Методическая статья

Оптимизация мышиной модели пародонтита, вызванной лигатурой, для доклинических исследований

DOI:

10.3791/65908

⸱

30 апреля 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Comprehensive Care, Department of Periodontology, University of North Carolina at Chapel Hill, 2Division of Pediatric and Public Health, Adams School of Dentistry, University of North Carolina at Chapel Hill, 3Department of Epidemiology, Gillings School of Global Public Health, University of North Carolina at Chapel Hill, 4Department of Applied Physical Sciences, University of North Carolina at Chapel Hill, 5Department of Biostatistics and Health Data Science, School of Medicine, Indiana University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Модель мышей с пародонтитом, вызванного лигатурой, является эффективным и всё более популярным инструментом для изучения пародонтита. Представлены подробные рекомендации по внедрению упрощённой версии модели, ориентированной на межпроксимальное разрушение альвеолярных костей, включая лабораторное проектирование, производство 3D-печатных инструментов и количественную оценку костей с помощью μCT анализа.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Экспериментальная модель пародонтита, вызванного лигатурой, у мышей сыграла фундаментальную роль в понимании патогенеза пародонтита; тем не менее, она не была полностью использована для трансляционных и терапевтических целей. Подобно человеческим заболеваниям, у мышей лигатурно-индуцированный пародонтит развивается посредством серии различных микробных, воспалительных и остеоиммунологических событий. Разрушение альвеолярной кости, вызванное лигатурой, прогрессирует за относительно короткий период и легко измеряется, что делает его экономичной моделью заболевания для доклинических исследований.

Чтобы преодолеть техническую сложность классической модели лигатуры, была создана упрощённая модель мыши с периодонтитом, вызванной лигатурой. Вместо того чтобы вызывать заболевание по всей окружности двух соседних зубов, упрощённая модель болезни сосредоточена на воспалительном разрушении костей только в межпроксимальной области двух задних зубов, которая также является регионом, который у человека начинается при распространённом пародонтозе. Поскольку используется трёхмерные (3D)-печатные инструменты для размещения лигатур, этот подход быстрый и эффективный, что обеспечивает процедурное время 5-10 минут на мышь. Хотя остеокластогенная сигнализация обнаруживается через 3 дня после установки лигатуры, разрушение костей стабильно развивается через 9 дней после перевязки.

Здесь упрощённый протокол модели лигатуры разрабатывается с выделением важных элементов, специфичных для проектирования исследования (например, расчёт мощности, стандартизация процедур, калибровка), разработки 3D-печатных инструментов (например, «мышиного зубного ложе» и «держателя лигатуры»), а также количественной оценки альвеолярных костей с помощью μCT анализа. Экспрессия десневых генов Rank, Rankl и Opg — главной регуляторной триады остеокластогенеза — используется как косвенное доказательство терапевтической эффективности. Методы, представленные в этой статье, помогут исследователям внедрить упрощённую модель периодонтита, вызванного лигатурой, для тестирования инновационных периодонтических терапевтических средств в доклинических условиях.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Пародонтоз — это сложный воспалительный процесс, приводящий к разрушению зубоподдерживающих структур, включая дессены, пародонтальную связку, цемент и альвеолярную кость. Для развития пародонтальной потери костной ткани необходимо разрушить десневой барьер и бактериальное вторжение, а также рекрутировать воспалительные клетки и перейти от врожденного доминирующего к приобретённому доминирующему иммунномуответу 1. Окончательный дисбаланс между остеобластами и остеокластами приводит к потере альвеолярной кости через ихразрушение 2. Ключевым фенотипическим открытием, отличающим диагноз пародонтоза от обратимого воспаления десен (гингивита), является потеря альвеолярной кости. Поэтому количество альвеолярной кости, поддерживающей зуб, является ключевым терапевтическим результатом в доклинических условиях.

Ни одна конкретная животная модель не может воспроизвести все биологические аспекты, необходимые для разработки различныхтерапевтических средств 3,4,5. Модель мышей с пародонтитом, вызванной лигатурой, развивает количественно измеримое разрушение костей за относительно короткое время (3-9 дней)5, что делает её экономичной моделью для тестирования новых терапевтических вмешательств по профилактике и модуляции пародонтита. Несмотря на успех в поддержке разработки клинических испытаний на людяхфаз II–III 6, 7, 8, 9, 10, пародонтит, вызванный лигатурой, у мышей редко используется как доклиническая модель. Чтобы преодолеть технические трудности классической модели, в которой связка окружает зуб, была создана упрощённая модель мыши с пародонтитом, вызванной лигатурой,11,12. Простая модификация классической модели сосредоточена на сфокусированном месте разрушения костей, между зубами, а не вокруг них. Преимущества этой модификации многократны, включая сокращение времени, необходимое для 1) обучения персонала, 2) технической простоты экспериментальной процедуры и 3) воспроизводимости костей количественной оценки. Кроме того, было обнаружено, что несколько микробиологических и иммунологических событий, развивающихся и проявляющихся в рамках этой упрощённой модели, совпадают с современным пониманием распространённой пародонтической болезничеловека 2,11,12,13. Наконец, эффективная профилактика потери костной ткани, вызванная лекарствами, ранее описанная us 2,14, дополнительно поддерживает использование упрощённой модели пародонтита, вызванного лигатурой, как инструмента in vivo для оценки ключевых аспектов новых периодонтальных методов терапии.

Инновационным аспектом упрощённой модели пародонтита, вызванного лигатурой, стала разработка 3D-печатных инструментов для облегчения процесса индукцииболезни 11,12. Хотя для некоторых это было интуитивно, исследователи сообщили о невозможности собрать 3D-печатныеинструменты 15, что может дополнительно затруднять или задерживать начало исследований на животных. Настоящее исследование расширяет информацию, представленную в нашем предыдущемпротокольном исследовании 11, и предоставляет подробную информацию для успешной реализации упрощённой модели пародонтита, вызванного лигатурой, в лабораторных условиях. Детали, включённые в этот текущий протокол, являются частью сложного ряда факторов, которые могут способствовать отсутствию воспроизводимости результатов научныхрезультатов 15, 16, 17 (15, 16, 17). Постоянное использование модели и надёжная резорбция костей, выявленные в многочисленныхисследованиях 2, 11, 12, 14, 18 и совместных исследовательскихгруппах 13, 19, 20, 21 за последние 10 лет, подтверждают важность распространения подробной информации для продвижения воспроизводимости в научном сообществе.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол соответствовал руководящим принципам Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments (ARRIVE) No 22,23. Все экспериментальные процедуры, описанные в этом протоколе, были одобрены IACUC Университета Северной Каролины в Чапел-Хилле.

1. Экспериментальная конструкция

  1. Расчёт размера выборки
    ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за трансляционного характера исследовательской программы расчёт мощности, представленный здесь, основан на измерениях альвеолярных костей мышей дикого типа C57Bl6 возрастом 8-12 недель.
    1. Анализировать кость на основе линейных измерений между цементно-эмальным соединением и альвеолярным гребнем кости (CEJ-ABC).
      1. У здоровых мышей средний уровень прикрепления (или измерение CEJ-ABC) составляет 0,2 мм, тогда как у мышей с пародонтитом на 9-дневном этапе после перевязки это число вдвое больше (расстояние CEJ-ABC 0,4 мм)11. Потеря альвеолярной костной ткани не увеличивается значительно с 9 до 18 дней после установкилигатуры 11.
      2. Проведите анализ расчёта мощности на основе этого размера эффекта, чтобы определить количество мышей, необходимых для выявления этих различий между здоровьем и болезнью (здесь всего 8-10 мышей [Рисунок 1A]).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Мощность была рассчитана для достижения степени от 0,8 до 0,95, α = 0,05, используя среднюю мощность из двух выборок. Средние группы и стандартные отклонения показаны на рисунке 1B.
    2. Чтобы определить терапевтический эффект на потерю костной ткани, выполните другой расчет мощности. Вместо сравнения здоровых мышей с больными, поскольку и экспериментальные, и контрольные группы мышей развивают пародонтит в этом протоколе, выделите от 19 до 31 мыши на группу для обеспечения воспроизводимости результатов при тестировании модуляции потери костной ткани с помощью упрощённой модели пародонтита, вызванного лигатурой (см. репрезентативные результаты и рисунок 1C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мощность была рассчитана с использованием того же теста, описанного выше. Групповые средние и стандартные отклонения показаны на рисунке 1D.
  2. Стандартизация процедур и калибровка персонала
    1. Обучать и калибровать весь персонал, участвующий в индукции и количественной оценке заболевания, до начала исследования (интеркалибровка и интракалибровка;r 2 ≥ 0,90).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оценивается, что подготовка по установке лигатуры и количественной оценке потери костной ткани занимает 2-3 месяца (хронология приведена в Таблице 1). Другие необходимые шаги приведены в виде хронологии в Таблице 1.
    2. Для процедуры установки перевязки два квалифицированных исследователя работают вместе в процедурной комнате. Основной исследователь (внутри- и межкалиброванный) остаётся оператором, устанавливающим лигатуры.
    3. Пусть второй следователь будет работать процедурным ассистентом и выполнять следующие шаги:
      1. Запишите вес мыши.
      2. Положите мышь в анестезию.
      3. Нанесите глазную мазь на мышь перед тем, как передать её оператору для размещения в «зубной кровати мыши».
      4. Убедитесь, что ≥3 «держателя для лигатур» загружены соответствующим образом и готовы к использованию.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Для повышения эффективности идеально иметь ≥3 «держателя лигатуры», правильно загруженных для использования оператором. Рекомендуется целесообразность (то есть время процедуры 5-10 минут за мышь), что увеличивает количество экспериментов в день и снижает потенциальные эффекты на партии.
      5. Проведите мониторинг мыши (до и после процедуры).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Пародонтит, вызванный лигатурой, — это неинвазивная, нехирургическая процедура, похожая на использование зубной нити на человеческом зубе. Ожидается, что установка связки вызывает у мышей очень лёгкий дискомфорт (в основном из-за накопления бактерий между двумя зубами), но не требует использования обезболивающих. Осложнений после установки лигатуры обученным специалистом не ожидается. Всех животных контролируют каждые 2-3 дня после установки лигатуры. Гуманные конечные показатели (например, неуход в уход или кормление, невозможность встать или передвигаться, затруднённое дыхание, некротические или инфицированные раны) должны быть указаны в утверждённом протоколе для животных, но при возникновении осложнений следует проконсультироваться с ветеринарным персоналом по поводу соответствующих мер.

2. Создание печатных инструментов для индуцирования лигатурного пародонтита у мышей

ПРИМЕЧАНИЕ: Для оптимизации размещения лигатуры были разработаны 3D-печатные инструменты под названием Mouse Dental Bed и Ligature Holder , состоящие из нескольких отдельных 3D-печатных деталей, которые печатаются отдельно и далее собираются вручную. Спецификации чертежей этих устройств были ранее опубликованы11 и могут использоваться опытными исследователями для создания отдельных STL-файлов. Новые устройства в настоящем исследовании были созданы совместно с BeAM Design Center Университета Северной Каролины в Чапел-Хилле. Материалы можно получить через соответствующую основную базу или напечатать на 3D-принтере с использованием STL-файлов из Дополнительного файла 1.

  1. Мышиная зубная кровать
    1. Печатайте зубное столо мыши (рисунок 2A) и держатель лигатуры (рисунок 2B) с использованием стандартного качества печати на 3D-принтере с использованием 3,0 мм полимолочной кислоты (PLA) филамента. Печатайте зубное столо в заданной ориентации, а остальные части — с равномерными плоскими поверхностями, направленными вниз к печатному столу. Активируйте опцию вспомогательных материалов , включив настройку Размещение поддержки. Убедитесь, что опорный материал сначала касается строительной плиты, выбрав опцию Touching Buildplate.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте пять STL-файлов из Дополнительного файла 1 для печати всех необходимых элементов, включая отсоединённую трубку, лигатуру (с выемкой), зубную постель мыши (с вырезами), крышку и замок держателя лигатуры. См. таблицу материалов для размеров каждого предмета (ранее представленные спецификациичертежа 10).
    2. После завершения печати обрезайте все детали печатного материала с моделей с помощью проволочных кусачек, плоскогубцев с игольчатыми носом или другого инструмента.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Во время этой процедуры надевайте защитные очки.
  2. Сборка зубной платформы мыши
    1. Чтобы подготовить зубное ложе для мыши, разложите все детали как показано (рисунок 3A) и подготовьте клей для использования (рисунок 3B).
    2. Нанесите несколько капель клея (рисунок 3C) и прикрепите винты, как показано (рисунок 3D). Снова подготовьтесь к переносу клея (рисунок 3E) на те места, куда он будет нанесен. Сдвиньте паз напечатанной трубки (рисунок 3F) так, чтобы зазубренный конец был обращён в сторону от зубного стола мыши (именно здесь будет крепиться шланг для подачи изофурана).
    3. Закрепите стабилизирующие детали головы клеем в местах (рисунок 3F).
    4. Уберите лишний клей и слегка прижимайте все вставленные детали для прочного крепления (рисунок 3F).
  3. Корректировки держателя лигатуры
    1. Чтобы уменьшить дискомфорт при блокировке/разблокировке механизма, убедитесь, что все квадратные/острые края внешней части замка держателя лигатуры (рисунок 4A) слегка скошены под углом 45° с помощью рукоятки скальпеля 15C, No3 с лезвием 15C.
    2. Чтобы обеспечить плотное прилегание механизма замка к держателю лигатуры, выровняйте любые внутренние округлые углы замка держателя лигатуры (рисунок 4B-F) с помощью лезвия скальпеля 15C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это позволит замку полностью прикрепиться к держателю лигатуры и потребует лишь небольших изменений.
      1. Используйте инструмент для обрезки 3D-принтера или лезвие скальпеля 15C, чтобы удалить оставшиеся «вспышки» на верхних и нижних краях даже после удаления большей части опоры, а также слегка скосите края под углом 45° (аналогично фаске, выполненной на фиксаторе держателя на уровне 1), чтобы обеспечить плотно прилегающий замок.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Не снимайте слишком много материала, а только столько, чтобы замок мог сдвигаться без сопротивления.
    3. Если они слишком тонкие, обрезайте длину каждого кончика до более толстого поперечного сечения [не менее 0,5 мм], чтобы между кончиками оставалось достаточное пространство, чтобы избежать давления на нёбо при установке лигатур. Убедитесь, что кончики длиной не менее 3 мм после резки (рисунок 5A, показано как «CUT»).
    4. На кончиках держателя для лигатуры удалите вспышки с «опоры», на которой был напечатан инструмент, чтобы боковые стороны наконечников были ровными (рисунок 5B, стрелка).
    5. Уберите «срез» боковой части каждого кончика под углом 45°, чтобы облегчить нагрузку на неё лигатуру, а также смягчите края для предотвращения травматических повреждений мягких тканей (рисунок 5C, отмечен стрелками).
    6. Убедитесь, что на каждом кончике держателя лигатуры есть выемка в форме буквы «V», в которую могут отдыхать швовые швы. Если это было удалено на шаге 2.3.6 из-за того, что исходный напечатанный наконечник был слишком тонким, уточните его на печати или воспроизведите.
      1. Если видна эта «V»-образная выемка, положите держатель лигатуры на плоскую поверхность, параллельно оба конца стола, аккуратно вставьте лезвие скальпеля 15C в основание выемки и аккуратно покачивайте лезвие из стороны в сторону так, чтобы лезвие оставалось у основания «V», а боковая сторона лезвия касалась верхних стенок «V». Если лезвие находится у основания выемки, очень аккуратно наклоните лезвие к внешней поверхности кончика и повторите это движение, чтобы уточнить основание «V»-образной выемки на внешнем краю, что позволит швейной нитке легче направляться на место.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Это раскачивание создаёт достаточно движения в филаменте, чтобы сдвинуть её в сторону и уточнить вырез, не удаляя чрезмерное количество материала.
      2. Если эта выемка в форме буквы «V» не видна, положите держатель лигатуры на плоскую поверхность, оба конца перпендикулярны столешнице. Смотря прямо вниз вдоль обоих кончиков держателя лигатуры, поместите лезвие скальпеля 15C в центр наконечников и одним осознанным движением сделайте неглубокий разрез, чтобы создать начало того, что в итоге станет выемкой в форме буквы «V».
        ПРИМЕЧАНИЕ: Часто проще выполнить это действие на каждом наконечнике отдельно, чем пытаться разместить лезвие в нужном месте на обоих кончиках одновременно.
      3. При необходимости повторите шаг 2.3.7.2, убедитесь, что лезвие скальпеля всегда возвращается в одно и то же место в середине кончика.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Если лезвие не возвращается обратно в то же место, будет сделано несколько разрезов, что приведёт к разделению слоёв филамента в этих местах и потенциально снизит производительность инструмента.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Глубину выемки в форме буквы «V» необходимо периодически проверять с помощью завязанной швно-шелковой связки, чтобы определить, держится ли лигатура или продолжает соскальзывать (что может указывать на необходимость дальнейшей доработки). Держатель должен быть напечатан так, чтобы вырез был обращён вниз на платформе, а замок держателя Ligature должен быть ориентирован так, чтобы более широкий отверстие касался пластины. Опять же, поддерживающий материал можно использовать с размещением опоры, установленным только на Touching Buildplate.
  4. Держатель лигатуры собран
    ПРИМЕЧАНИЕ: После внесения модификаций соберите держатель лигатуры и проверьте следующее:
    1. Когда лигатура зафиксирована на месте, убедитесь, что замок защемляет резьбу к держателю лигатуры (не показано на рисунке 6A , как указана стрелкой, но на рисунке 6B) либо сверху, либо снизу замка (по возможности, но это может быть сложно сделать).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это трение гарантирует, что лигатура не выскользнёт с места.
    2. При прокручивании лигатуры в канавки держателя лигатуры, если она постоянно выскальзывает, либо углубляйте канавки, либо удлиняйте их дальше на внешнюю сторону кончика, чтобы создать «дорожку», в которой будет находиться нить.
    3. Проверьте, расположены ли два узла по центру (рисунок 6C) и ровны ли (прямая линия на рисунке 6D) при взгляде спереди держателя лигатуры; если нет, то одна канавка глубже другой.
    4. Проверьте, что лигатура находится прямо внутри выемок и не слишком глубоко; в противном случае существует повышенный риск того, что кончик держателя лигатуры соприкоснётся с мягкими тканями, что вызовет травму при установке лигатуры.
    5. С помощью стоматологического эксплорера (рисунок 6E) подтвердите, что лигатура возвращается на место без скольжения при приложении мягкой силы между узлами (это имитирует силу, которую она испытывает при установке лигатуры).

3. Размещение лигатуры

ПРИМЕЧАНИЕ: Возможно, что лигатуры могут быть размещены между мышиными зубами с добавлением пародонтальных патогеновчеловека 11. Временно-зависимый анализ микробного состава лигатуры (без добавления человеческих бактериальных видов) показал сдвиг в микробиомном сообществе (дисбиоз) в период развитияпародонтита 12. По этой причине замена лигатуры не рекомендуется, так как она может повлиять на воспроизводимость результата. Включение бактериальных видов в сочетании с лигатурой зависит от конкретного вопроса, рассматриваемого в конкретном исследовании. Из-за ожидаемой потери 10-15% перевязки11, лигатуры размещаются в обеих сторонах у одной мыши. Такой подход минимизирует потери мышей во время эксперимента.

  1. После того как мышь была анестезиирована с помощью ингаляционного изофлурана, её поместите в зубное ложе для мыши, положив спиной к кровати, а нос расположен рядом с носовым конусом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мышей следует анестезировать с помощью 4% (воль/воль) изофлурана. Испаритель изофлурана и кислород фильтруются с помощью воздушного фильтра толщиной 0,2 мкм. После полной анестезии и размещения мыши в мышиной стоматологической постели, её следует поддерживать с течением 1,5-2,5% через носовой конус. Мышей контролируют непроизвольные движения тела и частоту дыхания (~55-65 вдохов в минуту). Мышам с лигатурным пародонтитом не требуется анальгетик, так как это неинвазивная, нехирургическая процедура, аналогичная использованию зубной нитью человека. Ожидается, что размещение связки вызывает у мышей очень лёгкий дискомфорт (в основном из-за накопления бактерий между двумя зубами), но не требует использования обезболивающих. Осложнений после установки лигатуры обученным специалистом не ожидается.
  2. Используйте резинки, чтобы стабилизировать голову мыши и открыть ей рот.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Лента вокруг нижнечелюстных резцов также втягивает язык, и натяжение пассивное, чтобы открыть челюсть без натяжения. Визуализация моляров становится проще, когда источник света направлен под углом, чтобы тени не закрывали поле зрения. Мышиная зубная кровать была специально разработана для упрощённой модели мышей с пародонтитом, вызванной лигатурой. Расстояние между носом мыши и конусом необходимо для того, чтобы мышь могла немного двигаться телом во время экспериментальной процедуры. Это движение мыши позволяет правильно отслеживать манёвр руки оператора при использовании держателя для лигатуры и контролировать силу, используемую при размещении лигатуры. Установка лигатуры должна занимать 5-10 минут на мышь. Процедуры должны проводиться в хорошо проветриваемом капюшоне для проведения экспериментов на животных
  3. Чтобы разместить лигатуру справа, держите держатель лигатуры в правой руке, а исследователь — в левой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если узлы на лигатуре расположены не по центру между кончиками, а ближе к одному кончику, то лигатура может лучше расположить для размещения на определённой стороне. Например, если узлы расположены ближе к правому кончику держателя лигатуры, то эту завязку будет проще разместить с правой стороны.
  4. Аккуратно разместите кончик исследователя ниже межпроксимального контакта первого и второго моляров на небной стороне.
    1. Заставьте кончик исследователя сначала касаться зубов, затем скользить вниз и опираться на десны, чтобы избежать травмы мягких тканей; Положите рукоятку исследователя в горизонтальный угол после правильного положения.
    2. Обратите внимание, какой конец эксплорера используется для размещения справа, а какой — слева. Убедитесь, что кончик эксплорера зацепляется за проксимальную область контакта вверх, позволяя изгибу стрелки лежать по противоположной стороне, чтобы стабилизировать головку от реакционных сил при размещении.
  5. Используя держатель лигатуры в горизонтальном углу, втяните щёку, сначала разместив держатель лигатуры выше межпроксимального контакта между вторым и третьим молярам, прижав край держателя к щеке, чтобы сдвинуть его, а затем поставьте держатель лигатуры в место межпроксимального контакта первого и второго моляров.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг помогает гарантировать, что между лигатурой и зубами не застряла слизистая ощечь, что будет мешать размещению.
  6. После того как лигатура расположена над межпроксимальным контактом между первым и вторым молярами, поверните рукоятку держателя лигатуры до 45° и, сочетая мягкие покачивания и скольжение, протолкните связку через контакт.
  7. Перерезание лишней нити:
    1. Используйте тонкие игольчатые щипцы, чтобы зафиксировать лишнюю нить, прикреплённую к узлу справа, потянуть нитку через зубья влево, а с помощью слегка открытых ножниц скользить ножницами вниз по нитке, пока они не окажутся на расстоянии ~1,5 мм от узла перед резкой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это помогает снизить вероятность случайной слизистой травмы при разрезании излишка.
    2. Повторите всё выше с обратной направленностью для другого узла.
  8. Повторяйте шаги из версии 3.3. до 3.7.2. при размещении лигатуры на противоположной стороне рта.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется сбор лигатуры при жертвовании, так как сдвиг дисбиотики может изменяться при различных экспериментальных условиях,исследуемых 12. Для облегчения сбора мышей помещают в мышиное зубное ложе, вырезают один из узлов лигатуры, после чего аккуратно удаляют щипцем. Использование мышиного стоматологического ложа при сборе связки обеспечивает должную стабильность мыши и удобный доступ к месту завязывания.

4. Количественная оценка разрушения костей

  1. μCT анализ
    1. Откройте программу и нажмите на File | Импортировать изображение...
    2. Нажмите на «Просмотр » в всплывающем меню, перейдите в папку с файлами Dicom для одного сканирования и выберите первый файл.
    3. Нажмите «Извести », чтобы найти и выбрать другие файлы в папке, входящие в тот же отсканированный образец. Нажмите OK.
    4. После загрузки изображения нажмите Visualize и Isosurface.
    5. Измените порог изображения на 5 000 и коэффициент качественного качества поверхности (%) до 55.
    6. Галочки отмечены как Включить сглаживание изображения и Обрезание поверхности с текущей ROI и нажмите Обновить.
    7. Настройте свойства уровня , кликнув правой кнопкой мыши по окну/уровню внизу (рисунок 7A) и выберите Редактировать окно/Свойства уровня. Выберите значение плотности костей , которое будет стандартным для всех образцов. Чтобы следовать этому протоколу, используйте 2000 , но изменяйте его в зависимости от плотности костей образцов и сохраняйте постоянную для всех измерений.
    8. Для управления плоскостями:
      1. Используйте клавишные ярлыки I/J/K для скрытия/показа для трёх разных плоскостей.
      2. Кликните правой кнопкой мыши и переместите курсор, чтобы увеличить и уменьшить масштаб.
      3. Нажмите Shift , затем левой кнопкой мыши для панорамирования.
      4. Нажмите Срезать , чтобы переместить и повернуть плоскости.
      5. Кликните по центру плоскости, чтобы сдвинуть плоскость вперёд/назад, или разместите курсор в центре нужной плоскости и используйте стрелки вверх и вниз, чтобы двигать плоскость по одному кусочку за раз.
      6. Нажмите на край плоскости, чтобы повернуться вокруг линии, параллельной этому ребру в центре плоскости.
      7. Кликните по углу самолёта, чтобы повернуться вокруг самолёта.
    9. Ориентируйте ось z (синяя панель в верхней части экрана — z-срез) так, чтобы поверхности/формы всех трёх зубьев становились видимы одновременно (или максимально близко) (рисунок 7B).
    10. Прокрутите по этой же плоскости (синяя панель в верхней части среза экрана), чтобы корнипервого и второгомоляров были видны (рисунок 7C). Постарайтесь выбрать точку, достаточно глубокую по корням, чтобы можно было увидеть всю окружающую анатомию, а также там, где каналы выглядят чётко очерченными и расположены по прямой линии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Плоскость может потребоваться поворот для вертикальной ориентации каналов.
    11. Ориентируйте ось x (вертикальную зелёную линию в панели z-среза) так, чтобы она выровнялась с буккальными корнями1-го и2-го моляра (старайтесь выровнять через центральную часть каждого корня/канала, если возможно; иначе — через щечной кореньпервого моляра и дистобукальный корень второгомоляра ) (рисунок 7D).
    12. Используйте ориентацию x-среза в качестве ориентира для выравнивания y-среза (вертикальная синяя линия в панели x-среза).
      1. Выровняйте y-образный срез так, чтобы он был вертикально параллелен через корень первого моляра в панели x-среза (рисунок 7E). Поверните плоскость, чтобы ориентировать корень вертикально. Обратите внимание, что синяя линия проходит через середину корня.
        ПРИМЕЧАНИЕ: В зонах потери костной ткани (как и ожидается в этой модели) альвеолярный гребень может иметь дефект; Поэтому средняя линия корня должна быть оценена, поскольку окружающая кость может быть отсутствующей, чтобы идеально определить середину лунки.
    13. В панели с y-образным срезом измерьте расстояние от соединения цементоэмали (CEJ) до альвеолярного гребня кости (ABC), поместив курсор в самую глубинную точку канавки в CEJ и нажав на 1, а затем разместив курсор в ближайшей точке ABC и нажав на 2 , как показано (рисунок 7F). Перваячасть обозначается синей стрелкой, а вторая — зелёной стрелкой.
      1. Если стрелки не появляются, пока не выбраны обе точки, выберите их, наведя стрелку на нужные области и нажмите цифровые клавиши на клавиатуре, так как просто нажатие мыши не сработает.
      2. Если определить CEJ сложно, используйте стрелки вверх и вниз, чтобы прокрутить соседние срезы и подтвердить его местоположение.
      3. Измеряйте несколько точек ABC, если «ближайшую точку» трудно определить, чтобы подтвердить, что различия в измерениях практически отсутствуют.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы подтвердить правильное измерение, необходимо увидеть срезы x и z, пересекающиеся над нужным корнем, и визуально подтвердить измерение в 3D-виде, спрятав плоскости (рисунок 7F).
  2. Количественная оценка десенной экспрессии Rankl/OPG и Rankl/Rank
    1. Собирайте десневой ткань, как было описаноранее, 9.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Лучшие результаты экстракции РНК достигаются с использованием свежих образцов тканей, и очистка РНК должна быть обработана как можно скорее.
    2. Извлекайте РНК ткани десна, биясь с помощью используемого набора и керамических бусин. Следуйте инструкциям в наборе и храните образец при -80 °C до анализа с помощью qRT-PCR.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

aРепрезентативный анализ данных линейных альвеолярных костей у самок и самцов WT на исходном (здоровье) и через 9 дней после лигирования представлен на рисунке 1A. Расчёт мощности показывает, что для выявления различий между этими группами требуется всего 10 мышей (4-5 мышей на группу), если основным исходом является линейный уровень костей, измеряемый по μCT (рисунок 1B). Однако расчёт мощности для доклинических исследований тр...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Настоящее исследование предоставляет подробную информацию и подробные, пошаговые рекомендации по упрощённому протоколу модели мышей при пародонтите, вызванном лигатурой, ранеепредставленной 10. Детали, изложенные в текущей статье, могут существенно повлиять на воспроизводимость и подтверждаются опытом группы с этой конкретной моделью мышей с пародонтитом, вызванной лигатурой, 11,12,13,18,19,21.<...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Файлы STL, использованные для создания 3D-печатных устройств в предыдущей публикации9, находятся под соглашением об авторском праве с Университетом Северной Каролины в Чапел-Хилле («UNC-Mouse Surgical Bed and UNC-Ligature Holder» UNC Ref. No. 18-0024). Авторы не заявляют о конкурирующих финансовых интересах.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Исследование, представленное в этой публикации, было поддержано Национальным институтом стоматологических и краниофациальных исследований Национальных институтов здоровья под номерами K01DE027087 (JTM) и R01DE032830 (JTM). Работа также была поддержана Национальным институтом аллергии и инфекционных заболеваний Национальных институтов здравоохранения под номером R01-AI153265 (KVS). Содержание лежит исключительно на авторах и не обязательно отражает официальную точку зрения Национальных институтов здравоохранения. Кроме того, представленные здесь исследования также поддерживаются финансовым кодом программы Фулбрайта/CAPES 001 (TA).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
КлинокIntegra4-315CЛезвие 15C
Керамические бусиныVWR10158-6080,5 мл x 1,4 мм Керамические шарики
Клей/смольный материалКомпания Gorilla Glue8401519
Держатель для лигатуры (с вырезом)Ядро здания BeAM Design Center UNC at Chapel HillНе применимо118,01 мм x 13 мм x 13,74 мм
Замок держателя лигатурыЯдро здания BeAM Design Center UNC at Chapel HillНе применимо17,5 мм x 14,57 мм x 17,8 мм
Lulzbot mini v1.0 3D-принтер Lulzbot (Fargo Additive Manufacturing Equipment 3D, LLC)Не применимоAleph Objects, Lulzbot Mini v1.0 model
Программное обеспечение MicroViewParallax Innovations2.5.0-3139Программное обеспечение, используемое для измерений костей
Мышиная зубная кровать (с вырезами)Ядро здания BeAM Design Center UNC at Chapel HillНе применимо103,86 мм x 196,85 мм x 50,99 мм
Мышиная столешница для зубной кроватиЯдро здания BeAM Design Center UNC at Chapel HillНе применимо99,8 мм x 77 мм x 21,5 мм
Филамент из полимолочной кислоты (PLA)Дословно552593,0 мм PLA
Набор тканей РНК RapidpureMP Biomedicals112721050
Рукоятка лезвия скальпеляБард-Паркер371030Рукоятка скальпеля 15C
Швейный шёлкХирургический инструмент RobozSUT-15-1
Праймеры Taqman qPCRТермо ФишерРанг (Mm00437135_ м1), Ранкл (Mm00441906_ м1), Опг (Mm00435452_ м1), Гапдх (Mm99999915_g 1)
VX-765  InvivoGen, Сан-Диего, США#inh-vx765-1Ингибитор каспазы-1, используемый для модуляции хозяина

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Offenbacher, S. Periodontal diseases: pathogenesis. Ann Periodontol. 1 (1), 821-878 (1996).
  2. Alves, T., Swanson, K. V., Girnary, M. S., Freire, M., Moss, K., Divaris, K., Beck, J., Santos, P. C. P., Brickey, W. J., Wrobel, J. A., Min, H. Y., Syed, M., Morelli, T., Seaman, W. T., Preisser, J. S., Hu, D., Preisser, H., Makhanova, N., Susin, C., Vias, N. P., Styner, M., Zhang, S., Pirih, F. Q., Chang, J., Gill, H. S., Lietzan, A. D., Webster-Cyriaque, J., Ting, J. P. Y., Marchesan, J. T. Inflammasome targeting for periodontitis prevention is sex dependent. Proc Natl Acad Sci U S A. 122 (44), e2507092122(2025).
  3. Padial-Molina, M., et al. Methods to .validate tooth-supporting regenerative therapies. Methods Mol Biol. 887, 135-148 (2012).
  4. Hajishengallis, G. Illuminating the oral microbiome and its host interactions: animal models of disease. FEMS Microbiol Rev. 47 (3), fuad018(2023).
  5. Graves, D. T., Fine, D., Teng, Y. T., Van Dyke, T. E., Hajishengallis, G. The use of rodent models to investigate host-bacteria interactions related to periodontal diseases. J Clin Periodontol. 35 (2), 89-105 (2008).
  6. Hasturk, H., et al. RvE1 protects from local inflammation and osteoclast- mediated bone destruction in periodontitis. FASEB J. 20 (2), 401-403 (2006).
  7. Hasturk, H., et al. Phase IIa clinical trial of complement C3 inhibitor AMY-101 in adults with periodontal inflammation. J Clin Invest. 131 (23), e152973(2021).
  8. Maekawa, T., et al. Genetic and intervention studies implicating complement C3 as a major target for the treatment of periodontitis. J Immunol. 192 (12), 6020-6027 (2014).
  9. Maekawa, T., et al. Antagonistic effects of IL-17 and D-resolvins on endothelial Del-1 expression through a GSK-3beta-C/EBPbeta pathway. Nat Commun. 6, 8272(2015).
  10. Hajishengallis, G., Hasturk, H., Lambris, J. D. Contributing authors. C3-targeted therapy in periodontal disease: moving closer to the clinic. Trends Immunol. 42 (10), 856-864 (2021).
  11. Marchesan, J., et al. An experimental murine model to study periodontitis. Nat Protoc. 13 (10), 2247-2267 (2018).
  12. Ribeiro, A. A., et al. Oral biofilm dysbiosis during experimental periodontitis. Mol Oral Microbiol. 37 (6), 256-265 (2022).
  13. Jiao, Y., et al. Induction of bone loss by pathobiont-mediated Nod1 signaling in the oral cavity. Cell host & microbe. 13 (5), 595-601 (2013).
  14. Marchesan, J. T., et al. Role of inflammasomes in the pathogenesis of periodontal disease and therapeutics. Periodontol 2000. 82 (1), 93-114 (2000).
  15. Chadwick, J. W., Glogauer, M. Robust ligature-induced model of murine periodontitis for the evaluation of oral neutrophils. J Vis Exp. (155), e59667(2020).
  16. Collins, F. S., Tabak, L. A. Policy: NIH plans to enhance reproducibility. Nature. 505 (7485), 612-613 (2014).
  17. Landis, S. C., et al. A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research. Nature. 490 (7419), 187-191 (2012).
  18. Swanson, K. V., et al. Interferon activated gene 204 (Ifi204) protects against bone loss in experimental periodontitis. J Periodontol. 93 (9), 1366-1377 (2022).
  19. Sun, L., et al. IL-10 dampens an IL-17-mediated periodontitis-associated inflammatory network. J Immunol. 204 (8), 2177-2191 (2020).
  20. Offenbacher, S., et al. GWAS for Interleukin-1beta levels in gingival crevicular fluid identifies IL37 variants in periodontal inflammation. Nat Commun. 9 (1), 3686(2018).
  21. Apaza Alccayhuaman, K. A., et al. FasL is a catabolic factor in alveolar bone homeostasis. J Clin Periodontol. 50 (3), 396-405 (2023).
  22. Percie du Sert, N., et al. The ARRIVE guidelines 2.0: updated guidelines for reporting animal research. BMJ Open Sci. 4 (1), e100115(2020).
  23. Percie du Sert, N., et al. Reporting animal research: Explanation and elaboration for the ARRIVE guidelines 2.0. PLoS Biol. 18 (7), e3000411(2020).
  24. Marchesan, J. T. Inflammasomes as contributors to periodontal disease. J Periodontol. 91 Suppl (1), S6-S11 (2020).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

3D

Похожие статьи