В статье описаны методы и реагенты, необходимые для проведения гибридизации цепной реакции РНК флуоресценции in situ (HCR RNA WM-FISH) для получения информации о пространственном и клеточном разрешении генов хемосенсорных рецепторов в антенне комара и верхнечелюстных пальпах.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Гибридизация Цепная реакция РНК Флуоресценция in situ Гибридизация хемосенсорных генов в обонятельных придатках комаров
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Комары являются эффективными переносчиками смертельных болезней и могут ориентироваться в химической среде с помощью хемосенсорных рецепторов, экспрессируемых в их обонятельных придатках. Понимание того, как хемосенсорные рецепторы пространственно организованы в периферических обонятельных придатках, может дать представление о том, как запах кодируется в обонятельной системе комаров, и проинформировать о новых способах борьбы с распространением заболеваний, переносимых комарами. Появление гибридизации цепной реакции РНК с флуоресценцией in situ (HCR RNA WM-FISH) позволяет осуществлять пространственное картирование и одновременное профилирование экспрессии нескольких хемосенсорных генов. В данной статье мы опишем поэтапный подход к выполнению HCR РНК WM-FISH на антенне комаров Anopheles и верхнечелюстных пальпах. Мы исследовали чувствительность этой методики, изучив профиль экспрессии ионотропных обонятельных рецепторов. Мы спросили, подходит ли описанная техника HCR WM-FISH для мультиплексных исследований путем привязки РНК-зондов к трем спектрально различным флуорофорам. Полученные результаты свидетельствуют о том, что HCR РНК WM-FISH обладает высокой чувствительностью к одновременному обнаружению нескольких хемосенсорных генов в антенне и верхнечелюстных пальпированных обонятельных придатках. Дальнейшие исследования подтверждают пригодность HCR WM-FISH для профилирования коэкспрессии мишеней с двойной и тройной РНК. Этот метод, применяемый с модификациями, может быть адаптирован для локализации интересующих генов в обонятельных тканях других видов насекомых или в других придатках.
Введение
Комары-переносчики, такие как Anopheles gambiae, полагаются на богатый репертуар хемосенсорных генов, экспрессируемых в их периферических обонятельных придатках, чтобы процветать в сложном химическом мире и идентифицировать поведенчески значимые запахи, исходящие от людей-хозяев, обнаруживать источники нектара и находитьместа яйцекладки. Антенна комара и верхнечелюстные щупики обогащены хемосенсорными генами, которые управляют обнаружением запаха в этих обонятельных придатках. Три основных класса лиганд-зависимых ионных каналов управляют обнаружением запаха в обонятельных придатках комаров: рецепторы одоранта (OR), которые функционирую....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Рассмотрение и подготовка материалов
- Решите, будет ли уместна целая монтировка или криосрез ткани. Этот протокол оптимизирован для визуализации РНК in situ в антенне комаров Anopheles и верхнечелюстных пальпах без криосекции. Если толщина образцов превышает 5 мм, рекомендуется криосекционирование для проникновения зонда.
- Определите интересующие гены и скопируйте последовательности, включая интроны и экзоны, из подходящей базы данных. Транскрибируйте последовательность гена в РНК для синтеза.
- Определите, следует ли приобретать зонды у коммерческих поставщиков или зонды будут синтезироваться в лаборатор....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Надежное обнаружение хемосенсорных генов в антенне Anopheles
Исследована чувствительность метода HCR FISH (рис. 1) для выявления экспрессии хемосенсорных рецепторов в обонятельных тканях комаров. Руководствуясь данными транскрипции РНК, о которых сообщалось ранее на антенне самки комара Anopheles, мы создали зонды для нацеливания на различные ИК-рецепторы. Средние значения транскрипции из четырех независимых исследований антеннального транскриптома показ.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Третье поколение гибридизационной цепной реакции (ГЦР) отличается чувствительностью и надежностью для визуализации нескольких мишеней РНК8. HCR WM-FISH был успешно применен на эмбрионах дрозофилы, курицы, мыши и рыбки данио, а также на личинках нематод и рыбок данио-рерио 10,16,17. Усики комаров и верхнечелюстные щупики, как правило, склонны к высокой аутофлуоресценции и слабому проникновению зон.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Мы благодарим Марго Херре (Margo Herre) и лабораторию Лесли Восшалла (Leslie Voshall) за то, что они поделились своим протоколом гибридизации in situ для обонятельных придатков Aedes aegypti . Эта работа была поддержана грантами Национальных институтов здравоохранения для C.J.P. (NIAID R01Al137078), стипендией HHMI Ханны Грей для J.I.R., премией Джонса Хопкинса для постдокторантуры J.I.R. и постдокторской стипендией Института исследования малярии Джонса Хопкинса для J.I.R. Мы благодарим Научно-исследовательский институт малярии Университета Джонса Хопкинса и Благотворительный фонд Блумберга за поддержку.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Амплификационный буфер | Molecular Instruments | Molecular Instruments, Inc. | Гибридизация in situ + иммунофлуоресценция | 50 мл |
| хлорида кальция (CaCl2) 1M | Сигма-Олдрич | 21115-100ML | |
| Хитиназа | Сигма-Олдрич | C6137-50УН | |
| Химотрипсин | Сигма-Олдрич | CHY5S-10VL | |
| Диметилсульфоксид (ДМСО) | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Eppendorf tube | VWR | 20901-551 | 1,5 мл |
| Щипцы | Dumont | 11251 | Number 5 |
| Гелевый насадочный наконечник | Costar | 4853 | 1-200 µ Шпильки с L-образным наконечником |
| Molecular Instruments | Molecular Instruments, Inc. | Гибридизация in situ + иммунофлуоресценция | h1 и h2 инициатор расщепления | |
| HEPES (1M) | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| IR25a зонд | Молекулярные инструменты | Набор зондов ID: PRK149 | AGAP010272 |
| Зонд IR41t.1 | Molecular Instruments | Идентификатор набора щупов: PRK978 | AGAP004432 |
| Зонд IR64a | Молекулярные инструменты | Идентификатор набора щупов: PRK700 | AGAP004923 |
| Идентификатор зонда IR75d | молекулярных инструментов | : PRK976 | AGAP004969 |
| Зонд IR76b | молекулярных инструментов | : PRI998 | AGAP011968 |
| Зонд IR7t | молекулярных инструментов | : PRL355 | AGAP002763 |
| Зонд IR8a | молекулярных инструментов | : PRK150 | AGAP010411 |
| LoBind Tubes | VWR | 80077-236 | 0,5 мл ДНК/РНК LoBind Пробирки |
| Хлорид магнесия (MgCl2) 1M | Thermo Fisher | AM9530G | |
| метанол | Fisher | A412-500 | |
| Вода без нуклеазы | Thermo Fisher | 43-879-36 | |
| Nutator | Denville Scientific | Model 135 | 3-D Mini rocker |
| Зонд Orco | Молекулярные инструменты | Набор зондов ID PRD954 | AGAP002560 |
| Параформальдегид (20%) | Услуги электронной микроскопии | 15713-S | |
| Фосфат буферизованный физиологический раствор (10X PBS) | Thermo Fisher | AM9625 | |
| Молекулярные инструменты https://www.molecularinstruments.com/ Молекулярные инструменты | |||
| Промывочный буфер зонда | Molecular | Instruments Molecular Instruments, Inc. | Гибридизация in situ + иммунофлюоресценция | 100 мл |
| протеиназы-К | Thermo Fisher | AM2548 | |
| физиологического раствора-цитрата натрия (ССК) 20x | Thermo Fisher | 15-557-044 | |
| SlowFade Diamond | Thermo Fisher | S36972 | монтажный раствор |
| хлорид натрия (NaCl) 5M | Invitrogen | AM9760G | |
| Triton X-100 (10%) | Сигма-Олдрич | 93443 | |
| Твин-20 (10%) Teknova | T0027 | ||
| Стекло для часов | Carolina | 742300 | 1 квадрат 5/8 дюйма; прозрачный |
Ссылки
- Konopka, J. K., et al. Olfaction in Anopheles mosquitoes. Chem Senses. 46, (2021).
- Raji, J. I., Potter, C. J. Chemosensory ionotropic receptors in human host-seeking mosquitoes. Curr Opin Insect Sci. 54, 100967(2022).
- Young, A. P., Jackson, D. J., Wyeth, R. C.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
