В данном протоколе описана методика многоцветной иммунофлюоресценции для оценки модели аллергического ринита у крыс.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Иммунофлуоресцентное мечение срезов слизистой оболочки носа крыс с аллергическим ринитом методом многоцветного иммуноанализа
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Аллергический ринит (АР) – это хроническое неинфекционное воспалительное заболевание слизистой оболочки носа, в основном опосредованное специфическим иммуноглобулином Е (IgE), поражающее примерно 10-20% населения мира. В то время как иммунофлуоресцентное (ИФ) окрашивание уже давно является стандартным методом обнаружения специфической для заболевания экспрессии белков, традиционные методы ИФ ограничены в своей способности обнаруживать уровни экспрессии трех или более белков в одном образце. В связи с этим в последние годы были разработаны многоцветные методы ПЧ, которые позволяют одновременно маркировать несколько мишеней в клетках или тканях.
В этом протоколе представлен всесторонний обзор процесса создания модели АР на крысах, получения образцов слизистой оболочки носа и технических процедур многоцветной иммунофлюоресценции. Все крысы в группе AR демонстрировали типичные симптомы, такие как чихание, насморк и зуд в носу, при этом поведенческие наблюдения набрали ≥5 балла. Окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) выявило увеличение количества воспалительных клеток и нарушение целостности слизистой оболочки носа в группе АР. Многоцветная иммунофлуоресценция (mIF) демонстрировала повышенную экспрессию RORγt и TICAM-1, в то время как экспрессия Foxp3 снижалась в ткани слизистой оболочки носа крыс с АР.
Введение
Аллергический ринит (АР) – это хроническое неинфекционное воспалительное заболевание слизистой оболочки носа, преимущественно опосредованное специфическим иммуноглобулином Е (IgE)1,2. Для него характерны такие симптомы, как чихание, насморк, заложенность носа и зуд в носу. По мере индустриализации и урбанизации распространенность АР постепенно увеличивается, затрагивая примерно 10–20% населения мира1. Метод иммунофлуоресценции (ИФ) представляет собой метод флуоресцентного окрашивания, в котором используется реакция связывания антитело-антиген. Он может быть использован для обнаружения и....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Протокол эксперимента и процедуры получили одобрение Административного комитета и комитета по исследованиям на животных Университета традиционной китайской медицины Чэнду (регистрационный номер: 2022DL-010). Восьминедельные крысы-самцы Sprague Dawley (SD) массой 180-200 г были получены в промышленных масштабах (см. таблицу материалов) и содержались в естественном цикле света/темноты с контролируемой температурой (23 ± 2 °C) и относительной влажностью (55% ± 10%). Двенадцать крыс были случайным образом разделены на две группы: контрольную группу и группу AR. Все крысы были акклиматизированы к этим условиям и обеспечены свободным доступом к пище и воде ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Шесть крыс SD были успешно индуцированы в модель AR с помощью внутрибрюшинной инъекции OVA и назального вызова. АР индуцировали у всех крыс в группе АР, что составляет 100% группы. У всех крыс в группе AR наблюдались типичные симптомы, такие как чихание, насморк и зуд в носу. Все поведенческие наблюдения набрали ≥5 баллов (табл. 2).
Результаты окрашивания H&E на21-й день моделирования показали, что у контрольных крыс эпителиальные клетки слизистой оболочки носа .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Аллергический ринит (АР) – это неинфекционное воспалительное заболевание слизистой оболочки носа, возникающее в результате сочетания экологических и генетических факторов. Это стало глобальной проблемой здравоохранения, влияя на эффективность работы, снижая качество жизни, ухудшая сон, когнитивные функции, а также вызывая раздражительность и усталость. АР затрагивает 10–20% населения мира¹ и влечет за собой существенные экономические издержки, приводя к ежегодным убыткам в размере до 30–50 млрд евро в странах ЕС
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Эта работа была поддержана Департаментом науки и технологий провинции Сычуань (2021YJ0175).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Al(OH)3 | Sollerbauer Biotechnology Co., Ltd | A7130 | |
| 75% этанол | Anhui Yiren An Co., Ltd | 20210107 | |
| аммиак | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2021070101 | |
| безводный этанол | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2022070501 | |
| Антифлуоресцентный герметик | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Автоматическая красильная машина | Thermo scientific | Varistain Gemini ES | |
| Carrier слайды | Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co., Ltd | 220518001 | |
| Цитрат-фосфатный буфер | Servicebio biotechnology co., Ltd | G1201 | |
| Раствор для восстановления антигена лимонной кислоты (PH 6.0) | Xavier Biotechnology Co., Ltd | G1201 | |
| Coverslip Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co. | |||
| Покровное покрытие | Nantong Mewtech Life Science Co., Ltd | CS01-2450 | |
| CY3-Tyramide | Sawell Biotechnology Co., Ltd | G1223-50UL | |
| DAPI | Sawell Biotechnology Co., Ltd | G1012 | |
| Шейкер для обесцвечивания | SCILOGEX | S1010E | |
| EDTA решение для удаления накипи | Wuhan Xavier Biotechnology Co., Ltd | ||
| Электрическая нагревательная струйная сушилка | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | |
| Машина для маркировки встраиваемых коробок | Thermo scientific | PrintMate AS | |
| Встраиваемая машина | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-P5 | |
| Машина для быстрого обезвоживания тканей | Thermo scientific | STP420 ES | |
| Плёночный герметик | Thermo scientific | Autostainer 360 | |
| FITC-Tyramide | Sawell Biotechnology Co., Ltd | G1222-50UL | |
| Флуоресцентный микроскоп | Sunny Оптические технологии Co.Ltd | CX40 | |
| Foxp3 | Affinity Biosciences Co., Ltd | bs-10211R | |
| Стол для заморозки | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-L5 | |
| Goat Anti-rabbit IgG H& L (HRP) | Liankebio Co., Ltd | GAR0072 | |
| сыворотка для коз | Biosharp | BL210A | |
| H& Набор для окрашивания | Leagene | DH0020 | |
| Гемостатические щипцы | Shanghai Medical Devices Co., Ltd | J31010 | |
| Соляная кислота | Sichuan Xilong Science Co., Ltd | 210608 | |
| Иммуногистохимическая ручка | Biosharp | BC004 | |
| Микроволновая печь | Midea | M1-L213B | |
| Нейтральная камедь | Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd | 10004160 | |
| Ovalbumin | Sollerbauer Biotechnology Co., Ltd | A804010 | |
| Oven | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | |
| Пальмовая центрифуга | SCILOGEX | D1008E | |
| Параформальдегид | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | P0099-100ml | |
| Сканер патологического сечения | 3DHISTECH Kft | Pannoramic SCAN | |
| PBS буфер | Biosharp | G4202 | |
| Пипетка | Дракон | KE0003087/KA0056573 | |
| Rorγ t | Affinity Biosciences Co., Ltd | DF3196 | |
| Скальпель | Quanzhou Excellence Medical Co., Ltd | 20170022 | |
| Самофлуоресцентный гаситель Sudan Black B | Bioengineering Co., Ltd | A602008-0025 | |
| Слайсер | Thermo scientific | HM325 | |
| Машина для нарезки | Thermo scientific | HM325 | |
| Slide | Nantong Mewtech Life Science Co., Ltd | PC2-301 | |
| Sprague Dawley rats | Sichuan Academy of Traditional Chinese Medicine | SYX  2023-0100 | |
| TICAM-1 | Affinity Biosciences Co., Ltd | DF6289 | |
| Ножницы для салфеток | Shanghai Medical Devices Co., Ltd | J22120 | |
| Машина для разбрасывания салфеток | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JK-6 | |
| TYR-690 флуоресцентные красители | Shanghai Rutron Biotechnology Co., Ltd | RC0086-34RM | |
| Вихревой смеситель | SCILOGEX | SLK-O3000-S | |
| Сушилка для водяной бани | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JK-6 | |
| Восковой триммер | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JXL-818 | |
| Xylene | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2022051901 |
Ссылки
- Brożek, J. L., et al. Allergic rhinitis and its impact on asthma (ARIA) Guidelines-2016 revision. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 140 (4), 950-958 (2017).
- Maurer, M., Zuberbier, T. Und....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
