Куркуминоид-опосредованная антимикробная фотодинамическая терапия на мышиной модели кандидоза полости рта

Кандидоз полости рта (ОК) – основная грибковая инфекция ротовой полости; это вызвано чрезмерным ростом Candida spp. Предрасполагающие факторы к ОК включают эндокринную дисфункцию, применение антибиотиков широкого спектра действия, радио- и химиотерапию, дефицит питательных веществ, ксеростомию (низкий поток слюны), ношение зубных протезов, плохую гигиену и, особенно, иммуносупрессию¹. Среди видов Candida Candida albicans является наиболее распространенным и вирулентным; Он обнаруживается в организме человека как комменсальный вид и как условно-патогенный микроорганизм. C. albicans обладает способностью изменять свою морфологию от комменсальных дрожжей (бластопоров) до патогенных филаментов (гиф и псевдогиф)². Нитевидные формы, особенно гифы, могут проникать в эпителий хозяина путем эндоцитоза или активного проникновения, вызывая инфекцию³. Другие факторы вирулентности C. albicans включают адгезию, образование биопленки и секрецию липолитических и гидролитических ферментов и токсинов, таких как липазы, фосфолипазы, протеиназы и кандидализин⁴.

Лечение ОК включает использование противогрибковых средств, особенно топических полиенов и азолов (нистатин и миконазол)⁵. Тем не менее, они показывают только краткосрочную эффективность, и часто рецидивируют. Кроме того, чрезмерное использование противогрибковых препаратов породило проблему развития и распространения устойчивости к противогрибковым^{препаратам6}. Поэтому необходимы альтернативные методы лечения, такие как антимикробная фотодинамическая терапия (ФДТ), которая сочетает в себе фотосенсибилизатор (ФС) и свет с соответствующей длиной волны (такой же, как и у поглощения ФС) в присутствии кислорода. ФС связываются с клетками или поглощаются ими и при активации светом продуцируют активные формы кислорода (АФК), которые токсичны для сенсибилизированных клеток⁷.

В ФДТ одним из фотосенсибилизаторов (ФС) является куркумин (CUR), природное соединение, извлеченное из корневищ растения куркумы (Curcuma longa L.). Куркумин обладает многочисленными терапевтическими свойствами, включая противовоспалительные, антиоксидантные, противораковые и противомикробные свойства ^8,9. Предыдущее исследование показало, что ФДТ с использованием CUR эффективно уменьшает C. albicans в мышиной модели кандидоза полости рта, не причиняя никакого вреда тканям хозяина¹⁰. CUR является основным куркуминоидом, извлекаемым из куркумы, но в этом растении также содержатся другие полифенолы, такие как деметоксикуркумин и бис-деметоксикуркумин. Куркуминоид-опосредованная аФДТ продемонстрировала антибактериальную активность в отношении биопленок золотистого стафилококка, выращенных в катетерах¹¹. Однако, насколько нам известно, его противогрибковая активность в отношении C. albicans остается неясной. Таким образом, в этом исследовании мы оценили аФДТ, опосредованную куркуминоидной солью, против C. albicans в мышиной модели ОК.

Протокол исследования по использованию мышей был одобрен Комитетом по этике использования животных (номера дел 05/2008 и 09/2020) в Школе стоматологии, Араракура, UNESP. В качестве референтного штамма использовали C. albicans (ATCC 90028). Для настоящего исследования были использованы шестинедельные самки швейцарских мышей (n = 45) с массой тела 20-30 г. Животные были предоставлены Государственным университетом Сан-Паулу, UNESP, Ботукату.

1. Подготовка ПС и выбор источника света для ФДТ

1. Подготовьте ПС в соответствии с техническими характеристиками тестируемого вещества.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании в качестве ФС использовалась водорастворимая смесь куркуминоидов (водорастворимая солевая смесь¹² на основе CUR) (см. таблицу материалов и рисунок 1). Разведения на 20 мкМ, 40 мкМ и 80 мкМ (15,6, 29,2 и 58,4 мг/л соответственно) готовили в сверхчистой воде непосредственно перед использованием и выдерживали при температуре 5 °C.
2. Выберите световое оборудование с соответствующей длиной волны (такой же, как у поглощения ФС), способное равномерно и одновременно освещать всю фотосенсибилизируемую мишень без нагрева ткани.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В данном исследовании использовался наконечник, содержащий светодиод (светодиод, см. таблицу материалов), который был разработан в Институте физики Сан-Карлоса (Университет Сан-Паулу, Сан-Карлос, Испания, Бразилия). Выходная мощность света составляла 89,2 мВт/^см2 при длине волны синего цвета около 455 нм.

2. Приготовление инокулята C. albicans

1. Референсный штамм C. albicans (ATCC 90028) хранить в дрожжах-пептон-глюкозе (YEPD, см. таблицу материалов) с 50% глицерином при -80 °C до использования.
2. Замороженный штамм разморозить при комнатной температуре, распределить 100 мкл аликвоты на чашке Петри с декстрозным агаром Сабуро (SDA) с хлорамфениколом (см. таблицу материалов) и инкубировать при 37 °C в течение 48 ч.
3. Перенесите пять колоний в 10 мл дрожжевого азотного бульона со средой 2% глюкозы (YNBg) и выращивайте аэробно при 37 °C в течение 16 ч.
4. Разбавляют дрожжевую культуру в свежем YNBg (1:10) и проводят аэробную инкубацию при 37 °C до тех пор, пока оптическая плотность не достигнет средней логарифмической фазы роста.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Предварительно стандартизируйте кривую роста микроорганизмов для каждой лаборатории. В текущем исследовании культурам давали инкубироваться в течение примерно 8 ч, пока они не достигали средней логарифмической фазы роста, на что указывает оптическая плотность на длине волны 540 нм (OD₅₄₀), со средним значением 0,536 ± 0,062 условных единиц (среднее ± стандартное отклонение [SD]).
5. Центрифугируют культуру при 5 000 х г при комнатной температуре в течение 5 мин, выбрасывают надосадочную жидкость и дважды промывают гранулы тем же объемом стерильного фосфатно-солевого буфера (PBS; 0,136 М NaCl, 2 мМ KCl, 1 мМ KH₂PO₄, 10 мМ Na₂HPO₄, рН 7,4).
6. Используйте аликвоты объемом 100 мкл для выполнения четырех последовательных 10-кратных разведений в PBS, распределите разведения по планшетам SDA и инкубируйте при 37 °C в течение 48 ч для подсчета колоний. Как правило, грибковые суспензии используются в концентрациях примерно 4,5 × 10⁷ колониеобразующих единиц на миллилитр (КОЕ/мл).

3. Индукция ОК у мышей

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующая методика была ранее описана Takakura et ^al.13 и воспроизведена нашей группой^10,14 с некоторыми изменениями.

1. Случайным образом распределите мышей по девяти группам (n = 5), что соответствует одинаковому количеству обработок (Дополнительный файл 1).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Ротовая полость мышей должна быть отрицательной на рост Candida . Это необходимо проверить, взяв мазок из ротовой полости и нанеся образец на SDA.
2. Содержать животных в пропиленовых ящиках по¹⁰ штук (макс. 5 мышей в коробке), с древесной стружкой для напольного покрытия, в виварии с регулируемой температурой при температуре 23 ± 2 °C при цикле 12/12 ч свет/темнота. Никакого специального обогащения не требуется.
3. Содержать мышей на экструдированной мышиной диете и фильтрованной воде ad libitum.
4. Подкожно вводят иммуносупрессивный препарат преднизолон (100 мг/кг массы тела, см. таблицу материалов) в первый раз в первый день всем членам групп C+L+ 20, C+L+ 40, C+L+ 80, C+L- 20 мкМ, C+L- 40, C+L- 80, C-L+ и C-L- (Дополнительный файл 1).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Держите мышей из одной группы в одной коробке и ежедневно наблюдайте за ними на предмет любых признаков стресса и потери веса. Обратитесь к ветеринарному врачу за обезболивающим или измененным кормом/водой, если вы заметили стресс или потерю веса.
5. Начиная с первого дня и до конца эксперимента, добавляйте тетрациклина гидрохлорид в питьевую воду в концентрации 0,83 мг/мл¹³.
6. Инокулировать языки мышей на второй день, включая группы C+L+ 20, C+L+ 40, C+L+ 80, C+L- 20, C+L- 40, C+L- 80, C-L+ и C-L- (Дополнительный файл 1), инокулюмом C. albicans . Не прививайте мышей из отрицательной контрольной группы (NCtrl).
   1. Усыпляйте животных внутримышечным введением 10 мг/кг хлорпромазина хлорида (см. таблицу материалов) на каждую мышцу бедра перед проведением посева.
   2. Проводят внутриротовую инокуляцию мышей путем замачивания стерильного тампона (по одному на животное) в свежеприготовленную (т.е. приготовленную непосредственно перед инокуляцией) стандартизированную суспензию C. albicans.
   3. Поместите мышей под седативные препараты в положение лежа на спине. Осторожно вытащите язык изо рта с помощью стерильных щипцов. Протирайте язык каждой мышки смоченным тампоном в течение 30 с. Наблюдайте за мышами до тех пор, пока они не оправятся от седации.
7. На пятый день вводят дополнительную подкожную инъекцию преднизолона (100 мг/кг массы тела) для поддержания иммуносупрессии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол достаточен для сохранения инфекции в течение 7 дней после внутриротовой инокуляции. Временная шкала протокола показана на рисунке 2.

4. Антимикробная фотодинамическая терапия и восстановление C. albicans из поражений полости рта

1. На седьмой день, перед началом лечения, обезболивают животных с помощью внутрибрюшинной инъекции кетамина гидрохлорида (100 мг/кг массы тела) в сочетании с ксилазином (10 мг/кг массы тела) (см. таблицу материалов).
2. Поместите каждое животное в положение лежа на спине на подушечку ^14,15, оснащенную проволокой из нержавеющей стали, которую можно обмотать вокруг резцов, чтобы рот оставался открытым.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Изотермические прокладки рекомендуются для согревания мышей во время их седативных препаратов, предотвращения гипотермии при комнатной температуре и предотвращения смертности, связанной с анестезией¹⁵. Каждое животное, находящееся под наркозом, должно находиться под наблюдением по отсутствию рефлекса отмены при защемлении пальцев ног для подтверждения глубины анестезии. При необходимости можно ввести одну поддерживающую дозу кетамина в размере 1/3 первоначальной дозы (без ксилазина).
3. Отведя нижнюю челюсть и щеки, осторожно поместите язык за пределы рта.
4. Для мышей из группы С+L+ пипетку 70 мкл ФС на спинку языка (в одной из тестируемых концентраций). Держите мышей в темном помещении в течение 20 минут в качестве периода предварительного облучения. Следите за тем, чтобы в течение этого времени язык каждого животного оставался в ротовой полости, чтобы предотвратить проглатывание фотосенсибилизатора (ФС).
5. После периода фотосенсибилизации вытащите язык изо рта для освещения. Поместите светодиодное устройство на спинку язычка и зажгите при 37,5 Дж/^см2 (7 мин с данным устройством) (Рисунок 3).
6. Животным из группы С+L- пипетку 70 мкл ПС в одной из испытуемых концентраций на спинку языка и держать этих мышей в темноте в течение 27 мин.
7. Для животных из группы C-L+ (обработанных светом без предварительной фотосенсибилизации) пипетку 70 мкл стерильного физиологического раствора на спинку языка. Держите мышей в темноте в течение 20 минут, а затем освещайте их языки при давлении 37,5 Дж/^см2 (7 минут с данным устройством).
8. Для мышей из группы С-L (не обработанных ФС и светом) пипетку 70 мкл стерильного физиологического раствора на спинку языка и держать в темноте в течение 27 мин.
9. Извлечение C. albicans из языков всех мышей сразу после лечения. Промокните спинку языка в течение 1 мин стерильным ватным тампоном.
10. Поместите каждый образец тампона в пробирку, содержащую 1 мл стерильного физиологического раствора, и встряхните его на 1 минуту, чтобы ресуспендировать микробные клетки.
11. Немедленно выполняйте 10-кратное последовательное разведение в PBS и 25 мкл аликвот на планшетах SDA в двух экземплярах. Инкубируйте планшеты аэробно при 37 °C в течение 48 ч.
12. Через 48 ч используйте цифровой счетчик колоний (см. Таблицу материалов) для определения количества дрожжевых колоний. Рассчитайте нагрузку C. albicans (КОЕ/мл) для каждого животного.
13. Преобразуйте значения КОЕ/мл в log₁₀ и выполните надлежащий анализ в соответствии с планом эксперимента и предположениями о данных.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В настоящем исследовании использовались односторонний ANOVA Уэлча и post-hoc критерий Геймса-Хауэлла (α = 0,05)¹⁶ .

5. Гистопатологические анализы

1. На восьмой день обезболивают мышей кетамином в дозе 100 мг/кг в сочетании с ксилазином в дозе 10 мг/кг путем внутрибрюшинной инъекции и усыпляют их при передозировке кетамина (200 мг/кг, вводимого внутрибрюшниально). Подтвердите смерть, проверив отсутствие дыхательных движений (апноэ) и сердцебиения (асистолия).
2. Осторожно зажмите язык и вытащите его изо рта животного. С помощью ручного скальпеля сделайте разрез перед циркумваллярными сосочками, чтобы хирургическим путем удалить весь язык, не причиняя никаких травм передней и центральной областям.
3. Зафиксируйте язык в 10% буферном формалине (рН 7,2-7,4) на 24 ч и промойте в проточной воде в течение 2 ч.
4. Приступают к включению в процесс парафина: обезвоживанию, осветлению и пропитке^10,14.
5. Вырежьте серийные срезы (толщиной 5 мкм) с помощью микротома, затем прикрепите их к предметным стеклам. Приступают к окрашиванию этих срезов с помощью периодической кислоты-Шиффа и гематоксилина (PAS-H) для гистопатологического исследования и выявления грибов путем наблюдения под световым микроскопом.
6. Попросите патологоанатома, желательно слепого к изучаемым группам, изучить реакцию тканей на инфекцию C. albicans .
7. Описывают гистологические характеристики ткани (эпителия и соединительной ткани), особенности местных воспалительных реакций различной интенсивности.

Мышиная модель ОК показала типичные белые пятна и псевдомембраны на языке всех инфицированных мышей (рис. 4А). У C. albicans, полученных от C-L- животных, подтверждена колонизация тканей этим микроорганизмом (значения варьировали от 1,62 x 104 до 4,80 x 10,5 КОЕ/мл). Как и ожидалось, у животных из группы NCtr не было выявлено каких-либо изменений в тканях или роста колоний после отбора проб (рис. 4B).

ФДТ снижала жизнеспособность C. albicans при использовании куркуминоидов при дозе 80 мкМ для фотосенсибилизации (рис. 5). Среднее логарифмическоеснижение 10 , достигнутое при использовании 80 мкМ PS-опосредованной ФДТ, составило 2,47 по сравнению с таковым в группе C-L- (p = 0,008).

Количество колоний C. albicans , извлеченных из языков мышей, существенно не отличалось у мышей, получавших куркуминоиды без освещения (группы C+L), мышей, получавших свет, но ранее не подвергавшихся фотосенсибилизации (группы C-L+), и мышей, не получавших лечения (группа C-L-), и мышей, не получавших лечения (группа C-L) (p ≥ 0,210).

Гистологические особенности языков неинфицированных животных (NCtr) показали нормальные/здоровые ткани, включая интактную собственную пластинку, базальную мембрану и нитевидные сосочки (рис. 6А). Напротив, при изучении гистопатологических изображений языков мышей из группы C-L- было очевидно, что дрожжи и нити присутствовали в ороговевшем слое эпителия, хотя инфильтрация грибов отсутствовала. В нижележащей соединительной ткани наблюдалась легкая воспалительная реакция, в основном опосредованная мононуклеарными клетками, при этом нитевидные сосочки заметно отсутствовали (рис. 6Б). Гистологический анализ языков мышей в группах C+L- и C-L+ показал сходные характеристики. Напротив, на срезах языка мышей, получавших 80 мкМ куркуминоид-опосредованную ФДТ, было выявлено сниженное количество грибковых клеток, в основном ограниченных ороговевшим слоем эпителия (рис. 6C).

Рисунок 1: Химическая структура фотосенсибилизатора. Химический состав водорастворимой солевой смеси, используемой в качестве фотосенсибилизатора, содержит 53,4% природного куркумина и 46,6% других куркуминоидов (деметоксикуркумин и бис-деметоксикуркумин). Окончательная средняя молекулярная масса составляет 730,32 г/моль. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Хронология протокола для мышиной модели орального кандидоза и ФДТ. График с описанием протокола для мышиной модели перорального кандидоза и антимикробной фотодинамической терапии (ФДТ). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Освещение языков мышей после фотосенсибилизации. После фотосенсибилизации (инкубации инфицированной ткани с фотосенсибилизатором) языки освещали при 37,5 Дж/см2 с помощью синего (~455 нм) светодиодного света. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Белые поражения в мышиной модели кандидоза полости рта. (A) Репрезентативные изображения, изображающие белые поражения, наблюдаемые в мышиной модели кандидоза полости рта. (Б) Отрицательный (неинфицированный) контроль. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5: Candida albicans , извлеченный из языков мышей. Данные представляют собой средние значения ± стандартное отклонение log10 (КОЕ/мл) от групп лечения. Однофакторный ANOVA Уэлча показал, что эффекты лечения статистически значимо различались между группами (p < 0,001). Различные строчные буквы (a, b, c) рядом со средними значениями указывают на статистически значимые различия по критерию Геймса-Хауэлла (p≤ 0,030). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 6: Репрезентативные изображения гистологических срезов мышиных языков. Гистологические срезы мышиных языков были окрашены PAS-H, и изображения были получены в 200-кратном размере. (A) Мыши с отрицательным контролем без индуцированного кандидоза полости рта, фотосенсибилизации и освещения (группа NCtr). (B) Мыши с индуцированным кандидозом полости рта, не фотосенсибилизированные и не подвергшиеся воздействию светодиодного освещения (C-L-группа). (C) Животные с индуцированным кандидозом полости рта, подвергшиеся воздействию куркуминоидов 80 мкМ и светодиодному освещению 37,5 Дж/см2 (группа C+L+80). Масштабные линейки = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный файл 1: Экспериментальные группы. Список экспериментальных групп, использованных в настоящем исследовании. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

C. albicans has been associated with oral and esophageal infections in individuals with an immunocompromised state, diabetes mellitus, prolonged use of antibiotics, and poor oral hygiene^1,3. The study of human infectious diseases requires both in vitro and in vivo investigations before clinical trials can be safely and accurately designed. The present study describes a method for establishing a murine model of OC, which can be used to evaluate the pathogenesis of oral infections by C. albicans and the efficacy of antifungal approaches^{15,16,17,18,19}.

The murine model of OC employed here was successfully established, as evidenced by the substantial fungal load recovery from lesions as well as by the characteristic infection features observed in the macroscopic and histopathological analyses of the tongues of infected mice. Many studies have used similar murine models of OC. In such models, female mice are immunosuppressed and inoculated with C. albicans, resulting in lesions on the tongue^{10,13,14,15,20,21}. Immunosuppression with prednisolone, a glucocorticoid, inhibits the activity of neutrophils against C. albicans²². In this study, female mice were immunosuppressed with two subcutaneous injections of prednisolone, one day prior to and three days after infection with C. albicans¹³. In addition, the administration of tetracycline in drinking water during the course of the experiment caused oral dysbiosis by disturbing oral bacteria and helping C. albicans to thrive^23,24. Furthermore, the sedation caused by the intramuscular injection of chlorpromazine chloride prevented the animals from drinking water and eating immediately after inoculation. Thus, fungal cells stayed in contact with the dorsum of the tongue for a longer time, enabling the development of germ tubes and the transition from yeasts to filaments (hyphae and pseudohyphae), which are the pathogenic morphologies of C. albicans that can invade the human epithelium. Teichert et al.²⁵ used an immunodeficiency protocol to induce OC in mice and recovered only 2 x 10² CFU/mL of C. albicans.

While Totti et al.²⁶ utilized sialoadenectomized mice and conducted four separate inoculations with a C. albicans suspension, it's noteworthy that, in their case, the infection was not sustained in most animals over the course of the experiment. In contrast, in the present study, the inoculation with fungal cells was carried out only once, and it resulted in the recovery of 10⁴ CFU/mL of C. albicans from the oral cavity. This study employed the murine model of candidiasis described by Takakura et al.¹³, who performed oral inoculation with a clinical strain isolated from a patient with cutaneous candidiasis (10⁶ CFU/mL). Three to seven days post-inoculation, 10⁵-10⁶ CFU/mL of C. albicans were recovered from the oral cavity of mice¹³. The differences between the method of Takakura et al.¹³ and this study include the use of different fungal concentrations in the inoculum (this study used 10⁷ CFU/mL of C. albicans) and different C. albicans strains for oral inoculation (the reference strain ATCC 90028 was used here). Carmello et al.²⁰ employed a similar protocol, which involved using immunosuppressed animals. However, they administered two additional subcutaneous injections of prednisolone to the animals on days 1, 5, 9, and 13 of the experiment. Their study revealed a positive correlation between the scores assigned to the oral lesions of the infected animals and the number of CFU/mL over a period ranging from 5 to 16 days post-infection. It has been well-established in previous research that it is crucial to closely monitor animals under anesthesia to prevent hypothermia. Additional maintenance doses of ketamine should be administered with discretion, only when necessary²⁷.

Regarding the efficacy of aPDT application, the results showed that the irradiation of tongues previously treated with an 80 µM curcuminoid salt mixture caused a significant reduction (2.47 log₁₀) in the viability of C. albicans. Histological analyses revealed that sections from tongues treated with 80 µM curcuminoid-mediated aPDT showed a reduced number of fungal cells, which were limited to the keratinized layer, and a low inflammatory response. It is worth emphasizing that an inflammatory response was detected in all mice that were infected with C. albicans. This observation implies that the inflammation observed in all the aPDT groups might be linked to Candida infection rather than being attributed to aPDT, a consistent finding in line with our prior investigations^10,13,14,15.

Previous investigations used CUR, methylene blue, and photodithazine (PDZ) as PSs and obtained promising results^{10,20,24,25,27}. In a similar study¹⁰, a combined exposure to CUR and LED light caused a significant reduction in the viability of C. albicans; however, the use of 80 µM CUR and light reduced fungal viability by 4.0 log₁₀. Dovigo et al.¹⁰ used only CUR as PS, whereas we used a salt containing the three main curcuminoids from C. longa. When CUR (260 µM) and LED light were used for five consecutive days in the treatment of oral candidiasis in mice, the authors observed a reduction of 1.11 log₁₀ in fungal viability²¹. When methylene blue was used as PS at 450 µg/mL and 500 µg/mL, aPDT totally eradicated C. albicans from the oral cavity of mice²⁵. Moreover, when aPDT was mediated by PDZ (100 mg/L), a 3.0 log₁₀ reduction and complete remission of oral lesions were observed²⁰. In addition, aPDT increased TNF-α expression in comparison with that in the untreated group²⁰. In a study where a fluconazole-resistant strain was used, aPDT mediated by PDZ (200 mg/L) promoted a reduction equivalent to 1.3 log₁₀²⁷. Moreover, the combination of aPDT with nystatin resulted in a substantial reduction in fungal viability, amounting to a decrease of 2.6 log₁₀, along with notable improvements in oral lesions and a reduction in the inflammatory response²⁷. Collectively, these studies provide compelling evidence for the effectiveness of aPDT in reducing fungal burden within the murine model of oral candidiasis, underscoring its potential as a clinical treatment option due to its antimicrobial efficacy without causing harm to host tissues.

In conclusion, the murine model of OC used in this study is appropriate for mimicking infection and evaluating aPDT efficacy. As a limitation, the OC model used here employed only one reference strain of C. albicans (other strains, clinical isolates, and non-albicans Candida species were not evaluated). In addition, the corticosteroid-induced immunosuppression used in mice to develop oral infection may not mimic other immunodeficiency states, such as that due to HIV infection. There may also be differences in the host conditions for developing OC, such as the oral microbiota of mice and humans. This protocol should be expanded further to evaluate mixed biofilms formed by more than one species or by different strains from the same species. Furthermore, keeping mice adequately sedated and preventing hypothermia while avoiding anesthesia-related mortality are the most difficult steps of the protocol.