Методическая статья

Универсальный поведенческий метод исследования влияния гормонов щитовидной железы на функцию мозжечка

DOI:

10.3791/65940

⸱

6 октября 2023 г.

 ,  , 
1Department of Integrative Physiology, Gunma University Graduate School of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем протокол для универсального поведенческого теста, разработанного недавно, теста на лестничном луче. Этот тест имеет преимущество в выявлении тонкой мозжечковой атаксии, вызванной дефектом действия гормонов щитовидной железы в центральной нервной системе, по сравнению с обычными поведенческими тестами, оценивающими двигательную работоспособность.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Действие гормона щитовидной железы (ТГ) имеет важное значение в период развития центральной нервной системы, в том числе мозжечка. В случае дефицита ТГ в раннем возрасте, такого как врожденный гипотиреоз, у пациентов проявляются неврологические расстройства, такие как умственная отсталость и двигательный дефицит. Существуют различные исследования с использованием мышиных моделей с ткане- или клеточно-специфическим дефицитом ТГ для изучения роли ТГ в мозжечке. По сравнению с мышами с генерализованным врожденным гипотиреозом, мыши, специфичные для клеток мозжечка, с дефицитом ТГ, демонстрируют более мягкие и тонкие атаксические черты, что затрудняет оценку двигательной функции при использовании обычных тестов, таких как тест ротарода.

В связи с потребностью в альтернативном инструменте для оценки двигательной функции в моделях животных, связанных с ТГ, мы разработали универсальный поведенческий метод под названием «тест лестничного пучка», в котором мы можем разрабатывать различные тесты с лестницей в зависимости от тяжести атаксии у модельных мышей. Мы использовали трансгенных мышей, экспрессирующих доминантно-негативный рецептор TH, специфически в мозжечковой клетке Пуркинье, единственном выходном нейроне в коре мозжечка, модулирующем моторную производительность. Недавно созданный тест с использованием лестничного пучка успешно обнаружил устойчивые нарушения двигательной способности у трансгенных мышей на более высоком уровне по сравнению с тестом ротарода. Нарушение моторного обучения также было обнаружено в тесте с лестничным лучом, но не в тесте с ротародом. Протокол с этим новым поведенческим аппаратом может быть применен к другим животным моделям, которые могут демонстрировать слабый атаксичный фенотип, для изучения тонких изменений в функции мозжечка.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Гормон щитовидной железы (ТГ) незаменим для развития мозга1. В частности, его роль в мозжечке имеет решающее значение, поскольку дефицит ТГ в раннем возрасте вызывает аберрантное развитие мозжечка 1,2. Например, при врожденном гипотиреозе у пациентов наблюдается ряд неврологических нарушений, включая когнитивные и двигательные дефициты3. Чтобы раскрыть роль ТГ в функциональном развитии мозжечка, в некоторых исследованиях был ограничен дефицит ТГ специфическим для клеток мозжечка способом4. Однако, по сравнению с генерализованными мышами с врожденным гипотиреозом, у которых все ткани и клетки поражены дефицитом ТГ, такие мозжечково-специфические модели демонстрируют настолько тонкую атаксию, что обычные поведенческие тесты, такие как тесты ротарода, контакта ноги и балансирного пучка, едва обнаруживают различия. Таким образом, для полного изучения влияния ТГ на функцию мозжечка необходим новый инструмент оценки для обнаружения тонких изменений в моторной координации модельных мышей.

Тест ротарод является наиболее распространенным инструментом для оценки координации движений, первоначально разработанным Данхэмом и Мией5 , а затем примененным к ускоряющейся версии Джонсом и Робертсом6. Латентность падения от вращающегося стержня интерпретируется как тест на координацию движений, а его простота и лаконичность делают его широко используемым среди исследователей поведения, изучающих моторныефункции. Однако простота использования этого теста – палка о двух концах. Поскольку стержень вращается автоматически, мыши могут цепляться за вращающийся стержень и оставаться на нем, не двигаясь. Кроме того, мыши могут намереваться упасть, а не продолжать балансировать на вращающемся стержне. В любой ситуации валидность и надежность теста сомнительны для оценки «чистой моторной координации»7. Другими словами, он не точно нацелен на функцию мозжечка и включает в себя другие факторы, такие как мышечная сила для захвата.

Вместо традиционных инструментов для оценки координации движений здесь мы представляем новый поведенческий тест под названием «тест лестничного пучка», который недавно был разработан в нашей лаборатории. Тест на ходьбу по горизонтальной лестнице был разработан для оценки сложных двигательных способностей, связанных с мозжечком: прогнозирование прямой связи и интеграция движения8. Испытательное устройство состояло из четырех кусков оргстекла с отверстиями (рис. 1). Четыре пластины были соединены параллельно винтами и палочками, вставленными в отверстия на пластинах. Две внешние пластины использовались для стабилизации устройства, а две внутренние пластины использовались для проектирования различных видов лестничных перекладин (Рисунок 2C). Ширина перекладины регулировалась в зависимости от размера животного, чтобы свести к минимуму движение животных назад (рис. 2В). Расстояние от точки старта до цели составляло 110 см. Устройство располагалось на высоте 60 см над скамьей и под устройством устанавливалась подушка безопасности (рисунок 2А). Темная камера располагалась рядом с целью, чтобы мотивировать животных двигаться к цели (Рисунок 2А).

Мы изучили влияние ТГ на функциональное развитие мозжечка с использованием трансгенных мышей, экспрессирующих доминантно-негативный рецептор ТГ (TR) в клетках мозжечка Пуркинье (мыши Mf-1/FVB). В тестах с использованием ротародного и лестничного пучка мы наблюдали фенотип мозжечковой атаксии у мышей Mf-1/FVB; однако испытание с использованием лестничной балки позволило выявить более значительные различия, чем испытание с использованием ротарода (Рисунок 3). Кроме того, способность к моторному обучению может быть более тщательно оценена в тесте с лестничным лучом (рис. 3B, C). В качестве клеточного фона такого поведенческого фенотипа индукция долгосрочной депрессии (LTD) была ингибирована, и вместо этого долгосрочная потенциация (LTP) индуцировалась после LTD-индуктивной стимуляции в клетках Mf-1/FVB Purkinje9. LTD необходим для координации движений и моторного обучения в мозжечке10. Во многих исследованиях сообщалось о двигательном дефиците и ингибировании LTD у нокаутных или мутировавших мышей ключевых генов-регуляторов функции мозжечка, однако ни в одном исследовании никогда не сообщалось об индукции LTP после индуктивной стимуляции LTD11,12. В совокупности это явление может быть уникальным для мышей с Mf-1/FVB или мышей с дефицитом TH-дефицита (то же явление наблюдалось у взрослых мышей с гипотиреозом), что позволяет предположить, что TH регулирует функцию мозжечка иначе, чем другие ключевые белки. Если это так, то вполне вероятно, что у мышей с аномальным действием TH мозжечковая атаксия не проявляется так же, как у других модельных мышей. Это еще раз подчеркивает необходимость специального метода оценки влияния ТГ на функцию мозжечка. В данной статье представлен новый протокол исследования влияния ТГ на функцию мозжечка с использованием недавно созданного теста на основе лестничного пучка.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол экспериментов на животных в настоящем исследовании был одобрен Комитетом по уходу за животными и экспериментам Университета Гумма. Все процедуры по уходу и лечению животных выполнялись в соответствии с японским Законом о благополучии и управлении животными и Руководством по надлежащему проведению экспериментов на животных, выпущенным Научным советом Японии. Сборочный чертеж аппарата можно найти на рисунке 1.

1. Установка лестницы

  1. Испытание горизонтальной лестницы (Рисунок 2C слева)
    1. Вставьте алюминиевые палочки (диаметром 2 мм) в отверстия на стенках из оргстекла.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Расстояние между интервалами варьируется в зависимости от размера тела в зависимости от штамма или пола тестируемой мыши (см. Таблицу 1).
    2. Отрегулируйте ширину перекладин лестницы, расширив или сузив расстояние между стенами из плексигласа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ширина может варьироваться в зависимости от размера тела в зависимости от штамма или пола тестируемой мыши (см. Таблицу 1).
  2. Испытание зигзагообразной лестницей (Рисунок 2C справа)
    1. Вставьте алюминиевые палочки (диаметром 2 мм) в каждое третье отверстие в горизонтальном и вертикальном направлениях на стенках из оргстекла.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Расстояние между интервалами варьируется в зависимости от размера тела в зависимости от штамма или пола тестируемой мыши (см. Таблицу 1).
    2. Отрегулируйте ширину перекладин лестницы, расширив или сузив расстояние между стенами из плексигласа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ширина может варьироваться в зависимости от размера тела, штамма или пола тестируемой мыши (см. Таблицу 1).
    3. Поместите темную камеру в целевое место.
    4. Поместите подушку (можно из полиэтиленового пакета, набитого буферными материалами) на 30 см ниже лестницы для безопасности.

2. Привыкание (день 0)

ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется потратить не менее 1 дня на приучение мышей к лестничной установке.

  1. Поместите мышь на край лестницы (начальную точку).
  2. С помощью воздушной затяжки побудите мышь двигаться вперед по ступеньке лестницы.
  3. Повторяйте до тех пор, пока мышь не привыкнет ходить по ступенькам лестницы.

3. Измерение производительности двигателя

  1. Поместите мышь на край лестницы (начальную точку).
  2. Запишите время, необходимое для завершения пересечения лестницы, и количество соскальзываний ног, когда мыши не могут поставить лапы или поскальзываются после установки на алюминиевые палки (см. рисунок 2D). Если возможно, запишите видео, чтобы впоследствии проверить ошибки.
  3. Через 15-минутный интервал повторите измерение (4-5 попыток в день).
  4. Повторяйте эксперимент в течение 3-4 дней для оценки моторного обучения.

4. Анализ

  1. Рассчитайте среднее значение времени и промахов за день.
  2. Сравните среднее значение между группами.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В тесте rotarod мыши Mf-1/FVB показали значительное снижение латентности падения с вращающегося стержня в течение 3 дней подряд по сравнению с мышами дикого типа, что указывает на нарушение координации движений (рис. 3A). Тем не менее, с точки зрения внутригрупповых результатов, мыши Mf-1/FVB значительно улучшили свои результаты с 1-го по 3-й день, что свидетельствует о сохранении моторного обучения (рис. 3A).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Наш проект основывался на предыдущем исследовании Метца и Уишоу, которые сообщили о полезности «теста на ходьбу по лестнице»13,14. Они разработали тест ходьбы по лестнице для оценки навыков ходьбы и измерения положения передних и задних конечностей, шага и координации между конечностями, требуя от животных ходьбы от начальной точки до цели по горизонтальной лестнице13,14....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Работа выполнена при поддержке Японского общества содействия науке KAKENHI (гранты NoNo 18H03379 для N.K., 21K15340 для I.A. и 22J11280 для A.N.).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Воздушная затяжкаDAISO
Алюминиевые палкиCAINZдиаметром 2 мм, количество палочек может варьироваться в зависимости от конструкции лестницы. Примерно 30 палок может потребоваться для создания горизонтальной лестницы (интервал 4 см).
BlutackBostik
PlexiglassCAINZ110 см x 20 см, 110 см x 10 см, по 2 части
Винты КАЙНЦ

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Koibuchi, N., Chin, W. W. Thyroid hormone action and brain development. Trends in Endocrinology and Metabolism. 11 (4), 123-128 (2000).
  2. Koibuchi, N. The role of thyroid hormone on functional organization in the cerebellum. Cerebellum. 12 (3), 304-306 (2013).
  3. Rastogi, M. V., Lafranchi, S. H. Congenital hypothyroidism. Orphanet Journal of Rare Diseases. 5, 17(2010).
  4. Ishii, S., Amano, I., Koibuchi, N. The role of thyroid hormone in the regulation of cerebellar development. Endocrinology and Metabolism (Seoul). 36 (4), 703-716 (2021).
  5. Dunham, N. W., Miya, T. S. A note on a simple apparatus for detecting neurological deficit in rats and mice. The Journal of the American Pharmacists Association. 46 (3), 208-209 (1957).
  6. Jones, B. J., Roberts, D. J. The quantiative measurement of motor inco-ordination in naive mice using an acelerating rotarod. The Journal of Pharmacy and Pharmacology. 20 (4), 302-304 (1968).
  7. Lubrich, C., Giesler, P., Kipp, M. Motor behavioral deficits in the cuprizone model: Validity of the rotarod test paradigm. International Journal of Molecular Sciences. 23 (19), 11342(2022).
  8. Courchesne, E., Allen, G. Prediction and preparation, fundamental functions of the cerebellum. Learning and Memory. 4 (1), 1-35 (1997).
  9. Ninomiya, A., et al. Long-term depression-inductive stimulation causes long-term potentiation in mouse purkinje cells with a mutant thyroid hormone receptor. The Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (45), e2210645119(2022).
  10. Ito, M. Cerebellar long-term depression: Characterization, signal transduction, and functional roles. Physiological Reviews. 81 (3), 1143-1195 (2001).
  11. Miyata, M., et al. Deficient long-term synaptic depression in the rostral cerebellum correlated with impaired motor learning in phospholipase c beta4 mutant mice. The European Journal of Neuroscience. 13 (10), 1945-1954 (2001).
  12. Aiba, A., et al. Deficient cerebellar long-term depression and impaired motor learning in mglur1 mutant mice. Cell. 79 (2), 377-388 (1994).
  13. Metz, G. A., Whishaw, I. Q. Cortical and subcortical lesions impair skilled walking in the ladder rung walking test: A new task to evaluate fore- and hindlimb stepping, placing, and co-ordination. The Journal of Neuroscience Methods. 115 (2), 169-179 (2002).
  14. Metz, G. A., Whishaw, I. Q. The ladder rung walking task: A scoring system and its practical application. Journal of Visualized Experiments. (28), (2009).
  15. Mendes, C. S., et al. Quantification of gait parameters in freely walking rodents. BMC Biology. 13 (1), 50(2015).
  16. Cupido, A., et al. The Erasmus ladder: A new tool for the automated measurement of motor performance and motor learning in mice. Conference: Measuring behavior, Wageningen. , (2005).
  17. Sathyanesan, A., Kratimenos, P., Gallo, V. Disruption of neonatal purkinje cell function underlies injury-related learning deficits. The Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (11), e2017876118(2021).
  18. Martins, L. A., Schiavo, A., Xavier, L. L., Mestriner, R. G. The foot fault scoring system to assess skilled walking in rodents: A reliability study. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 16, 892010(2022).
  19. Shimokawa, N., et al. Altered cerebellum development and dopamine distribution in a rat genetic model with congenital hypothyroidism. Journal of Neuroendocrinology. 26 (3), 164-175 (2014).
  20. Amano, I., et al. Aberrant cerebellar development in mice lacking dual oxidase maturation factors. Thyroid. 26 (5), 741-752 (2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Thyroid HormoneCerebellar FunctionLadder Beam TestMotor PerformanceBehavioral AnalysisPurkinje CellsMotor CoordinationTransgenic MiceAtaxic PhenotypeRotarod Test

Похожие статьи