Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Иммунофлуоресцентное мечение срезов слизистой оболочки носа крыс с аллергическим ринитом методом многоцветного иммуноанализа

3.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/65937

⸱

22 сентября 2023 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Meishan Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В данном протоколе описана методика многоцветной иммунофлюоресценции для оценки модели аллергического ринита у крыс.

Аннотация

Аллергический ринит (АР) – это хроническое неинфекционное воспалительное заболевание слизистой оболочки носа, в основном опосредованное специфическим иммуноглобулином Е (IgE), поражающее примерно 10-20% населения мира. В то время как иммунофлуоресцентное (ИФ) окрашивание уже давно является стандартным методом обнаружения специфической для заболевания экспрессии белков, традиционные методы ИФ ограничены в своей способности обнаруживать уровни экспрессии трех или более белков в одном образце. В связи с этим в последние годы были разработаны многоцветные методы ПЧ, которые позволяют одновременно маркировать несколько мишеней в клетках или тканях.

В этом протоколе представлен всесторонний обзор процесса создания модели АР на крысах, получения образцов слизистой оболочки носа и технических процедур многоцветной иммунофлюоресценции. Все крысы в группе AR демонстрировали типичные симптомы, такие как чихание, насморк и зуд в носу, при этом поведенческие наблюдения набрали ≥5 балла. Окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) выявило увеличение количества воспалительных клеток и нарушение целостности слизистой оболочки носа в группе АР. Многоцветная иммунофлуоресценция (mIF) демонстрировала повышенную экспрессию RORγt и TICAM-1, в то время как экспрессия Foxp3 снижалась в ткани слизистой оболочки носа крыс с АР.

Введение

Аллергический ринит (АР) – это хроническое неинфекционное воспалительное заболевание слизистой оболочки носа, преимущественно опосредованное специфическим иммуноглобулином Е (IgE)1,2. Для него характерны такие симптомы, как чихание, насморк, заложенность носа и зуд в носу. По мере индустриализации и урбанизации распространенность АР постепенно увеличивается, затрагивая примерно 10–20% населения мира1. Метод иммунофлуоресценции (ИФ) представляет собой метод флуоресцентного окрашивания, в котором используется реакция связывания антитело-антиген. Он может быть использован для обнаружения и количественной оценки распределения и уровней экспрессии конкретных белков в биологических тканях или клетках. В исследованиях АР ИФ может одновременно обнаруживать несколько мишеней, включая цитокины, связанные с АР, воспалительные клетки, рецепторы и многое другое, что облегчает изучение патогенеза АР и эффектов лекарств 3,4,5,6.

Процесс многоцветного иммунофлуоресцентного окрашивания (mIF) очень похож на традиционный IF, с добавлением этапа элюирования антител во время каждого раунда окрашивания. Эта модификация позволяет одновременно обнаруживать несколько биомаркеров на одном и том же участке ткани с помощью последовательного одиночного мечения и нескольких циклов повторного окрашивания. mIF основан на усилении тирамидного сигнала (TSA), что позволяет проводить повторяющиеся циклы флуоресцентного окрашивания TSA и использовать микроволновый нагрев для удаления антител с сохранением флуоресцентных сигналов 7,8. По сравнению с обычным ИФ, mIF имеет ряд преимуществ: (1) он может обнаруживать слабоэкспрессируемые антигены, которые трудно идентифицировать с помощью обычного IF 9,10; (2) обеспечивает высококачественное окрашивание с улучшенным соотношением сигнал/шум; (3) она позволяет количественно оценить тканеспецифические структуры и области, представляющие интерес11; (4) мультиплексирование нескольких путей эффективно использует ткани и сохраняет ограниченные патологические ресурсы12; (5) многопараметрический анализ с помощью mIF позволяет глубже проникнуть в ткани, выявляя скрытую биологическую информацию13.

В целом, mIF позволяет наблюдать различные экспрессии и распределения антигенов в одном и том же образце, облегчая изучение белков-мишеней. В будущем исследователи, стремящиеся понять экспрессию и распределение нескольких белков-мишеней, найдут этот метод ценным выбором. В данном исследовании демонстрируется применение мИФ для окрашивания образцов слизистой оболочки носа крыс с АР и оценивается создание модели АР на крысах.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Протокол эксперимента и процедуры получили одобрение Административного комитета и комитета по исследованиям на животных Университета традиционной китайской медицины Чэнду (регистрационный номер: 2022DL-010). Восьминедельные крысы-самцы Sprague Dawley (SD) массой 180-200 г были получены в промышленных масштабах (см. таблицу материалов) и содержались в естественном цикле света/темноты с контролируемой температурой (23 ± 2 °C) и относительной влажностью (55% ± 10%). Двенадцать крыс были случайным образом разделены на две группы: контрольную группу и группу AR. Все крысы были акклиматизированы к этим условиям и обеспечены свободным доступом к пище и воде в течение одной недели перед испытанием.

1. Создание крысиной модели дополненной реальности

  1. Приготовление сенсибилизирующего раствора: суспендировать 30 мг овальбумина (OVA) и 3 г Al(OH)3 в 100 мл физиологического раствора (см. таблицу материалов)14,15.
  2. Базовая сенсибилизация: схватите и удерживайте полностью проснувшуюся крысу брюшком вверх. Продезинфицируйте живот с помощью ватных шариков, пропитанных 75% спиртом. Шприцем объемом 1,5 мл вводят 1 мл сенсибилизирующего раствора, приготовленного на этапе 1.1, в левую брюшную полость крыс группы АР. Повторяйте эту инъекцию один раз в два дня в течение 14 дней (рисунок 1A).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что голова крысы расположена ниже, чем ее хвост, чтобы предотвратить повреждение толстого и тонкого кишечника при введении шприца. Место инъекции расположено в 1,5 см от вентральной срединной линии. Крысы контрольной группы должны получать внутрибрюшинные инъекции по 1 мл физиологического раствора один раз в два дня в течение 14 дней.
  3. Назальный вызов: ввести 50 мкл 5% OVA в виде назальных капель с помощью пипетки объемом 100 мкл (рис. 1B) на следующий день после базальной сенсибилизации, повторяя эту процедуру в течение 7 дней (рис. 1C).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте 5% раствор OVA, смешав 5 г OVA со 100 мл физиологического раствора. Для контрольной группы вводят капли такого же объема физиологического раствора.

2. Поведенческий скоринг крыс

  1. В течение 30 минут после выполнения финального назального теста наблюдайте и записывайте крыс с помощью цифровой камеры, чтобы определить такие симптомы, как расчесывание носа, чихание и насморк, на основе критериев оценки, изложенных в таблице 1 (рисунок 1D).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подтверждение успешного моделирования дополненной реальности основано на достижении общего балла ≥5 баллов14.

3. Взятие образцов слизистой оболочки носа

  1. Жертвоприношение крыс: принесите крыс в жертву, подвергнув их передозировкеCO2. После этого продезинфицируйте крыс 75%-ным этанолом (см. таблицу материалов). С помощью скальпеля сделайте надрез вдоль двух уголков рта, чтобы обнажить мышечную ткань (рис. 2А). Далее с помощью тканевых ножниц разрезают суставы скуловой кости и нижней челюсти с обеих сторон черепа (рис. 2Б) и удаляют нижнюю челюсть (рис. 2В).
  2. Воздействие на полость носа: отделите кожу верхней челюсти с помощью гемостата (рисунок 2D), чтобы обнажить полость носа (рисунок 2E). Разрежьте костное соединение между носовой полостью и верхней челюстью тканевыми ножницами (рис. 2F). Затем разорвите связь между полостью носа и костями глазницы с обеих сторон в подглазничном отверстии (рис. 2G) и удалите полость носа (рис. 2H).
  3. Фиксация: извлеченную полость носа поместить в 4% параформальдегид для фиксации и хранить при комнатной температуре в течение 24-72 ч (см. Таблицу материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что количество используемого фиксатора параформальдегида достаточно, чтобы полностью покрыть участки для правильной фиксации.

4. Предварительная обработка образцов слизистой оболочки носа

  1. Декальцинация: начните с фиксации удаленных тканей из шага 3.1. Вымойте их три раза PBS по 20 минут каждый. После этого промойте их три раза дистиллированной водой, каждый раз в течение 20 минут. Затем декальцинируют ткани в растворе для декальцинации объемом в 20-30 раз большем, чем у тканей при комнатной температуре.
    1. Раствор для декальцинации (см. таблицу материалов) должен поддерживать рН 7,2-7,4. Наконец, поместите декальцинированную ткань в коробку для обезвоживания.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор для удаления накипи необходимо менять еженедельно. Процесс декальцинации можно завершить, когда ткань размягчится (примерно через 2 месяца).
  2. Обезвоживание и вощение: переложите дегидратационный бокс в дегидратор (см. Таблицу материалов). Начните с 75% спирта в течение 4 ч, затем 85% алкоголя в течение 2 ч, 90% спирта в течение 2 ч и 95% алкоголя в течение 1 ч.
    1. Затем погрузите ткань в безводный этанол на 30 мин, повторите процесс еще на 30 мин, используйте ксилол на 5-10 мин, повторите этот шаг еще на 5-10 мин, погрузите ткань в воск на 1 ч, повторите этот шаг еще на час и, наконец, погрузите ткань в воск еще на 1 ч.
  3. Закладка: поместите расплавленный восковой блок в коробку для закладки (см. Таблицу материалов) и храните его в морозильной камере при температуре -20 °C. Как только воск застынет, снимите его и обрежьте восковой блок.
  4. Нарезка: обрезанный восковой блок вставляют в парафиновый микротом (см. Таблицу материалов) и нарезают его ломтиками толщиной 3 мкм. Поместите ломтики на водяную баню с температурой 40 °C на разбрасывателе. Разровняйте ткань, затем приподнимите ее предметным стеклом и запекайте в духовке при температуре 60 °C.
    1. После того, как вода испарится, а воск должным образом застынет, снимите предметные стекла и храните их при температуре 25 °C.

5. Окрашивание тканей слизистой оболочки носа методом H&E

  1. Депарафинизация и гидратация: поместите ломтики в ксилол на 20 минут, повторите процесс еще на 20 минут, абсолютный этанол на 5 минут, повторите этот шаг еще на 5 минут, 75% спирт на 5 минут и, наконец, промойте в течение 5 минут.
  2. Окрашивание гематоксилином: дозировать 100 мкл раствора для окрашивания гематоксилина (см. таблицу материалов) в течение 3-5 мин с помощью пипетки на 100 мкл, промыть в течение 5-10 с, добавить 100 мкл 0,5% солянокислого этанола в течение 10-30 с, промыть в течение 5-10 с, добавить 100 мкл 0,2% аммиачной воды в течение 10-30 с и промыть в течение 30 с.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После окрашивания гематоксилином необходима дифференцировка 0,5% этанолом соляной кислоты для удаления избытка гематоксилинового красителя, связанного с ядром и поглощенного цитоплазмой. При окрашивании эозином ядра и цитоплазма будут четко окрашены. Ломтики будут выглядеть красными или розовыми после дифференцировки 0,5% соляной кислоты этанола, поэтому промойте сразу после дифференцировки, чтобы удалить кислоту из срезов ткани, чтобы остановить дифференцировку. Затем используйте 0,2% аммиачной воды для усиления ядерного окрашивания.
  3. Окрашивание эозином: с помощью пипетки объемом 100 мкл дозируйте 100 мкл раствора для окрашивания эозина (см. таблицу материалов) в течение 5 минут и смывайте в течение 30 с.
  4. Обезвоживание и герметизация: погрузите ломтики в абсолютный этанол на 5 минут, повторите процесс еще на 5 минут, повторите еще раз на 5 минут, диметил на 5 минут и ксилол на 5 минут. Наконец, уплотните нейтральной смолой (см. Таблицу материалов).
  5. Размещение окрашенного участка на микроскопе: расположите окрашенный участок на микроскопе, отрегулируйте фокус микроскопа до тех пор, пока изображение не станет четко видным, установите увеличение на 40x и сделайте снимок.

6. Многоцветное иммуноокрашивание тканей слизистой оболочки носа

  1. Депарафинизация и увлажнение: выполните то же самое, что описано в шаге 5.1.
  2. Обработка цитратно-фосфатным буфером: поместите цитрат-фосфатный буфер (pH 6,0) (см. Таблицу материалов) в контейнер, пригодный для использования в микроволновой печи. Нагрейте его до кипения, выньте его, а затем добавьте горки в емкость. Готовьте в микроволновой печи на среднем огне 8 минут до закипания, выключите огонь на 8 минут, а затем переключитесь на средне-слабый огонь на 7 минут.
    1. После естественного охлаждения переложите ломтики в PBS (pH 7,4), встряхните и промойте их три раза с помощью обесцвечивающего шейкера, каждый раз в течение 5 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Следите за тем, чтобы буфер не испарялся во время этого процесса, и не допускайте высыхания ломтиков.
  3. Блокирование эндогенной пероксидазы: срезы высушить, иммуногистохимической ручкой нарисовать круг вокруг ткани (чтобы антитело не утекло) и нанести 3% раствор перекиси водорода (перекись водорода: чистая вода = 1:9).
    1. Выдерживают при комнатной температуре в темноте 15 мин. После естественного охлаждения поместите ломтики в PBS (pH 7,4) и встряхните их на обесцвечивающем шейкере в течение трех циклов по 5 минут каждый.
  4. Блокируя: нанести 5% козью сыворотку внутри круга и инкубировать в течение 30 мин.
  5. Добавление первичных антител: осторожно удалите блокирующий раствор, добавьте FOXP3 (разведение: 1:200, см. таблицу материалов) в срез и поместите его во влажную камеру. Выдерживают при температуре 4 °C в течение ночи.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте небольшое количество воды во влажную камеру, чтобы предотвратить испарение антител.
  6. Добавление вторичных антител: поместите ломтики в PBS (pH 7,4) и встряхните их на обесцвечивающем шейкере в течение трех циклов по 5 минут каждый. Аккуратно подсушите ломтики и нанесите вторичное антитело (Goat Anti-Rabbit IgG H&L, см. таблицу материалов) внутри круга. Выдерживают при комнатной температуре 50 мин в темноте.
  7. Приготовление раствора для разведения тирамида: смешайте 100 мкл 3%H2O2 со 100 мл 1x TBST (см. таблицу материалов).
  8. Добавление рабочего раствора TSA: Смешайте 1 мл разбавителя тирамида с 2 мкл CY3-тирамида для приготовления рабочего раствора TSA. На каждый срез нанести 100 мкл рабочего раствора TSA и инкубировать при комнатной температуре в темноте в течение 10 мин. Затем промойте ломтики PBS три раза, каждый раз по 5 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Немедленно приготовьте и используйте рабочий раствор TSA и храните его при температуре 4 °C в темноте; Он действителен до 24 часов.
  9. Повторите шаги 6.2-6.8: переключитесь на разведение RORγt (флуоресцентный краситель FITC) в соотношении 1:200, а затем на разведение TICAM1 (краситель TYP620) в соотношении 1:200 (см. таблицу материалов).
  10. Окрашенные DAPI ядра: аккуратно встряхните ломтики, чтобы они высохли, нанесите раствор для окрашивания DAPI и инкубируйте при комнатной температуре в течение 10 минут в темноте.
  11. Гасящая автофлуоресценция: поместите ломтики в PBS (pH 7,4) и встряхните их на обесцвечивающем шейкере в течение трех циклов по 5 минут каждый. Нанесите на ломтики автофлуоресцентный гаситель (см. Таблицу материалов), подождите 5 минут, а затем промойте в течение 10 минут.
  12. Блокировка: поместите ломтики в PBS (pH 7,4) и встряхните их на обесцвечивающем шейкере в течение трех циклов по 5 минут каждый. Аккуратно встряхните ломтики, чтобы они высохли, и запечатайте их антифлуоресцентным гасителем (см. Таблицу материалов).
  13. Микроскопия: поместите окрашенный участок на микроскоп, отрегулируйте фокус микроскопа для четкой видимости, установите увеличение на 20x и 40x и сделайте снимок.
    ПРИМЕЧАНИЕ: DAPI имеет длину волны УФ-возбуждения 330-380 нм и длину волны излучения 420 нм (синий свет). FITC имеет длину волны возбуждения 465-495 нм и длину волны излучения 515-555 нм (зеленый свет). CY3 имеет длину волны возбуждения 510-560 нм и длину волны излучения 590 нм (красный свет). TYP-690 имеет длину волны возбуждения 630 нм и длину волны излучения 690 нм (розовый свет).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Шесть крыс SD были успешно индуцированы в модель AR с помощью внутрибрюшинной инъекции OVA и назального вызова. АР индуцировали у всех крыс в группе АР, что составляет 100% группы. У всех крыс в группе AR наблюдались типичные симптомы, такие как чихание, насморк и зуд в носу. Все поведенческие наблюдения набрали ≥5 баллов (табл. 2).

Результаты окрашивания H&E на21-й день моделирования показали, что у контрольных крыс эпителиальные клетки слизистой оболочки носа ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Аллергический ринит (АР) – это неинфекционное воспалительное заболевание слизистой оболочки носа, возникающее в результате сочетания экологических и генетических факторов. Это стало глобальной проблемой здравоохранения, влияя на эффективность работы, снижая качество жизни, ухудшая сон, когнитивные функции, а также вызывая раздражительность и усталость. АР затрагивает 10–20% населения мира¹ и влечет за собой существенные экономические издержки, приводя к ежегодным убыткам в размере до 30–50 млрд евро в странах ЕС

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана Департаментом науки и технологий провинции Сычуань (2021YJ0175).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Al(OH)3Sollerbauer Biotechnology Co., LtdA7130
75% этанолAnhui Yiren An Co., Ltd20210107
аммиакChengdu Kolon Chemical Co., Ltd2021070101
безводный этанолChengdu Kolon Chemical Co., Ltd2022070501
Антифлуоресцентный герметикSouthernBiotech0100-01
Автоматическая красильная машинаThermo scientificVaristain Gemini ES
Carrier слайдыNantong Mei Wei De Experimental Equipment Co., Ltd220518001
Цитрат-фосфатный буфер Servicebio biotechnology co., LtdG1201
Раствор для восстановления антигена лимонной кислоты (PH 6.0)Xavier Biotechnology Co., LtdG1201
Coverslip Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co.
Покровное покрытиеNantong Mewtech Life Science Co., LtdCS01-2450
CY3-TyramideSawell Biotechnology Co., LtdG1223-50UL
DAPISawell Biotechnology Co., LtdG1012
Шейкер для обесцвечиванияSCILOGEXS1010E
EDTA решение для удаления накипиWuhan Xavier Biotechnology Co., Ltd
Электрическая нагревательная струйная сушилка Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., LtdDHG-9240A
Машина для маркировки встраиваемых коробокThermo scientific  PrintMate AS
Встраиваемая машинаWuhan Junjie Electronics Co., LtdJB-P5
Машина для быстрого обезвоживания тканейThermo scientificSTP420 ES
Плёночный герметикThermo scientificAutostainer 360
FITC-TyramideSawell Biotechnology Co., LtdG1222-50UL
Флуоресцентный микроскопSunny Оптические технологии Co.LtdCX40
Foxp3Affinity Biosciences Co., Ltdbs-10211R
Стол для заморозкиWuhan Junjie Electronics Co., LtdJB-L5
Goat Anti-rabbit IgG H& L (HRP)Liankebio Co., LtdGAR0072
сыворотка для козBiosharpBL210A
H& Набор для окрашиванияLeageneDH0020
Гемостатические щипцыShanghai Medical Devices Co., LtdJ31010
Соляная кислотаSichuan Xilong Science Co., Ltd210608
Иммуногистохимическая ручкаBiosharpBC004
Микроволновая печьMideaM1-L213B
Нейтральная камедьSinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd10004160
Ovalbumin Sollerbauer Biotechnology Co., LtdA804010
OvenShanghai Yiheng Scientific Instruments Co., LtdDHG-9240A
Пальмовая центрифугаSCILOGEXD1008E
ПараформальдегидBeyotime Biotechnology Co., LtdP0099-100ml
Сканер патологического сечения3DHISTECH KftPannoramic SCAN 
PBS буферBiosharpG4202
Пипетка ДраконKE0003087/KA0056573
Rorγ tAffinity Biosciences Co., LtdDF3196
СкальпельQuanzhou Excellence Medical Co., Ltd20170022
Самофлуоресцентный гаситель Sudan Black BBioengineering Co., LtdA602008-0025
СлайсерThermo scientificHM325
Машина для нарезкиThermo scientificHM325
SlideNantong Mewtech Life Science Co., LtdPC2-301
Sprague Dawley ratsSichuan Academy of Traditional Chinese MedicineSYX figure-materials-1 2023-0100
TICAM-1Affinity Biosciences Co., LtdDF6289
Ножницы для салфетокShanghai Medical Devices Co., LtdJ22120
Машина для разбрасывания салфетокWuhan Junjie Electronics Co., LtdJK-6
TYR-690 флуоресцентные красителиShanghai Rutron Biotechnology Co., LtdRC0086-34RM
Вихревой смесительSCILOGEXSLK-O3000-S
Сушилка для водяной баниWuhan Junjie Electronics Co., LtdJK-6
Восковой триммерWuhan Junjie Electronics Co., LtdJXL-818
XyleneChengdu Kolon Chemical Co., Ltd2022051901
220518001CR2203047

Ссылки

  1. Brożek, J. L., et al. Allergic rhinitis and its impact on asthma (ARIA) Guidelines-2016 revision. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 140 (4), 950-958 (2017).
  2. Maurer, M., Zuberbier, T. Undertreatment of rhinitis symptoms in Europe: findings from a cross-sectional questionnaire survey. Allergy. 62 (9), 1057-1063 (2007).
  3. Ding, Y., et al. Alpha-linolenic acid improves nasal mucosa epithelial barrier function in allergic rhinitis by arresting CD4+ T cell differentiation via IL-4Rα-JAK2-STAT3 pathway. Phytomedicine: International Journal of Phytotherapy and Phytopharmacology. 116, 154825(2023).
  4. Zhou, H., et al. Activation of NLRP3 inflammasome contributes to the inflammatory response to allergic rhinitis via macrophage pyroptosis. International Immunopharmacology. 110, 109012(2022).
  5. Watts, A. M., Cripps, A. W., West, N. P., Cox, A. J. Modulation of allergic inflammation in the nasal mucosa of allergic rhinitis sufferers with topical pharmaceutical agents. Frontiers in pharmacology. 10, 294(2019).
  6. Patel, N., et al. Fungal extracts stimulate solitary chemosensory cell expansion in noninvasive fungal rhinosinusitis. International Forum of Allergy & Rhinology. 9 (7), 730-737 (2019).
  7. Granier, C., et al. Tim-3 expression on tumor-infiltrating PD-1(+)CD8(+) T cells correlates with poor clinical outcome in renal cell carcinoma. Cancer Research. 77 (5), 1075-1082 (2017).
  8. Badoua, C., et al. PD-1-ex pressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in HPV-associated head and neck cancer. Cancer Research. 73 (1), 128-138 (2013).
  9. Fedchenko, N., Reifenrath, J. Different approaches for interpretation and reporting of immunohistochemistry analysis results in the bone tissue - a review. Diagnostic Pathology. 9, 221(2014).
  10. Faget, L., Hnasko, T. S. Tyramide signal amplification for immunofluorescent enhancement. Methods in Molecular Biology. 1318, 161-172 (2015).
  11. Parra, E. R., Villalobos, P., Rodriguez-Canales, J. The multiple faces of programmed cell death ligand 1 expression in malignant and nonmalignant cells. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology.: AIMM. 27 (4), 287-294 (2019).
  12. Welsh, A. W., et al. Standardization of estrogen receptor measurement in breast cancer suggests false-negative results are a function of threshold intensity rather than percentage of positive cells. Journal of Clinical Oncology: Official Journal of the American Society of Clinical Oncology. 29 (22), 2978-2984 (2011).
  13. Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380(2017).
  14. Miao, M., Xiang, L., Miao, Y. Specification for preparation of allergic rhinitis animal model (draft). Chinese Traditional and Herbal Drugs. 49 (1), 50-57 (2018).
  15. Xu, J., et al. Astragalus polysaccharides attenuate ovalbumin-induced allergic rhinitis in rats by inhibiting nlrp3 inflammasome activation and nod2-mediated nf- κ b activation. Journal of Medicinal Food. 24 (1), 1-9 (2021).
  16. Bousquet, J., et al. Allergic rhinitis. Nature reviews. 6 (1), 95(2020).
  17. Free Thinking. Multiplex fluorescence immunohistochemistry. , http://www.freethinking.com.cn/?xinwendongtai/156.html (2023).
  18. Huang, C., et al. Expression of activated signal transducer and activator of transcription-3 as a predictive and prognostic marker in advanced esophageal squamous cell carcinoma. World Journal of Surgical Oncology. 13, 314(2015).
  19. Leynaert, B., Bousquet, J., Neukirch, C., Liard, R., Neukirch, F. Perennial rhinitis: An independent risk factor for asthma in nonatopic subjects: results from the European Community Respiratory Health Survey. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 104 (2), 301-304 (1999).
  20. Guerra, S., et al. Rhinitis is an independent risk factor for developing cough apart from colds among adults. Allergy. 60 (3), 343-349 (2005).
  21. Greisner, W. A., Settipane, R. J., Settipane, G. A. Co-existence of asthma and allergic rhinitis: a 23-year follow-up study of college students. Allergy and Asthma Proceedings. 19 (4), 185-188 (1998).
  22. Pawankar, R., Mori, S., Ozu, C., Kimura, S. Overview on the pathomechanisms of allergic rhinitis. Asia Pacific Allergy. 1 (3), 157-167 (2011).
  23. Van Nguyen, T., et al. Anti-allergic rhinitis activity of α-lipoic acid via balancing th17/treg expression and enhancing nrf2/ho-1 pathway signaling. Scientific Reports. 10 (1), 12528(2020).
  24. Ivanov, I. I., et al. The orphan nuclear receptor rorγt directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+ T helper cells. Cell. 126 (6), 1121-1133 (2006).
  25. Fontenot, J. D., Gavin, M. A., Rudensky, A. Y. Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells. Nature Immunology. 4 (4), 330-336 (2003).
  26. Zhou, X., et al. Instability of the transcription factor Foxp3 leads to the generation of pathogenic memory T cells in Vivo. Nature Immunology. 10 (9), 1000-1007 (2009).
  27. Ziegler, S. F., Buckner, J. H. Foxp3 and the regulation of Treg/Th17 differentiation. Microbes and Infection. 11 (5), 594-598 (2009).
  28. Yaling, Y., Gui, Y., Shuqi, Q. Recent research advances of toll-like receptors and allergic rhinitis. Medical Recapitulate. 23 (7), 1273-1276 (2017).
  29. Shan, H., Jie, C. Correlation between TLR4 gene polymorphisms and allergic rhinitis. Journal of Clinical Otorhinolaryngology, Head, and Neck Surgery. 31 (13), 991-994 (2017).
  30. Xu, O., et al. Immunoregulatory mechanism of Treg cells and TICAM-1 patients with severe allergic rhinitis. Chinese Journal of Coal Industry Medicine. 23 (3), 303-306 (2020).
  31. Granier, C., et al. Tim-3 expression on tumor-infiltrating PD-1+CD8+ T cells correlates with poor clinical outcome in renal cell carcinoma. Cancer Research. 77 (5), 1075-1082 (2017).
  32. Badoual, C., et al. PD-1 expressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in hpv-associated head and neck cancer. Cancer Research. 73 (1), 128-138 (2013).
  33. Gustavson, M. D., et al. Development of an unsupervised pixel-based clustering algorithm for compartmentalization of immunohistochemical expression using automated quantitative analysis. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 17 (4), 329-337 (2009).
  34. Lu, S., et al. Comparison of biomarker modalities for predicting response to PD-1/PD-L1 checkpoint blockade: a systematic review and meta-analysis. JAMA Oncology. 5 (8), 1195-1204 (2019).
  35. Hernandez, S., et al. Multiplex immunofluorescence tyramide signal amplification for immune cell profiling of paraffin-embedded tumor tissues. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 667067(2021).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Foxp3ROR TTICAM 1
Иммунофлуоресцентное мечение срезов слизистой оболочки носа крыс с аллергическим ринитом методом многоцветного иммуноанализа
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.