Методическая статья

Трансляционная модель 3D-клеточной культуры для оценки влияния гипероксии на эпителиальные клетки дыхательных путей новорожденных

1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/65913

⸱

12 июля 2024 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Section of Neonatal-Perinatal Medicine, Center for Pregnancy and Newborn Health, University of Oklahoma Health Sciences Center, 2Department of Medicine, Section of Pulmonary, Critical Care & Sleep Medicine, University of Oklahoma Health Sciences Center

В этой статье

Краткое содержание

Мы описываем протокол создания модели культуры воздушно-жидкостного интерфейса (ALI) с использованием эпителиальных клеток дыхательных путей трахеи новорожденных (nTAEC) и выполняем физиологически значимое воздействие гипероксии для изучения влияния атмосферно-индуцированного окислительного стресса на клетки, полученные из развивающегося эпителия поверхности дыхательных путей новорожденных.

Аннотация

Эпителий дыхательных путей недоношенных новорожденных постоянно подвергается воздействию стрессоров окружающей среды. Одним из таких стрессоров у новорожденных с заболеваниями легких является напряжение кислорода (O2) выше, чем в окружающей атмосфере, что называется гипероксией (>21%O2). Влияние гипероксии на дыхательные пути зависит от различных факторов, включая стадию развития дыхательных путей, степень гипероксии и продолжительность воздействия, при этом вариабельное воздействие потенциально может привести к уникальным фенотипам. Несмотря на то, что были проведены обширные исследования влияния гипероксии на альвеоляризацию легких новорожденных и гиперреактивность дыхательных путей, мало что известно о краткосрочном и долгосрочном влиянии гипероксии на эпителиальные клетки дыхательных путей новорожденных человека. Основной причиной этого является нехватка эффективной модели in vitro для изучения развития и функции эпителия дыхательных путей новорожденных человека. В данной статье мы описываем метод выделения и расширения эпителиальных клеток дыхательных путей (nTAEC) трахеи человека у новорожденных с использованием аспиратов трахеи человека и культивирования этих клеток в культуре воздушно-жидкостного интерфейса (ALI). Мы демонстрируем, что nTAEC образуют зрелый поляризованный клеточный монослой в культуре ALI и подвергаются мукоцилиарной дифференцировке. Также представлен способ умеренного воздействия гипероксии на монослой клеток в культуре ALI с использованием специализированного инкубатора. Кроме того, мы описываем анализ для измерения клеточного окислительного стресса после воздействия гипероксии в культуре ALI с использованием флуоресцентного количественного анализа, который подтверждает, что умеренное воздействие гипероксии индуцирует клеточный окислительный стресс, но не вызывает значительного повреждения клеточной мембраны или апоптоза. Эта модель потенциально может быть использована для моделирования клинически значимого воздействия гипероксии, с которым сталкиваются неонатальные дыхательные пути в отделении интенсивной терапии новорожденных (ОИТН), а также для изучения кратковременного и долгосрочного воздействияО2 на программирование эпителия дыхательных путей новорожденных. Исследования с использованием этой модели могут быть использованы для изучения способов смягчения окислительного повреждения развивающихся дыхательных путей в раннем возрасте, которое связано с развитием долгосрочных заболеваний дыхательных путей у бывших недоношенных детей.

Введение

Терапевтический кислород (O2) является одним из наиболее часто используемых методов лечения в отделении интенсивной терапии новорожденных (ОИТН)1. Следовательно, воздействие гипероксии (>21%О2) является распространенным атмосферным стрессором, с которым сталкиваются новорожденные со значительными заболеваниями легких и без них. Реакция легких на гипероксию может варьироваться в зависимости от интенсивности и/или продолжительности воздействия, а также анатомического расположения, типа клеток и стадии развития легких 2,3,4,5,6. Основная часть исследований в области неонатального повреждения легких при гипероксии была сосредоточена на влиянии воздействия гипероксии в контексте постнатальной альвеоляризации для моделирования бронхолегочной дисплазии (БЛД) - наиболее распространенного хронического заболевания легких, поражающего недоношенных детей 6,7,8,9,10,11. Тяжесть ПРЛ классифицируется по объему респираторной поддержки и О2, необходимому через 36 недель после менструациив возрасте 9 лет. У большинства детей с ПРЛ клинические улучшения со временем по мере роста легких, причем большинство из них отказываются от респираторной поддержки до своего первого дня рождения. Независимо от тяжести БЛД после рождения, значимые заболевания, поражающие бывших недоношенных детей, включают в себя 5-кратное увеличение риска дошкольных хрипов, астму, рецидивирующие респираторные инфекции в детстве и раннее начало хронической обструктивной болезни легких 12,14,15,16,17,18,19. Влияние гипероксии на долгосрочное заболевание дыхательных путей и легочные инфекции у недоношенных детей было исследовано с использованием животных моделей in vitro и in vivo 20,21,22,23,24. Тем не менее, большинство из этих моделей были сосредоточены на роли мезенхимальной ткани, альвеолярного эпителия и гладких мышц дыхательных путей 25,26,27,28.

Поверхностный эпителий дыхательных путей выстилает весь путь дыхательной системы, простираясь от трахеи вниз до терминальной бронхиолы и заканчиваясь непосредственно перед уровнем альвеол29. Базальные клетки дыхательных путей являются первичными стволовыми клетками в эпителии дыхательных путей, обладающими способностью дифференцироваться во весь репертуар зрелых эпителиальных линий дыхательных путей, которые включают реснитчатые и секреторные клетки (булановые клетки: не продуцирующие слизь, и бокаловидные клетки: продуцирующие слизь)29,30,31,32. В исследованиях клеточных культур в контексте неонатального гипероксического повреждения легких в основном использовались клеточные линии рака взрослого человека или мыши33,34. Кроме того, в большинстве экспериментов in vitro использовались погруженные в воду системы культивирования, которые не позволяют дифференцировать клетки в мукоцилиарный эпителий дыхательных путей, напоминающий эпителий дыхательных путей in vivo у человека35. Следовательно, существует пробел в знаниях о влиянии повреждения легких, вызванного гипероксией, на развитие эпителиальных клеток дыхательных путей новорожденных людей. Одной из причин является нехватка трансляционных моделей для изучения влияния атмосферного воздействия на эпителий дыхательных путей новорожденных человека. Гипероксическое повреждение легких в раннем возрасте может привести к долгосрочному заболеванию дыхательных путей и повышенному риску инфекции, что приводит к изменяющим жизнь последствиям у бывших недоношенных детей 14,36,37. У невыживших младенцев с тяжелым БЛД эпителий поверхности дыхательных путей имеет отчетливые аномалии, включая гиперплазию бокаловидных клеток и нарушение развития ресничек, что указывает на аномальный мукоцилиарный клиренс и повышенную высоту эпителия, ставящую под угрозу калибр дыхательных путей38. В последнее десятилетие наблюдается повышенный интерес к культивированию первичных эпителиальных клеток дыхательных путей на границе воздушно-жидкостных соединений (ОПЛ) для изучения постнатального развития эпителия дыхательных путей 39,40,41,42. Тем не менее, модели ALI эпителиальных клеток дыхательных путей новорожденных не использовались в контексте моделей окислительно-восстановительных возмущений атмосферы, таких как воздействие гипероксии.

Используя ранее опубликованный метод39, мы использовали образцы аспирата трахеи новорожденных, полученные от интубированных новорожденных в отделении интенсивной терапии новорожденных, и успешно выделили и расширили первичные эпителиальные клетки дыхательных путей трахеи новорожденных (nTAEC). Мы использовали ингибиторы Rho, Smad, гликогенсинтазинкиназы (GSK3) и мишени рапамицина млекопитающих (mTOR) для увеличения способности к экспансии и задержки старения в этих клетках, как описано ранее39,42, что обеспечивает эффективное и последующее пассирование nTAECs. В протоколе описаны методы создания 3D культур ALI с использованием nTAECs и проведения воздействия гипероксии на монослои nTAEC. Ингибирование Rho и Smad используется в течение первых 7 дней культивирования ALI (дни ALI с 0 по 7), после чего эти ингибиторы удаляются из сред дифференцировки на оставшуюся часть времени культивирования ALI. Апикальная поверхность монослоя эпителиальных клеток дыхательных путей, культивируемых ALI, остается подверженной воздействию окружающейсреды43, что позволяет изучать атмосферные возмущения и очень напоминает патобиологию развивающихся неонатальных дыхательных путей, подвергшихся гипероксии in vivo. КонцентрацияО2, использованная в предыдущих исследованиях клеточных культур (независимо от иммортализованных или первичных клеток) при гипероксическом повреждении легких у новорожденных, значительно варьирует (в диапазоне от 40% до 95%), как и продолжительность воздействия (от 15 минут до 10 дней)36,44,45,46,47. В этом исследовании монослой клеток ALI подвергался воздействию 60%O2 в течение 7 дней с 7-го по 14-й день ALI (после удаления ингибиторов Rho/Smad из дифференцировочной среды). Воздействие гипероксии проводилось в раннюю-среднюю фазу мукоцилиарной дифференцировки (ОПЛ с 7 по 14 день) в отличие от полностью дифференцированного зрелого эпителия и, таким образом, симулировало развитие эпителия дыхательных путей in vivo у недоношенных детей. Такая стратегия воздействия сводит к минимуму риск острой токсичности О2 (которая ожидается при более высоких концентрацияхО2), в то же время продолжая оказывать окислительный стресс в физиологически значимом диапазоне, и напоминает критическое окно перехода от относительно гипоксической внутриутробной среды к гипероксической внешней среде у недоношенных новорожденных людей.

Протокол

Образцы аспирата трахеи новорожденных были собраны только после информированного согласия родителей, а протокол, используемый для сбора, транспортировки и хранения, был одобрен Институциональным наблюдательным советом (IRB) Центра медицинских наук Университета Оклахомы (IRB 14377).

1. Подготовка к выделению, пассированию и культуре ALI nTAEC

  1. Подготовка СМИ
    1. Бронхиальная эпителиальная среда для проходимых дыхательных путей (BLEAM) с ингибиторами (BLEAM-I): Приготовьте 500 мл (1 флакон, хранящийся при температуре 4 °C) BLEAM, добавив 1,25 мл добавки HLL (500 мкг/мл сывороточного альбумина человека, 0,6 мкМ линолевой кислоты, 0,6 мкг/мл лецитина), 15 мл L-глутамина (6 мМ), 2 мл экстракта P (0,4%, экстракт гипофиза крупного рогатого скота), 5 мл TM1 (1 мкМ адреналина, 5 мкг/мл трансферрина, 10 нМ трийодтиронина, 0,1 мкг/мл гидрокортизона, 5 нг/мл эпидермального фактора роста (EGF), 5 нг/мл инсулина), 1 мл раствора антибиотика (нормоцин, 0,1 мг/мл). Для предотвращения старения первичных клеток и повышения эффективности экспансии добавляют следующие ингибиторы фактора роста, как описано ранее39: Y-27632 (Rho-ассоциированная протеинкиназа или ингибитор ROCK) с конечной концентрацией 5 мкМ, A83-01 (ингибирует передачу сигналов Smad) с конечной концентрацией 1 мкМ, CHIR 99021 (ингибитор гликогенсинтазы-киназы-3 или GSK3) с конечной концентрацией 0,4 мкМ и рапамицин (ингибитор молекулярной мишени рапамицина или mTOR) с конечной концентрацией. концентрация 5 нМ. Фильтруйте фильтр через фильтр размером 0,22 мкм с размером пор. Список компонентов мультимедиа приведен в таблице 1 .
    2. Среда ALI для эпителиальных клеток бронхов/трахеи человека (HBTEC): Приготовьте 500 мл среды HBTEC, разморозив флакон при 37 °C и добавив 1 мл раствора антибиотика (нормоцин, 0,1 мг/мл). После добавления фильтрующий материал пропустите через фильтр размером 0,22 мкм с размером пор.
    3. Фильтрующий материал HBTEC с ингибиторами (HBTEC-I): Подготовьте фильтрующий материал HBTEC, как указано выше. Перед фильтрацией добавьте следующие ингибиторы: Y-27632 с конечной концентрацией 5 μМ и A83-01 с конечной концентрацией 0,5 μM. Фильтруйте фильтр через фильтр размером пор 0,22 μм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Храните фильтрующие материалы BLEAM-I, HBTEC и HBTEC-I при температуре 4 °C, датированном и маркированном, в темноте (завернутым в фольгу) и разогревайте только аликвоты того, что необходимо (срок годности 30 дней).
    4. HEPES/FBS: Добавьте 500 мл HEPES-буферизованного физиологического раствора и 88 мл FBS (конечная концентрация 15%). После добавления отфильтруйте раствор через фильтр размером поры 0,22 мкм и храните при температуре 4 °C, датируя и маркируя.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед применением нагрейте BLEAM, HEPES-FBS и Trypsin-EDTA до 37 °C (не менее 30 минут).
  2. Покрытие колб для культур и вкладышей для культивирования клеток ALI средой, кондиционированной 804G
    1. Готовьте клеточную 804G (эпителиальную клеточную линию мочевого пузыря крысы) матрично-кондиционированную среду, как описано ранее39.
    2. Покройте колбу для клеточных культур и вкладыши для клеточных культур средой, кондиционированной 804G, в течение не менее 4 ч в инкубаторе при температуре 37 °C с содержанием 5%CO2. В таблице 2 приведены количества среды, необходимые для покрытия различных культуральных колб и вкладышей для клеточных культур.

2. Выделение и размножение нТАЭК и подготовка к последующему культивированию ОЛИ

  1. Приобретайте свежий аспират трахеи (примерно 1 мл) во время рутинного отсасывания эндотрахеальной трубки интубированных новорожденных и собирайте аспират в ловушку слизи. Если объем аспирата недостаточен для достижения ловушки слизи, промойте отсасывающий катетер 1-3 мл стерильного физиологического раствора.
  2. Наклейте на образец этикетку и храните его в пакете с биологической опасностью на льду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы можно хранить на льду при температуре 4 °C не более 24 часов. Однако выход выше со свежими образцами.
  3. Транспортировка образца из отделения интенсивной терапии новорожденных в лабораторию. Смажьте колбу T25 средой, кондиционированной 804G, и подготовьтесь к инокуляции образца во время транспортировки аспирата трахеи в лабораторию.
  4. Извлеките ловушку для слизи из пакета с биологически опасными веществами и тщательно очистите внешние поверхности 70% этанолом, чтобы избежать загрязнения. Осторожно откройте колпачок на ловушку слизи под стерильным клеточно-культуральным колпаком.
  5. Разведите образец аспирата трахеи стерильным PBS до 5 мл (для разжижения слизи) и перенесите все содержимое в коническую пробирку объемом 50 мл.
  6. Центрифугируйте пробирку при температуре 250 x g, 20 °C-23 °C в течение 5 минут и выбросьте надосадочную жидкость (включая слизь).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все центрифугирования здесь проводятся при температуре 250 x g, 20 °C-23 °C в течение 5 минут, если не указано иное.
  7. Ресуспендируйте гранулу в 5 мл BLEAM-I.
  8. Извлеките колбу T25 из инкубатора и выбросьте кондиционированный фильтрующий материал 804G перед нанесением покрытия на образец.
  9. Поместите образец в колбу T25 и поместите в инкубатор при температуре 37 °C, 5%CO2 (это будет называться Passage 0 или P0).
  10. Меняйте носители с помощью BLEAM-I через 24 часа после нанесения покрытия для вымывания неприкрепленных элементов и в последующем каждые 48 часов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После обработки образца аспирата трахеи и его инкубации в среде BLEAM-I через 7-10 дней после осаждения появляются клетки кубовидной формы. Примерно через 3 недели после осаждения клетки плотно упаковываются и требуют трипсинизации для последующего пассирования, расширения и хранения. Клетки раннего пассажа (P1 - P2) помещают в криопробирки (2,5 х 106 клеток на 500 мкл замораживающей среды на криопробирку) и хранят в жидком азоте для длительного хранения.
  11. Быстро разморозьте замороженные клетки из жидкого азота на водяной бане при температуре 37 °C и перенесите клеточную суспензию в стерильную пробирку соответствующего размера, содержащую BLEAM-I.
  12. Подсчитайте клетки для определения общего и живого количества клеток с использованием трипанового синего пятна и автоматического или ручного счетчика клеток, как описано ранее48. Разбавьте клеточную суспензию соответствующим объемом BLEAM-I, чтобы конечная концентрация составляла 2,1 х 106 клеток в 15 мл клеточной суспензии (для колбы Т75).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для колбы T25 обычно используется 0,7 x 106 клеток в 5 мл клеточной суспензии.
  13. Перенесите клеточную суспензию объемом 15 мл в колбу T75 и инкубируйте в течение ночи при 37 °C, 5%CO2.
  14. На следующее утро обменяйте носители на новые BLEAM-I. Затем меняйте носители на новый BLEAM-I каждые 2 дня. Как только клетки достигают 80-90%, они готовы к трипсинизации для культивирования ОПЛ.
  15. Нанесите 5 мл трипсина-ЭДТА (Т75) на монослой клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не забывайте использовать свежий трипсин. Избегайте использования трипсина, который был нагрет несколько раз.
  16. Инкубировать колбу при температуре 37 °C в течение 5 минут в инкубаторе. Затем постучите по боковой стороне колбы в 8-10 раз, чтобы сместить ячейки. Проверьте под микроскопом, чтобы убедиться, что клетки были смещены после трипсинизации. Если на колбе осталось >50% клеток, промойте PBS 2x и повторите этап трипсинизации с уменьшенным временем инкубации на 2-3 минуты.
  17. Остановите реакцию с помощью 15 мл HEPES-FBS и проводите пипетку вверх и вниз в 4-5 раз. Переложите клетки в стерильную пробирку соответствующего размера и центрифугируйте при давлении 250 x g в течение 5 минут, чтобы гранулировать клетки.
  18. После центрифугирования осторожно отсасывайте надосадочную жидкость. Растворите клеточную гранулу в 1 мл BLEAM-I, осторожно пипетируя вверх и вниз в 5-10 раз.
  19. Подсчитайте ячейки, чтобы определить общее и активное количество клеток. Разбавьте клеточную суспензию соответствующим объемом BLEAM-I, чтобы конечная концентрация составляла 1 x 105 живых клеток на 100 мкл клеточной суспензии.

3. Культура ALI nTAECs

ПРИМЕЧАНИЕ: Вкладыши для клеточных культур должны быть покрыты средой, кондиционированной 804G, и инкубироваться в течение не менее 4 ч при 37 °C, 5%CO2 перед следующим этапом (см. шаг 1.2).

  1. Извлеките из инкубатора 24-луночные планшеты для клеточных культур, содержащие вкладыши для клеточных культур, и выбросьте среды, подготовленные по стандарту 804G.
  2. Добавьте 1 мл BLEAM-I в базолатеральную (нижнюю) камеру каждой лунки ALI. Добавьте 100 мкл клеточной суспензии (1 x 105 клеток) в апикальную камеру вкладышей для клеточных культур ALI и инкубируйте клетки при 37 °C, 5%CO2. Этот этап определяется как день -2 ALI.
  3. На следующий день замените среду в базолатеральной (1 мл) и апикальной (100 мкл) камерах свежим BLEAM-I. При смене среды в апикальной камере будьте осторожны, чтобы не потревожить монослой клетки. Этот этап определяется как день -1 ALI.
  4. На следующий день удалите среду как из базолатеральной, так и из апикальной камер.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клеткам на мембране клеточной культуры требуется 2 дня, чтобы слиться в условиях погружения. На этом этапе может быть установлен ALI.
  5. Добавьте 1 мл среды HBTEC-I в базолатеральную камеру, но оставьте среду апикальной камеры свободной и подверженной воздействию воздуха. Этот этап определяется как день 0 ALI.
  6. Продолжайте заменять среду HBTEC-I (1 мл) в базолатеральной камере каждые 48 ч с 0-го по 6-й день ALI. Переключитесь на обычную среду HBTEC (без ингибиторов) на 7-й день ALI до желаемого момента сбора урожая.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В течение первых 7 дней культивирования ОЛИ среда из базолатеральной камеры может просачиваться в апикальную камеру. Эту среду необходимо тщательно отсасывать каждый день, чтобы поддерживать здоровье клеточного слоя и позволять им дифференцироваться.
  7. Сбор клеток, вставки клеточных культур и базолатеральные среды в разные моменты времени для молекулярных методов, анализов и анализа.
    1. Для этого протокола на 0, 7 и 28 день ALI собирают клетки для анализа экспрессии генов qPCR (стандартный протокол производителя) маркеров дифференцировки эпителия. На 0, 7, 14 и 28 день ALI собирают вставки для клеточных культур для тестирования барьерной функции (методы, описанные ниже).
    2. На 0-й и 28-й дни ALI используйте фиксированные формалином вставки для иммунофлуоресцентного окрашивания маркерами дифференцировки эпителия (с использованием ранее опубликованного протокола)49. На 14-й день ALI собирают базолатеральные среды для высвобождения лактатдегидрогеназы (ЛДГ) (стандартный протокол производителя), лизаты клеток для количественной ПЦР маркеров окислительного стресса и иммуноблот с антителами к каспазе-3 и расщепленной каспазе-3 (стандартный протокол производителя), а также вставки для клеточных культур для анализа окислительного стресса (метод описан ниже).

4. Проверка барьерной функции при дифференцировке ALI

  1. Измерение трансэпителиального электрического сопротивления (TEER)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Измерьте TEER с помощью эпителиального вольт-омметра (EVOM) во время дифференцировки ALI для оценки целостности клеточного слоя50.
    1. Перед измерением значений сопротивления тестового фильтра используйте кондиционированную 804G клеточную культуру с покрытием из среды (без каких-либо клеток) для измерения значения фонового сопротивления в Омах (Ω)
    2. Вычтите значение фонового сопротивления из значений сопротивления тестового фильтра и умножьте разницу на площадь поверхности роста ячейки, чтобы получить значение TEER для каждого тестового фильтра.
      TEER = (ΩT - ΩB) X C
      TEER = Электрическое сопротивление трансэпителия (Ω,см2)
      ΩT = Значение сопротивления фильтра (Ω)
      ΩB = значение фонового сопротивления (Ω)
      C = площадь поверхности роста клеток (см2)
      Вставки для клеточных культур, используемые для измерений TEER, впоследствии фиксируют 10% буферным формалином и немедленно используют для иммунофлуоресцентного окрашивания и флуоресцентной микроскопии (метод, описанный ниже) или хранят при температуре 4 °C для последующего окрашивания.
  2. Флуоресцеин исетионат декстран (FITC-декстран) анализ проницаемости эпителия
    Примечание: Анализ проницаемости эпителия проводили с использованием двух различных молекулярных масс FITC-декстрана (10 кД и 20 кДа) во время дифференцировки ALI.
    1. Приготовьте рабочий раствор FITC-декстрана (1 мг/мл): отмерьте 5 мг FITC и смешайте с 1 мл ДМСО (5 мг/мл). Ресуспендируйте массу 5 мг/мл в среде HBTEC, нагретой до 37 °C до концентрации 1 мг/мл. Берегите раствор от света.
    2. Перенесите тестовые фильтры (содержащие ячейки) на новый 12-луночный планшет и добавьте 1 мл фильтрующего материала HBTEC в базолатеральный отсек.
    3. Аспирируйте апикальные компартментные среды (если таковые имеются) и замените 250 мкл рабочего раствора FITC-декстрана. Инкубировать при комнатной температуре, защищенной от света, в течение 60 минут.
    4. Завершите анализ ФИТК-декстран, удалив тестовые фильтры (содержащие рабочий раствор ФИТК-декстран) с 12-луночного планшета.
    5. Соберите базолатеральную среду с 12-луночного планшета в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл и вортекс.
    6. Перенесите 100 мкл аликвот из каждой пробирки на 96-луночный микропланшет из черного полистирола с прозрачным дном в трех экземплярах. Переведите 100 мкл среды HBTEC в дополнительные лунки в 96-луночном планшете в качестве отрицательного контроля для измерения фоновой флуоресценции.
    7. Измерение интенсивности флуоресценции с помощью спектрофотометра с использованием максимумов возбуждения 490 нм и излучения 520 нм.
    8. Вычтите среднее значение фоновой флуоресценции из значений флуоресценции тестового фильтра, чтобы получить скорректированную флуоресценцию, и выразите значения в процентах от скорректированных значений флуоресценции в 0-й день ALI для FITC 10 кД и 20 кДа.

5. Воздействие на гипероксию с помощью инкубатора TriGas

  1. На 7-й день ALI определите количество вставок для клеточных культур, которые должны быть введены в гипероксию, исходя из потребностей эксперимента и урожая.
  2. Установите уровень O2 в инкубаторе TriGas на 60 % O2. Обычно требуется ~30-45 минут, чтобы уровень O2 достиг 60%.
  3. Как только уровеньО2 стабилизируется на уровне 60%, поместите в инкубатор 24-луночный планшет для клеточных культур со вставками для клеточных культур, отнесенными к группе гипероксии, и закройте дверцу инкубатора.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг должен быть выполнен как можно эффективнее, чтобы предотвратить значительное падение уровняО2 внутри инкубатора.
  4. Меняйте среду во вставках клеточных культур, подвергшихся воздействию гипероксии, следуя тому же графику, что и в контрольных лунках (с экспозицией 21%O2 ). Ежедневно проверяйте вставки для клеточных культур на предмет утечки среды и аккуратно отсасывайте любую утечку в камеру для клеточных культур.
  5. Продолжайте воздействие гипероксии в течение 7 дней (ALI с 7 по 14 день). После завершения воздействия гипероксии соберите клетки или проведите анализы с использованием вставок клеточных культур на 14-й день ОИМ.

6. Анализ окислительного стресса для оценки эффектов гипероксии

ПРИМЕЧАНИЕ: Мы использовали набор для анализа CM-H2DCFDA и измерили интенсивность флуоресценции на 14-й день ALI в качестве маркера окислительного стресса во вставках клеточных культур после воздействияO2 . H2DCFDA представляет собой химически восстановленную и ацетилированную форму 2',7'-дихлорфлуоресцеина (DCF), которая является индикатором активных форм кислорода (АФК), проходящих через живые клетки. CM-H2DCFDA представляет собой тиол-реактивное хлорметилпроизводное H2DCFDA, которое способствует дальнейшему ковалентному связыванию с внутриклеточными компонентами, обеспечивая более длительное удержание красителя в клетке. Эти молекулы являются нефлуоресцентными до тех пор, пока ацетатные группы не будут удалены под действием внутриклеточных эстераз, и в клетке51 не произойдет окисление. После внутриклеточного окисления результирующее увеличение флуоресценции может быть измерено с помощью флуоресцентного микроскопа в качестве суррогатной меры клеточного окислительного стресса52. Реагент светочувствителен и чувствителен к воздуху, поэтому его необходимо защищать от света и поддерживать герметичность, насколько это возможно.

  1. Приготовление раствора для анализа CM-H2DCFDA: Каждый флакон содержит 50 мкг красителя-реагента в порошкообразном виде. Чтобы приготовить стоковый раствор массой 1 мМ, добавьте во флакон 80 мкл стерильного ДМСО, хорошо перемешайте пипеткой и осторожно перемешайте. Для конечной концентрации красителя в 1 мкМ во вставках для клеточных культур добавьте 0,1 мкл 1 мМ запаса на 100 мкл PBS (например, добавьте 0,6 мкл исходного раствора к 600 мкл PBS для 6 вставок для клеточных культур).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Конечная концентрация красителя может варьироваться в пределах 1-5 μМ. Доза должна быть оптимизирована для каждого условия культивирования.
  2. Добавьте 100 мкл раствора красителя 1 мкМ в каждую культуру клеток как для группы, подвергшейся воздействию гипероксии, так и в группе, подверженной воздействию нормоксии. Используйте не менее 1 клеточной культуры в качестве отрицательного контроля из каждой группы лечения (100 мкл PBS без красителя). Выдерживать при температуре 37 °C в течение 30 минут в защищенном от света месте. Постирайте 1x с PBS.
  3. Подготовка предметного стекла: Слейте излишки PBS. Осторожно удерживайте вставки для клеточных культур и с помощью лезвия медленно вырезайте мембрану клеточной культуры. Налейте на затвор 1-2 капли монтажной жидкости. С помощью щипцов с плоским наконечником осторожно удерживайте угол мембраны, положите его клеточной стороной вниз на монтант и накройте покровным листом. Удалите излишки жидкости и дайте высохнуть на воздухе в течение 15 минут при комнатной температуре в защищенном от света месте. Теперь слайды готовы к изображению.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка предметного стекла и флуоресцентная микроскопия должны быть выполнены как можно быстрее, так как интенсивность флуоресценции значительно снижается в течение 2-3 часов.
  4. Флуоресцентная микроскопия: Получение изображений с помощью флуоресцентного микроскопа с использованием канала Cy2 (цианина-2). Получение изображений из трех отдельных, не перекрывающихся областей для каждой клеточной культуры.
  5. Флуоресцентное детектирование окислительного стресса
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте изображения флуоресцентной микроскопии для измерения скорректированной общей флуоресценции клеток (CTCF) с помощью программного обеспечения ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) и рабочего процесса, описанного ниже. CTCF служит маркером окислительного стресса во вставках клеточных культур после воздействия гипероксии и измеряется путем устранения фоновой флуоресценции с помощью программного обеспечения ImageJ.
    1. Откройте микроскопическое изображение в программе ImageJ и выберите интересующую область с помощью инструмента «Прямоугольник». Сохраните область выбора (α), щелкнув правой кнопкой мыши, и выберите Добавить в менеджер ROI (область интереса). Используйте эту область выделения для всех изображений.
    2. Выберите параметры для измерения в разделе «Анализ» > «Установить измерения » и выберите «Площадь», «Интегрированная плотность» и «Среднее значение серого » на вкладке настроек.
    3. Для каждого изображения используйте одну и ту же область выбора в менеджере ROI и выберите «Анализировать > измерять». Интегральное значение плотности представляет собой общую флуоресценцию (Ft) выбранной области. Запишите значения измерений во всплывающем окне.
    4. Чтобы скорректировать флуоресценцию фона (Fb) на каждом изображении, выделите небольшую область нефлуоресцентной области с помощью инструмента «Прямоугольник». Выберите Анализ > Измерить для этого региона. Среднее значение интенсивности представляет собой Fb. Запишите значения измерений во всплывающем окне.
    5. Рассчитайте CTCF, умножив среднюю интенсивность флуоресценции фоновых показаний на общую площадь ROI и вычтя это число из интегрированного значения плотности ROI. Повторите этот процесс для всех изображений для обеих групп лечения (контрольная и гипероксия).
      CTCF = Ft - (Fb x α)
      CTCF = Скорректированная общая флуоресценция клеток (A.M.)
      Ft = общая флуоресценция
      Fb = фоновая флуоресценция
      α = Область выбора

Результаты

Чтобы выделить nTAEC, мы собрали аспираты трахеи у интубированных новорожденных в отделении интенсивной терапии новорожденных и транспортировали аспираты на льду в лабораторию для дальнейшей обработки (рис. 1A). После посева образцов аспирата трахеи в питательную среду для эпителия дыхательных путей (BLEAM-I, содержащий Rho/Smad, GSK3 и ингибиторы mTOR) кубовидные клетки появлялись в течение 7-10 дней. К 14 дням клетки были на 50-60% слиты, и примерно через 21 день после осаждения клетки были плотно упакованы и нуждались в трипсинизации для последующего пассирования и экспансии. Серийные пассажи этих ячеек (до P3) были криоконсервированы в жидком азоте для длительного хранения. Затем клетки (≤ проход 3) размораживали для культивирования ОИМ.

nTAEC культивировали в ALI после того, как они достигали примерно 80%-90% конфлюенции в планшете T75 в погруженных условиях. Мы проводили иммунофлуоресцентное окрашивание монослоя nTAEC на 0-й день ALI базальными клеточно-специфическими маркерами - цитокератином-5 (KRT5)53 и опухолевым белком p63 (TP63)54 (рис. 1B). На 0-й день ALI почти все клетки являются KRT5 и TP63-положительными, что указывает на фенотип базальных клеток дыхательных путей с минимальной дифференцировкой. После того, как ALI был установлен, TEER измеряли с помощью EVOM (рис. 1C) и быстро увеличивали на ранней фазе культивирования ALI (ALI день с 0 по 7), поскольку nTAECs начали образовывать зрелый поляризованный клеточный монослой, с последующим плато TEER между 7-м и 28-м днем ALI (рис. 1D). Кроме того, для оценки парацеллюлярной проницаемости во время дифференцировки ALI был использован FITC-декстран двух молекулярных масс (10 кДа и 20 кДа), который показал общее постепенное снижение флуоресценции с течением времени (рис. 1E). Это коррелирует с формированием зрелого клеточного монослоя при дифференцировке ALI с уменьшением проницаемости для растворенных веществ. 

Во время культивирования ALI базальные клетки дифференцируются в зрелые эпителиальные линии, которые включают реснитчатые клетки, клубные клетки, не секретирующие слизь, и бокаловидные клетки, секретирующие слизь39. Анализ экспрессии генов зрелых эпителиальных клеточных маркеров на 0-й день ОПЛ показал минимальную или отсутствующую экспрессию белка вилочной коробки J155 (FOXJ1, реснитчатый клеточный маркер), утероглобина56 (SCGB1A1, маркер клубовых клеток) и муцин-5AC57 (MUC5AC, маркер бокаловидных клеток; Рисунок 2А) с последующим увеличением (7 и 28 день ОПЛ), что свидетельствует о дифференциации в эти подтипы зрелых эпителиальных клеток дыхательных путей во время культивирования ОПЛ. Кроме того, мы провели иммунофлуоресцентное окрашивание на 28-й день ALI с использованием маркеров зрелых эпителиальных клеток и количественной дифференцировки эпителия, состоящей из ацетилированных тубулиновых58 (TUBA4A) положительных реснитчатых клеток (~22%), SCGB1A1 положительных клубных клеток (~13%) и MUC5AC положительных бокаловидных клеток (~3%), а остальное — KRT5-положительные базальные клетки (~51%) и другие редкие типы клеток (рис. 2B).

Ингибиторы Rho и Smad использовали в течение первых 7 дней культивирования ОЛП (дни ОЛП с 0 по 7), а затем удаляли из среды дифференцировки на оставшуюся часть времени культивирования ОЛП (рис. 3А). Апикальная поверхность монослоя клетки во время культивирования ALI подвергается воздействию воздуха, что позволяет проводить исследования атмосферных возмущений. Воздействие гипероксии на монослой клеток проводили с 60%O2 непрерывно в течение 7 дней с 7-го по 14-й день ОПИ с использованием инкубатора TriGas. Контрольную группу содержали в отдельном инкубаторе с облучением комнатным воздухом (21%О2). Учитывая намерение в будущем изучить долгосрочные последствия (через 1-2 недели после завершения воздействияO2) воздействияO2 на развитие и регенерацию эпителия дыхательных путей, было важно, чтобы воздействиеO2 не приводило к острой цитотоксичности или повреждению мембраны до такой степени, что оно значительно разрушает монослой клеток ALI. Для оценки повреждения клеточной мембраны мы измерили высвобождение ЛДГ в базолатеральной среде на 14-й день ОПП, которое не показало существенной разницы между гипероксией и культурами, обработанными комнатным воздухом (рис. 3B). Для дальнейшей оценки того, были ли цитотоксические эффекты отO2 достаточно значительными, чтобы индуцировать апоптоз у нТАЭК, мы проводили иммуноблоттинг для общей каспазы-3 и расщепленной каспазы-359 на клеточных лизатах, полученных из гипероксии и группах, подвергшихся воздействию комнатного воздуха, на 14-й день ОПП (рис. 3C). Общая экспрессия каспазы-3 была сопоставима между двумя группами, а расщепленная экспрессия каспазы-3 не была обнаружена, что позволяет предположить, что 7дней 60% воздействия О2 не индуцировали апоптоз в нТАЭК на 14-й день ОПЛ. Кроме того, был разработан положительный контроль с инкубацией нТАЭК в течение ночи в условиях погружения с увеличением концентраций ставроспорина (0,5 мкМ, 1 мкМ и 2 мкМ), цитотоксического агента и индуктора апоптоза. Иммуноблоттинг для экспрессии общей каспазы-3 и расщепленной каспазы-3 подтвердил успешную индукцию апоптоза. Для измерения окислительного стресса, вызванного воздействием 60%O2, был проведен анализ клеточного окислительного стресса с измерением интенсивности флуоресценции на монослоях клеток nTAEC на ALI 14 (рис. 3D). Воздействие гипероксии вызывало значительное увеличение интенсивности флуоресценции (рассчитанной с помощью скорректированной общей флуоресценции клеток или CTCF) по сравнению с клетками, подвергшимися воздействию комнатного воздуха, что свидетельствует о повышенном клеточном окислительном стрессе. Анализ экспрессии генов антиоксидантов показал, что 60%O2 вызывали повышение регуляции этих антиоксидантных генов на 14-й день ALI, при этом каталаза, SOD1, SOD2 и GPX3 были значительно повышены (рисунок 3E).

figure-results-1
Рисунок 1: Эпителиальные клетки дыхательных путей трахеи новорожденных (nTAEC) были успешно выделены из аспиратов трахеи новорожденных и культивированы на границе раздела воздух-жидкость (ALI). (A) nTAEC, выделенные с помощью аспирации трахеи от интубированных новорожденных, были пассированы в погруженном состоянии с последующим культивированием ALI. (B) Клетки были собраны на 0-й день ALI для иммунофлуоресцентного окрашивания базальными клеточными маркерами дыхательных путей - KRT5 (красный) и TP63 (красный). Ядра окрашены в синий цвет с помощью DAPI. Масштабная линейка = 50 мкм. (C) Измерение трансэпителиального электрического сопротивления (TEER) во вставках клеточных культур с помощью эпителиального вольт-омметра (EVOM). (D) TEER измеряли во время дифференцировки ALI. Данные представлены в виде среднего значения (n=2 доноров, 5-10 скважин на донора в каждой временной точке). (E) Анализ трансэпителиальной проницаемости флуоресцеина изотиоцианат-декстрана (FITC-декстрана) был проведен во время дифференцировки ALI с использованием двух различных молекулярных масс FITC-декстрана (10 кД и 20 кДа). В апикальную камеру добавляли раствор ФИТК-декстрана (10 кД или 20 кДа), а вкладыши для клеточных культур инкубировали при комнатной температуре в течение 60 мин. Флуоресценцию в средах базолатеральной камеры измеряли спектрофотометрическим методом в 96-луночных планшетах. Фоновая флуоресценция (среда HBTEC) была вычтена из тестовых измерений для получения скорректированного значения флуоресценции (выраженного в процентах по сравнению со значениями дня 0). Данные представлены в виде среднего значения (n=2 доноров, по три лунки на донора в каждой временной точке для каждой молекулярной массы ФИТК-декстрана). Погрешности указывают на SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-2
Рисунок 2: Эпителиальные клетки дыхательных путей трахеи новорожденных (nTAEC) подвергаются мукоцилиарной дифференцировке во время культивирования воздушно-жидкостного интерфейса (ALI). (A) Клетки собирали на 0, 7 и 28 день ALI для количественного ПЦР-анализа эпителиальных клеточно-специфических маркеров: цитокератин-5 (KRT5) для базала, вилочный бокс-белок J1 (FOXJ1) для реснитчатых, утероглобин (SCGB1A1) для булавы и муцин-5AC (MUC5AC) для бокаловидных клеток. Относительную экспрессию каждого гена определяли методом δCt с GAPDH в качестве эндогенного контроля. Данные представлены в виде среднего значения (от n = 3 доноров, по три скважины на донора за временную точку). Статистический анализ проводился с использованием двустороннего ANOVA с апостериорным анализом Тьюки, *p=0.0114, ***p=0.0005, ***p<0.0001. (B) Иммунофлуоресцентное окрашивание базальных (KRT5, красных), реснитчатых (ацетилированный тубулин или TUBA4A, зеленых), булавовидных (SCGB1A1, красных) и бокаловидных (MUC5AC, зеленых) клеток проводили на 28-й день ALI для количественной оценки дифференцировки эпителия. Ядра окрашены в синий цвет с помощью DAPI. Данные по проценту (%) положительных клеток представлены в виде среднего значения (n=2 донора, две вставки клеточных культур на донора, 6-8 неперекрывающихся изображений на предметном стекле, минимум 3000 клеток на предметном стекле). Шкала имеет значение SEM. Масштабная линейка = 50 мкм.  Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: Гипероксия индуцирует клеточный окислительный стресс в эпителиальных клетках дыхательных путей трахеи новорожденных (nTAEC), но не вызывает значительного повреждения клеточных мембран или апоптоза. (A) Экспериментальный график воздействия гипероксии nTAECs с использованием инкубатора Trigas. Воздействие кислорода начинали после того, как ингибиторы были удалены из дифференцировочной среды на 7-й день ОПП и продолжалось в течение 7 дней (ОЛП с 7 по 14 день). (B) Базолатеральная среда была собрана для анализа высвобождения ЛДГ для оценки повреждения клеточной мембраны между комнатным воздухом (контроль) и группой, подвергшейся воздействию 60% О2 (гипероксия) на 14-й день ОПЛ. Данные представлены в виде отдельных точек данных (скорректированная абсорбция) линиями, обозначающими среднее значение для каждой группы, n=3 доноров, обозначенных черными кружками, квадратами и треугольниками с четырьмя лунками на донора соответственно. Статистический анализ проводили с использованием непарного t-критерия, p=0,6184. (C) Клетки были собраны на 14-й день ALI, и был проведен иммуноблоттинг на маркеры апоптоза (каспазы-3 и расщепленные каспазы-3) для сравнения реакции между комнатным воздухом и nTAEC, подвергшимися воздействиюO2. Положительный контроль для анализа был разработан путем инкубации nTAECs в течение ночи со ставроспорином (Stau 0,5 μM, 1 μМ и 2 μM) или контролем транспортного средства (Veh Ctrl) в условиях погружения в культуру. Клетки собирали на иммуноблот с общей каспазой-3 и расщепленными антителами к каспазе-3. Денситометрия проводилась с использованием α-тубулина в качестве гена-домохозяйки. Данные представлены в виде средних значений (от n=2-3 доноров, от одной до двух лунок на одного донора). Полосы погрешностей указывают на SEM. Непарный t-критерий был использован для сравнения экспрессии общей каспазы-3 между воздухом в помещении и группой с 60%O2 , p=0,4. Однофакторный ANOVA использовали для сравнения экспрессии общей каспазы-3 и расщепленной каспазы-3 между группами, подвергшимися воздействию Veh Ctrl и Stau, *p<0,05, ***p<0,0005. (D) Анализ CM-H2DCFDA на клеточный окислительный стресс проводили на 14-й день ALI с использованием вставок для клеточных культур, собранных из комнатного воздуха и подвергшихся воздействию O2 nTAEC. Показаны репрезентативные флуоресцентные микроскопические изображения комнатного воздуха (контроль) и вставок с 60%O2 (гипероксия), подвергшихся воздействию клеточных культур. Скорректированная общая флуоресценция клеток (CTCF) была рассчитана для сравнения клеточного окислительного стресса между комнатным воздухом и nTAEC, подвергшимися воздействию 60%O2. Данные CTCF представлены в виде отдельных точек данных с линией, обозначающей общее среднее значение для каждой группы, 6-7 изображений/группа от 2 отдельных доноров (черные круги и квадраты) с двумя лунками на донора. Статистический анализ проводили с использованием непарного t-критерия, *p<0,05. Масштабная линейка = 50 мкм. (E) Клетки были собраны на 14-й день ALI из комнатного воздуха, и были проведены лунки, подвергшиеся воздействию гипероксии, для количественного ПЦР-анализа генов окислительного стресса, включая каталазу, супероксиддисмутазу 1 и 2 (SOD1 и SOD2), глутатионпероксидазу 1, 2 и 3 (GPX1, GPX2 и GPX3). Данные по изменению кратности каждого гена определяли методом δCt с 18s рРНК в качестве эндогенного контроля. Данные представлены в виде среднего значения (от n=3 доноров, по две лунки на одного донора). Статистический анализ проводился с использованием непарного t-критерия, *p<0.05, **p=0.006.  Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Мультимедийная составляющаяКоличествоКонечная концентрация
БЛЕАМ-I
BLEAM медиа500 мл
Пищевая добавка HLL1,25 мл500 мкг/мл сывороточного альбумина человека
0,6 μМ линолевая кислота; 0,6 мкг/мл лецитина
L-глютамин15 мл6 мМ
Извлечение P2 мл0,4% экстракт гипофиза крупного рогатого скота
ТМ15 мл1 мкМ адреналина; 5 мкг/мл трансферрина
10 нМ трийодтиронин; 0,1 мкг/мл гидрокортизона
5 нг/мл Эпидермальный фактор роста (EGF)
5 нг/мл инсулина
Нормоцин1 мл0,1 мг/мл
У-27632Может варьироваться в зависимости от номера лота5 мкМ
А83-01Может варьироваться в зависимости от номера лота1 мкМ
ЧHIR 99021Может варьироваться в зависимости от номера лота0,4 μМ
РапамицинМожет варьироваться в зависимости от номера лота5 нМ
HBTEC
Медиа HBTEC500 мл
Нормоцин1 мл0,1 мг/мл
HBTEC-I
Медиа HBTEC500 мл
Нормоцин1 мл0,1 мг/мл
У-27632Может варьироваться в зависимости от номера лота5 мкМ
А83-01Может варьироваться в зависимости от номера лота0,5 мкМ

Таблица 1: Компоненты среды для бронхиального эпителия дыхательных путей с ингибиторами (BLEAM-I), среды ALI для бронхиальных/трахеальных эпителиальных клеток человека с ингибиторами (HBTEC-I) и HBTEC.

Колба для клеточных культур/Вкладыши для клеточных культурСреда, кондиционированная по ячейкам 804G (мл)
Колба T253 мл
Колба Т755 мл
24-луночный вкладыш для клеточных культур (размер пор 0,4 мкм, площадь поверхности 0,33см2 )400 мкл

Таблица 2: Объемы сред, кондиционированных клеточным матриксом 804G, необходимые для колб для культур и вкладышей для клеточных культур.

Обсуждение

В описанном здесь протоколе подробно описан метод сбора и обработки образцов аспирата трахеи новорожденных от интубированных новорожденных в отделении интенсивной терапии новорожденных с последующим выделением и расширением живых нТАЭК из этих образцов с использованием ранее установленных методов39. Кроме того, мы описали метод культивирования nTAECs на ALI и характеристики их дифференцировки в поляризованный мукоцилиарный эпителий дыхательных путей в зависимости от времени с помощью измерения TEER, анализа FITC-декстрана, иммунофлуоресцентного окрашивания и количественного ПЦР-анализа специфических маркеров типа клеток (т.е. базальных, реснитчатых, булавовидных и бокаловидных). Новым аспектом этого протокола является атмосферное окислительно-восстановительное возмущение, осуществляемое за счет умеренного воздействия гипероксии (60%O2) на развивающиеся монослои nTAEC. Мы показали,что 60 % воздействие О2 в течение 7 дней индуцирует клеточный окислительный стресс в нТАЭК. Кроме того , мы показываем, что стратегия экспозиции О2 не вызывает значительного клеточного апоптоза или повреждения клеточной мембраны, что позволяет поддерживать эти нТАЭК в культуре ОЛИ послезавершения экспозиции О2. Таким образом, модель потенциально может быть использована для изучения как краткосрочных, так и долгосрочных эффектов воздействияO2 на программирование эпителия дыхательных путей новорожденных.

Культивирование nTAECs в ALI дает определенные преимущества по сравнению с обычной погружной культурой, поскольку способствует образованию поляризованного монослоя эпителия дыхательных путей с формированием плотного соединения и мукоцилиарной дифференцировкой60,61. Предыдущие исследования с nTAECs показали, что на ранней стадии культивирования ALI (день с 0 по 7) клетки подвергаются псевдостратификации (проявляясь многослойными в отличие от одноклеточного слоя) и, наконец, образуют зрелый псевдостратифицированный эпителий к концу второй недели42,62. Образование плотных переходов следует аналогичной траектории на ранней фазе культуры ALI, сопровождаясь быстрым увеличением TEER с последующим плато63, что продемонстрировано в модели с nTAECs. Кроме того, эпителиальные клетки дыхательных путей, культивируемые в ALI, усиливают экспрессию и апиколатеральную локализацию claudin-1 (компонента комплекса tight junction), что усиливает герметизирующие свойства tight junctions во время культивирования ALI, способствуя образованию монослоя зрелой клетки63. Это коррелирует со снижением парацеллюлярной проницаемости, что было проверено на модели с анализом FITC-декстрана и продемонстрировало общую тенденцию к снижению проницаемости монослоя. Мы описали паттерн мукоцилиарной дифференцировки у нTAEC с иммуноокрашиванием реснитчатых (TUBA4A), булановых (SCGB1A1) и бокаловидных (MUC5AC) клеточных маркеров на 28-й день ОПЛ. Кроме того, мы проводили экспрессию генов реснитчатых (FOXJ1), булановых (SCGB1A1) и бокаловидных (MUC5AC) маркеров, специфичных для клеток, во время ОПЛ. Другие группы показали, что транскрипционный фактор FOXJ1 необходим для подвижного цилиогенеза, в то время как TUBA4A присутствует как в первичных, так и в подвижных ресничках64,65. В этой модели паттерн экспрессии генов FOXJ1 во время дифференцировки nTAEC по ALI примерно коррелирует с временем появления подвижных ресничек в культуре эпителия дыхательных путей из предыдущих исследований64,66.

В недавнем исследовании Teape et al. оценивались протеомные и метаболомные эффекты воздействия гипероксии на культуру ALI67. Тем не менее, клетки были получены от взрослых доноров. Предыдущие исследования респираторно-синцитиального вируса (РСВ)62,68,69,70 и недавней пандемии COVID-1971 подчеркнули важность возрастных различий в ответе и функции эпителия дыхательных путей. Zhao et al. использовали аналогичные рабочие процессы для выделения эпителиальных клеток дыхательных путей новорожденных и взрослых и показали, что после 21 дня дифференцировки ALI не было существенных различий в клеточном составе между эпителиальными клетками дыхательных путей новорожденных и взрослых62. Тем не менее, были явные различия в их реакции на РСВ-инфекцию: неонатальные клетки показали больше РСВ-инфицированных клеток и повреждений эпителия по сравнению со взрослыми. В целом, условия культивирования, использованные Zhao et al., обеспечили более надежную дифференцировку nTAECs по сравнению с нашими, с большим количеством реснитчатых (41% против 22%) и бокаловидных (10% против 3%) клеток. Эти различия можно объяснить использованием различных питательных сред. Было показано, что среда PneumaCult-ALI, используемая их группой (в отличие от среды HBTEC-ALI), индуцирует более устойчивую дифференцировку с большим числом реснитчатых и бокаловидных клеток72. В этой модели экспрессия генов специфичных для клеточного типа маркеров для реснитчатых, булановых и бокаловидных клеток показала первоначальное быстрое увеличение (ALI день от 0 до 7) с последующим снижением примерно на 28-й день ALI. Возможной причиной может быть стабилизация дифференцировки после 14-го дня ALI, что было продемонстрировано в предыдущих исследованиях с nTAECs42.

Мы описали применение умеренной гипероксии (60% О2) в течение 7 дней, что, по нашему мнению, более точно имитирует реальный опыт недоношенных новорожденных в ОРИТН по сравнению с использованием очень высоких уровнейО2 (> 80% О2)67, где риск острой токсичности О2 повышен1. 5. Действительно, было показано, что 95% воздействие О2 на легочную ткань новорожденных индуцирует клеточный апоптоз посредством активации каспаз73. Тем не менее, эта стратегия воздействия актуальна только для небольшого процента детей в отделении интенсивной терапии, у которых в результате острого повреждения легких, вызванногоO2, развивается тяжелое БЛД с хроническими бронхиальными патологиями (модель острого повреждения легких)37. В современную эпоху разумного использования терапии О2 большинство недоношенных детей не подвергаются воздействию такого высокого уровняО2; Тем не менее, они все еще подвержены риску развития заболеваний дыхательных путей в будущем (модель возмущения развития). В этой последней группе травма от окислительно-восстановительных нарушений в раннем возрасте может первоначально протекать тихо, но проявиться позже, в ясельном возрасте или позже в виде хроническогозаболевания дыхательных путей. Наши данные с использованием анализа клеточного окислительного стресса показали, что умеренное воздействие гипероксии (60%O2) значительно увеличивает окислительный стресс в монослое клеток nTAEC. Анализ высвобождения ЛДГ и активации клеточной каспазы-3 показал, что наша стратегия воздействия гипероксии не привела к значительной гибели клеток. Описанные нами методы и модельная система потенциально могут быть использованы длявыявления О2-чувствительных молекулярных механизмов в раннем возрасте в качестве связи с более поздним развитием легочных заболеваний у бывших недоношенных детей.

В течение жизни плода эпителиальные клетки дыхательных путей погружаются в легочную жидкость и существуют в относительно гипоксической внутриутробной среде26. Эпителиальные клетки дыхательных путей новорожденных претерпевают быстрый оборот и дифференцировку и образуют критический барьер между легкими и внешним миром. По мере того, как новорожденные переходят к постнатальной жизни, эпителиальные клетки дыхательных путей подвергаются воздействию относительно гипероксической постнатальной среды. Этот переход становится более резким у недоношенных и клинически больных новорожденных, поскольку они также регулярно нуждаются в терапевтическомО2 в рамках лечения40,74, что подвергает их высокому риску окислительного повреждения после рождения1. В то время как влияние гипероксии на постнатальную альвеоляризацию легких было хорошо описано с использованием животных моделей75, влияние воздействия гипероксии на развивающиеся эпителиальные клетки дыхательных путей относительномало изучено. Использование эпителиальных клеток дыхательных путей человека, полученных из новорожденных, с физиологически значимым воздействием гипероксии во время ОПЛ, добавляет трансляционную актуальность нашей модели. Кроме того, использование воздействия гипероксии во время ранней-средней фазы активной дифференцировки и формирования монослоя клеток, а не полностью дифференцированного зрелого эпителия дыхательных путей67, потенциально моделирует клинический сценарий у крайне недоношенных новорожденных (< 28 недель гестации), которые рождаются на ранних стадиях (от каналикулярных до мешковатых) развития легких, а не на альвеолярной стадии7.

Наша модель имеет ограничения, которые необходимо учитывать при ее применении к человеческому развитию и болезням. Мы использовали условное перепрограммирование первичных эпителиальных клеток дыхательных путей новорожденных, ранее опубликованное в модели ALI nTAECs39. Использование ингибиторов фактора роста (Rho/Smad/GSK3/mTOR) позволяет быстрее и позже пассировать эти клетки. Мы попытались культивировать nTAEC как в погруженных, так и в ALI условиях без ингибиторов в питательной среде; однако экспансия и пассирование этих клеток происходили значительно медленнее, и монослой клеток в ALI стал негерметичным к концу второй недели (данные не показаны). Другая группа, использующая те же ингибиторы для культивирования первичных эпителиальных клеток дыхательных путей новорожденных42, провела секвенирование РНК одиночных клеток, чтобы показать, что присутствие этих ингибиторов не вызывает значительной дифференциальной экспрессии генов, участвующих в окислительном стрессе, эпителиально-мезенхимальном переходе или клеточном старении. Тем не менее, мы учли это ограничение в нашей модели и решили провести воздействие гипероксии после того, как ингибиторы Rho и Smad были удалены из дифференцировочных сред. В этом исследовании мы проверяли только умеренные эффекты гипероксии (60%O2) на nTAEC. Тем не менее, в будущих исследованиях предполагается использовать дифференцированное воздействие гипероксии (40%, 60% и 95%O2) и сравнивать реакцию в nTAEC. В то время как описанная здесь модель имеет трансляционную привлекательность, учитывая использование клеток новорожденных людей, госпитализированных в отделение интенсивной терапии новорожденных, это модель клеточной культуры in vitro, и, таким образом, значительные результаты с использованием этой модели требуют подтверждения с помощью дополнительной модели на животных in vivo.

В заключение мы описали пошаговый метод создания in vitro 3D модели культуры ALI с использованием эпителиальных клеток дыхательных путей новорожденных, выделенных из аспиратов трахеи интубированных новорожденных в отделении интенсивной терапии новорожденных. Мы использовали эту модель для изучения эффектов умеренного воздействия гипероксии, распространенного вреда окружающей среды у недоношенных новорожденных в отделении интенсивной терапии. Воздействие гипероксии индуцировало клеточный окислительный стресс в монослое клетки, не вызывая значительного повреждения клеточной мембраны или гибели клеток, что позволило продолжить культивирование ALI для изучения долгосрочных эффектов воздействияO2 на развитие и функцию эпителия дыхательных путей новорожденных. Будущие приложения с использованием этих методов потенциально могут раскрыть механизмы раннего заболевания, участвующие в долгосрочном развитии легочных заболеваний, вызванных гипероксией, часто наблюдаемых у бывших недоношенных детей.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать и сообщать о конфликте интересов.

Благодарности

Эта работа поддерживается финансированием от Пресвитерианского фонда здоровья (PHF) и Oklahoma Shared Clinical and Translational Resources (U54GM104938 с премией за институциональное развитие (IDeA) от NIGMS) для AG. Мы хотели бы поблагодарить доктора Пола Лероу и доктора Синбинь Ай из Массачусетской больницы общего профиля, Гарвардской медицинской школы, Бостон, штат Массачусетс, за предоставление неонатальных донорских клеток, использованных в некоторых экспериментах. Фигуры создавались с помощью Biorender. Статистический анализ проводился с помощью GraphPad Prism.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
10% буферизованный формалинFisher Scientific23-426796
1X PBS (фосфатно-солевой буфер) раствор, pH 7,4Gibco10010049
A 83-01Tocris29-391-0
ALI Transwell Вставки, 6,5 ммCorning3470
антиацетилированное антитело к тубулину, мышиный моноклональныйSigmaT7451
Антитело к альфа-тубулинуAbcamab7291
Антитело к цитокератину 5 Abcamab53121
BronchiaLife Эпителиальная среда дыхательных путей (BLEAM)LifeLine Cell TechnologyLL-0023
CHIR 99021Tocris44-231-0
Антитело к расщепленной каспазе-3Клеточная сигнализация9664T
SCGB1A1 или клубный клеточный белок (CC16) Поликлональные антитела человека, кроликаBioVendor R& DRD181022220-01
CM-H2DCFDA (Индикатор общего окислительного стресса)Thermo ScientificC6827
Обработанная клеточная культура Corning T25 КолбыCorning430639
U-образная клеточная культура T75 КолбыCorning430641U
CyQUANT LDH Анализ цитотоксичностиThermo ScientificC20300
DAPI Раствор (1 мг/мл)EN62248Fisher
Диметилсульфоксид [ДМСО] Hybri-MaxSigmaD2650
Дистиллированная водаGibco15230162
EVOM Руководство по измерению TEERWorld Precision InstrumentEVM-MT-03-01
FBS (фетальная бычья сыворотка)Gibco10082147
Флуоресцеин изотиоцианат декстран (средний моль 10 000)НаучныйF0918100MG
флуоресцеина изотиоцианат– декстран (средний моль 20,00)SigmaFD20-100MG
Козий антимышиный IgG (H+L), Human ads-HRPSouthern Biotech1031-05
Козий антимышиный IgG2b Перекрестно-адсорбированное вторичное антитело, Alexa Fluor 488InvitrogenA-21141
Козий анти-кролик IgG (H+L) Высокоадсорбированное вторичное антитело, Alexa Fluor 546InvitrogenA-11035
Козий противокроличий IgG(H+L), мышь/человек ads-HRPSouthern Biotech4050-05
HBTEC Air-Liquid Interface (ALI) Дифференцировочная средаLifeLine Клеточная технологияLM-0050
HEPESLonzaCC-5024
Heracell VIOS 160i Tri-Gas CO2 инкубатор, 165 лThermo Scientific51030411
высокопроизводительный набор для обратной транскрипции кДНКThermo Scientific4368814
Добавка HLLLifeLine Cell TechnologyLS-1001
ImageJNIHN/A
Invivogen Normocin - противомикробный реагентFisher ScientificNC9273499
L-глутаминLifeLine Cell TechnologyLS-1013
Сыворотка для нормальной козыGibco
NormocinInvivogenant-nr-05
p63 антителоSanta Cruz Biotechnologysc-25268
ProLong Gold Antifade MountantInvitrogenP36930
PureLink RNA Mini KitThermo Scientific12183025
RAPAMYCINThermo ScientificAAJ62473MC
TaqMan Fast Advanced Master MixThermo Scientific4444964
Анализы экфрессии гена Taqman: 18S рРНКThermo ScientificHs99999901_s1
Анализы экзессионной экспрессии гена Taqman: CATThermo ScientificHs00156308_m1
Экспрессионные анализы гена Taqman: FOXJ1Thermo ScientificHs00230964_m1
Анализы экрессии гена Taqman: GAPDHThermo ScientificHs02786624_g1
Анализы экрессии гена Taqman: GPX1Thermo ScientificHs00829989_gH
Анализы экрессии гена Taqman: GPX2Thermo ScientificHs01591589_m1
Анализы экрессии гена Taqman: GPX3Thermo ScientificHs01078668_m1
Taqman Анализы экрессии: KRT5Thermo Scientific
Taqman Gene Exression Tests: MUC5ACThermo ScientificHs01365616_m1
Taqman Gene Exression Tests: SCGB1A1Thermo ScientificHs00171092_m1
Taqman Gene Exression Tests: SOD1Thermo ScientificHs00533490_m1
Taqman Gene Exression Tests: SOD2Thermo ScientificHs00167309_m1
Быстроточные стерильные одноразовые фильтрующие установки Nalgene Thermo Scientific с мембраной PES (0,22 μ m поры, 500 мл)Thermo Scientific5660020
TM-1 Комбинированная добавкаLifeLine Cell TechnologyLS-1055
Общее антитело к каспазе-3Cell signaling14220S
Triton X-100Sigma9036-19-5
Trypsin-EDTA (0,05%), фенол красныйGibco25300062
Y-27632 2 HClTocris12-541-0
Научный imagej.nih.gov/ij/ PCN5000Hs00361185_m1 (Английский)

Ссылки

  1. Torres-Cuevas, I., et al. Oxygen and oxidative stress in the perinatal period. Redox Biol. 12, 674-681 (2017).
  2. Hanidziar, D., Robson, S. C. Hyperoxia and modulation of pulmonary vascular and immune responses in COVID-19. Am J Physiol-Lung Cell Mol Physiol. 320 (1), L12-L16 (2021).
  3. Amarelle, L., Quintela, L., Hurtado, J., Malacrida, L. Hyperoxia and lungs: What we have learned from animal models. Front Med. 8, 606678(2021).
  4. Mach, W. J., Thimmesch, A. R., Pierce, J. T., Pierce, J. D. Consequences of hyperoxia and the toxicity of oxygen in the lung. Nursing Res Pract. 2011, 260482(2011).
  5. Kallet, R. H., Matthay, M. A. Hyperoxic acute lung injury. Respir Care. 58 (1), 123-141 (2013).
  6. Penkala, I. J., et al. Age-dependent alveolar epithelial plasticity orchestrates lung homeostasis and regeneration. Cell Stem Cell. 28 (10), 1775-1789 (2021).
  7. Thébaud, B., et al. Bronchopulmonary dysplasia. Nat Rev Dis Primers. 5 (1), 78(2019).
  8. Ibrahim, J., Bhandari, V. The definition of bronchopulmonary dysplasia: an evolving dilemma. Pediatr Res. 84 (5), 586-588 (2018).
  9. Higgins, R. D., et al. Bronchopulmonary Dysplasia: Executive summary of a workshop. J Pediatr. 197, 300-308 (2018).
  10. Collins, J. J. P., Tibboel, D., de Kleer, I. M., Reiss, I. K. M., Rottier, R. J. The future of bronchopulmonary Dysplasia: Emerging pathophysiological concepts and potential new avenues of treatment. Front Med (Lausanne). 4, 61(2017).
  11. Northway, W. H., Rosan, R. C., Porter, D. Y. Pulmonary disease following respirator therapy of hyaline-membrane disease. Bronchopulmonary dysplasia. N Engl J Med. 276 (7), 357-368 (1967).
  12. Collaco, J. M., McGrath-Morrow, S. A. Bronchopulmonary dysplasia as a determinant of respiratory outcomes in adult life. Pediatr Pulmonol. 56 (11), 3464-3471 (2021).
  13. Tepper, R. S., Morgan, W. J., Cota, K., Taussig, L. M. Expiratory flow limitation in infants with bronchopulmonary dysplasia. J Pediatr. 109 (6), 1040-1046 (1986).
  14. Davidson, L. M., Berkelhamer, S. K. Bronchopulmonary Dysplasia: Chronic lung disease of infancy and long-term pulmonary outcomes. J Clin Med. 6 (1), 4(2017).
  15. Filbrun, A. G., Popova, A. P., Linn, M. J., McIntosh, N. A., Hershenson, M. B. Longitudinal measures of lung function in infants with bronchopulmonary dysplasia. Pediatr Pulmonol. 46 (4), 369-375 (2011).
  16. Stoll, B. J., et al. Neonatal outcomes of extremely preterm infants from the NICHD Neonatal Research Network. Pediatrics. 126 (3), 443-456 (2010).
  17. Colin, A. A., McEvoy, C., Castile, R. G. Respiratory morbidity and lung function in preterm infants of 32 to 36 weeks gestational age. Pediatrics. 126 (1), 115-128 (2010).
  18. Doyle, L. W., Ranganathan, S., Cheong, J. Bronchopulmonary dysplasia and expiratory airflow at 8 years in children born extremely preterm in the post-surfactant era. Thorax. 78 (5), 484-488 (2022).
  19. Doyle, L. W., et al. Ventilation in extremely preterm infants and respiratory function at 8 Years. N Engl J Med. 377 (4), 329-337 (2017).
  20. Brozmanova, M., Hanacek, J., Tatar, M., Strapkova, A., Szepe, P. Effects of hyperoxia and allergic airway inflammation on cough reflex intensity in guinea pigs. Physiol Res. 51 (5), 529-536 (2002).
  21. Burghardt, J. S., Boros, V., Biggs, D. F., Olson, D. M. Lipid mediators in oxygen-induced airway remodeling and hyperresponsiveness in newborn rats. Am J Respir Crit Care Med. 154, 4 Pt 1 837-842 (1996).
  22. Mazurek, H., Haouzi, P., Belaguid, A., Marchal, F. Persistent increased lung response to methacholine after normobaric hyperoxia in rabbits. Respir Physiol. 99 (2), 199-204 (1995).
  23. Onugha, H., et al. Airway hyperreactivity is delayed after mild neonatal hyperoxic exposure. Neonatology. 108 (1), 65-72 (2015).
  24. Regal, J. F., Lawrence, B. P., Johnson, A. C., Lojovich, S. J., O'Reilly, M. A. Neonatal oxygen exposure alters airway hyper-responsiveness but not the response to allergen challenge in adult mice. Pediatr Allergy Immunol. 25 (2), 180-186 (2014).
  25. Mayer, C. A., et al. CPAP-induced airway hyper-reactivity in mice is modulated by hyaluronan synthase-3. Pediatr Res. 92 (3), 685-693 (2022).
  26. Ganguly, A., Martin, R. J. Vulnerability of the developing airway. Respir Physiol Neurobiol. 270, 103263(2019).
  27. Yee, M., Buczynski, B. W., O'Reilly, M. A. Neonatal hyperoxia stimulates the expansion of alveolar epithelial type II cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 50 (4), 757-766 (2014).
  28. Balasubramaniam, V., Mervis, C. F., Maxey, A. M., Markham, N. E., Abman, S. H. Hyperoxia reduces bone marrow, circulating, and lung endothelial progenitor cells in the developing lung: implications for the pathogenesis of bronchopulmonary dysplasia. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 292 (5), L1073-L1084 (2007).
  29. Crystal, R. G., Randell, S. H., Engelhardt, J. F., Voynow, J., Sunday, M. E. Airway epithelial cells. Proc Am Thoracic Soc. 5 (7), 772-777 (2008).
  30. Whitsett, J. A. Airway epithelial differentiation and mucociliary clearance. Ann Am Thor Soc. 15, Supplement_3 S143-S148 (2018).
  31. Davis, J. D., Wypych, T. P. Cellular and functional heterogeneity of the airway epithelium. Mucosal Immunol. 14 (5), 978-990 (2021).
  32. Whitsett, J. A., Kalin, T. V., Xu, Y., Kalinichenko, V. V. Building and regenerating the lung cell by cell. Physiol Rev. 99 (1), 513-554 (2019).
  33. Maeda, H., et al. Involvement of miRNA-34a regulated Krüppel-like factor 4 expression in hyperoxia-induced senescence in lung epithelial cells. Respir Res. 23 (1), 340(2022).
  34. Zhu, Y., Mosko, J. J., Chidekel, A., Wolfson, M. R., Shaffer, T. H. Effects of xenon gas on human airway epithelial cells during hyperoxia and hypothermia. J Neonatal Perinatal Med. 13 (4), 469-476 (2020).
  35. Cao, X., et al. Invited review: human air-liquid-interface organotypic airway tissue models derived from primary tracheobronchial epithelial cells-overview and perspectives. In Vitro Cell Dev Biol - Animal. 57 (2), 104-132 (2021).
  36. Garcia, D., et al. Short exposure to hyperoxia causes cultured lung epithelial cell mitochondrial dysregulation and alveolar simplification in mice. Pediatr Res. 90 (1), 58-65 (2020).
  37. Crist, A. P., Hibbs, A. M. Prematurity-associated wheeze: current knowledge and opportunities for further investigation. Pediatr Res. 94 (1), 74-81 (2022).
  38. Lee, R. M., O'Brodovich, H. Airway epithelial damage in premature infants with respiratory failure. Am Rev Respir Dis. 137 (2), 450-457 (1988).
  39. Amonkar, G. M., et al. Primary culture of tracheal aspirate-derived human airway basal stem cells. STAR Protoc. 3 (2), 101390(2022).
  40. Shui, J. E., et al. Prematurity alters the progenitor cell program of the upper respiratory tract of neonates. Sci Rep. 11 (1), 10799(2021).
  41. Hillas, J., et al. Nasal airway epithelial repair after very preterm birth. ERJ Open Res. 7 (2), 00913-02020 (2021).
  42. Lu, J., et al. Rho/SMAD/mTOR triple inhibition enables long-term expansion of human neonatal tracheal aspirate-derived airway basal cell-like cells. Pediatr Res. 89 (3), 502-509 (2020).
  43. Jiang, D., Schaefer, N., Chu, H. W. Air-liquid interface culture of human and mouse airway epithelial cells. Meth Mol Biol. 1809, 91-109 (2018).
  44. You, K., et al. Moderate hyperoxia induces senescence in developing human lung fibroblasts. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 317 (5), L525-L536 (2019).
  45. Wang, H., et al. Severity of neonatal hyperoxia determines structural and functional changes in developing mouse airway. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 307 (4), L295-L301 (2014).
  46. Ravikumar, P., et al. α-Klotho protects against oxidative damage in pulmonary epithelia. Am J Physi-Lung Cell Mol Physiol. 307 (7), L566-L575 (2014).
  47. Hartman, W. R., et al. Oxygen dose responsiveness of human fetal airway smooth muscle cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 303 (8), L711-L719 (2012).
  48. Cadena-Herrera, D., et al. Validation of three viable-cell counting methods: Manual, semi-automated, and automated. Biotechnol Rep. 7, 9-16 (2015).
  49. Bodas, M., et al. Cigarette smoke activates NOTCH3 to promote goblet cell differentiation in human airway epithelial cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 64 (4), 426-440 (2021).
  50. Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. J Lab Autom. 20 (2), 107-126 (2015).
  51. Jakubowski, W., Bartosz, G. 2,7-dichlorofluorescin oxidation and reactive oxygen species: what does it measure. Cell Biol Int. 24 (10), 757-760 (2000).
  52. Oksvold, M. P., Skarpen, E., Widerberg, J., Huitfeldt, H. S. Fluorescent histochemical techniques for analysis of intracellular signaling. J Histochem Cytochem. 50 (3), 289-303 (2002).
  53. Hewitt, R. J., et al. Lung extracellular matrix modulates KRT5(+) basal cell activity in pulmonary fibrosis. Nat Commun. 14 (1), 6039(2023).
  54. Hawkins, F. J., et al. Derivation of airway basal stem cells from human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 28 (1), 79-95 (2021).
  55. Zou, X. L., et al. Down-expression of Foxj1 on airway epithelium with impaired cilia architecture in non-cystic fibrosis bronchiectasis implies disease severity. Clin Respir J. 17 (5), 405-413 (2023).
  56. Li, X., et al. Low CC16 mRNA expression levels in bronchial epithelial cells are associated with asthma severity. Am J Respir Crit Care Med. 207 (4), 438-451 (2023).
  57. Li, T., Wang, Y., Huang, S., Tang, H. The regulation mechanism of MUC5AC secretion in airway of obese asthma. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 68 (7), 153-159 (2022).
  58. Nekooki-Machida, Y., Hagiwara, H. Role of tubulin acetylation in cellular functions and diseases). Med Mol Morphol. 53 (4), 191-197 (2020).
  59. Creagh, E. M., Conroy, H., Martin, S. J. Caspase-activation pathways in apoptosis and immunity. Immunol Rev. 193, 10-21 (2003).
  60. Abo, K. M., et al. Air-liquid interface culture promotes maturation and allows environmental exposure of pluripotent stem cell-derived alveolar epithelium. JCI Insight. 7 (6), e155589(2022).
  61. Guénette, J., Breznan, D., Thomson, E. M. Establishing an air-liquid interface exposure system for exposure of lung cells to gases. Inhal Toxicol. 34 (3-4), 80-89 (2022).
  62. Zhao, C., et al. Age-related STAT3 signaling regulates severity of respiratory syncytial viral infection in human bronchial epithelial cells. bioRxiv. , (2023).
  63. Lochbaum, R., et al. Retinoic acid signalling adjusts tight junction permeability in response to air-liquid interface conditions. Cellular Signalling. 65, 109421(2020).
  64. Jain, R., et al. Temporal relationship between primary and motile ciliogenesis in airway epithelial cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 43 (6), 731-739 (2010).
  65. You, Y., et al. Role of f-box factor foxj1 in differentiation of ciliated airway epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 286 (4), L650-L657 (2004).
  66. Pan, J., You, Y., Huang, T., Brody, S. L. RhoA-mediated apical actin enrichment is required for ciliogenesis and promoted by Foxj1. J Cell Sci. 120, Pt 11 1868-1876 (2007).
  67. Teape, D., et al. Hyperoxia impairs intraflagellar transport and causes dysregulated metabolism with resultant decreased cilia length. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 324 (3), L325-L334 (2023).
  68. Hall, C. B. Respiratory syncytial virus and parainfluenza virus. N Engl J Med. 344 (25), 1917-1928 (2001).
  69. Guillien, A., et al. Determinants of immunoglobulin G responses to respiratory syncytial virus and rhinovirus in children and adults. Front Immunol. 15, 1355214(2024).
  70. Ito, K., Daly, L., Coates, M. An impact of age on respiratory syncytial virus infection in air-liquid-interface culture bronchial epithelium. Front Med (Lausanne). 10, 1144050(2023).
  71. Zimmermann, P., Curtis, N. Why does the severity of COVID-19 differ with age?: Understanding the mechanisms underlying the age gradient in outcome following SARS-CoV-2 infection. Pediatr Infect Dis J. 41 (2), e36-e45 (2022).
  72. Leung, C., Wadsworth, S. J., Yang, S. J., Dorscheid, D. R. Structural and functional variations in human bronchial epithelial cells cultured in air-liquid interface using different growth media. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 318 (5), L1063-L1073 (2020).
  73. Dieperink, H. I., Blackwell, T. S., Prince, L. S. Hyperoxia and apoptosis in developing mouse lung mesenchyme. Pediatric research. 59 (2), 185-190 (2006).
  74. Looi, K., et al. Preterm birth: Born too soon for the developing airway epithelium. Paediatr Respir Revi. 31, 82-88 (2019).
  75. Hilgendorff, A., Reiss, I., Ehrhardt, H., Eickelberg, O., Alvira, C. M. Chronic lung disease in the preterm infant. Lessons learned from animal models. Am J Respir Cell Mol Biol. 50 (2), 233-245 (2014).

Перепечатки и разрешения

Теги

Видео скоро будет доступно
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.