut-brain neural circuit for nutrient sensory transduction. 361 (6408), Science. New York, N.Y. eaat5236(2018).
  21. Bohórquez, D. V., et al. Neuroepithelial circuit formed by innervation of sensory enteroendocrine cells. The Journal of Clinical Investigation. 125 (2), 782-786 (2015).
  22. Tan, H. -E., et al. The gut-brain axis mediates sugar preference. Nature. 580 (7804), 511-516 (2020).
  23. Wang, D., et al. Whole-brain mapping of the direct inputs and axonal projections of POMC and AgRP neurons. Frontiers in Neuroanatomy. 9, 40(2015).
  24. Yamada, S., Wang, Y., Monai, H. Transcranial cortex-wide Ca2+ imaging for the functional mapping of cortical dynamics. Frontiers in Neuroscience. 17, 1119793(2023).
  25. Monai, H., et al. Calcium imaging reveals glial involvement in transcranial direct current stimulation-induced plasticity in mouse brain. Nature Communications. 7 (1), 11100(2016).
  26. Ferron, J. -F., Kroeger, D., Chever, O., Amzica, F. Cortical Inhibition during Burst Suppression Induced with Isoflurane Anesthesia. The Journal of Neuroscience. 29 (31), 9850-9860 (2009).
  27. Ming, Q., et al. Isoflurane-induced burst suppression is a thalamus-modulated, focal-Onset rhythm with persistent local asynchrony and variable propagation patterns in rats. Frontiers in Systems Neuroscience. 14, 599781(2021).
  28. Schwalm, M., et al. Functional states shape the spatiotemporal representation of local and cortex-wide neural activity in mouse sensory cortex. Journal of Neurophysiology. 128 (4), 763-777 (2022).
  29. Ueno, A., et al. Mouse intragastric infusion (iG) model. Nature Protocols. 7 (4), 771-781 (2012).
  30. Zukerman, S., Ackroff, K., Sclafani, A. Post-oral glucose stimulation of intake and conditioned flavor preference in C57BL/6J mice: A concentration-response study. Physiology & Behavior. 109, 33-41 (2013).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи