Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Индукция долговременной пластичности внутренней возбудимости нейронов в нейронах дорсального латерального коленчатого ядра

1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/65950

⸱

20 сентября 2024 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Unité de Neurobiologie des canaux Ioniques et de la Synapse (UNIS), UMR1072, INSERM, Aix-Marseille University

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы описываем протокол для индуцирования долгосрочной пластичности нейрональной внутренней возбудимости в релейных нейронах из дорсального латерального коленчатого ядра, поддерживаемого в срезах мозга ex vivo.

Аннотация

Дорсальное латеральное коленчатое ядро (dLGN) долгое время считалось основным ретранслятором для визуальной информации, идущей от сетчатки к корковым областям, но недавние результаты показывают, что в значительной степени недооценена функциональная пластичность основных клеток dLGN. Тем не менее, клеточные механизмы, поддерживающие эти изменения, не были полностью изучены. В данной работе мы сообщаем о протоколе индуцирования долгосрочного потенцирования внутренней возбудимости нейронов (LTP-IE) в дорсальных релейных клетках dLGN из острых срезов мозга молодых крыс. Внутренняя пластичность, как правило, индуцируется параллельно с синаптической пластичностью. Тем не менее, в нейронах dLGN LTP-IE надежно индуцируется за счет пиковой активности на частоте 40 Гц в течение 10 мин. LTP-IE в релейных нейронах dLGN является длительным, так как его можно отслеживать до 40 мин после протокола индукции. В заключение, результаты этого исследования предоставляют первые доказательства индукции внутренней пластичности в релейных клетках dLGN, что еще раз указывает на роль нейронов таламуса в визуальной пластичности, зависящей от активности.

Введение

Общая цель этой методической работы - предоставить простой способ индуцировать длительную пластичность нейронной возбудимости в зрительных таламических нейронах крысы in vitro, используя стандартный режим тока-зажима техники patch clamp1,2. Обоснованием разработки этой методики является ее простота и воспроизводимость. Преимущество перед альтернативными методами, такими как стимуляция синаптических входов в паре или без нее с постсинаптическими потенциалами действия, доставляемыми в заданное время, заключается в их надежности.

Традиционно считается, что пластичность в зрительной системе выражается исключительно на корковом уровне, в то время как дорсальное латеральное коленчатое ядро (dLGN), первичная реципиентная структура входов сетчатки на уровне таламуса, традиционно считается просто ретранслятором визуальной информации3. Тем не менее, этот первоначальный вывод был оспорен недавними работами, указывающими на то, что этот упрощенный взгляд не выдерживает критики дольше4,5,6. Например, функциональный дефицит зрительного ответа уже наблюдается у пациентов с амблиопией на стадии класса LGN7. Кроме того, большая часть релейных нейронов dLGN на данной монокулярной территории получает входные данные от каждого глаза, что указывает на потенциальную бинокулярность для большой части нейронов dLGN8,9,10. Более того, монокулярная депривация приводит к значительному сдвигу в доминировании глаз в нейронах dLGN5,11,12.

Среди механизмов функциональной пластичности, которые могут возникать при сдвиге доминирования глаза, пластичность внутренней возбудимости нейронов является потенциальным кандидатом. Действительно, многие области мозга, включая зрительные области, проявляют внутреннюю пластичность после выполнения различных поведенческих задач13,14. Сообщалось о долгосрочной внутренней пластичности центральных нейронов после стимуляции афферентных глутаматных входов15,16,17,18, spiking activity19,20, сенсорная стимуляция21 или после активности или сенсорной депривации20,22,23. В данной работе мы описываем протокол, позволяющий индуцировать долгосрочную потенциацию собственной возбудимости (LTP-IE) в релейных нейронах dLGN после пиковой активности на частоте 40 Гц. Частота возбуждения 40 Гц соответствует частоте, наблюдаемой у большинства нейронов dLGN in vivo при визуальной стимуляции24,25.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все эксперименты проводились в соответствии с европейскими и институциональными рекомендациями (Директива Совета 86/609/EEC и Французский национальный исследовательский совет и одобрены местным органом здравоохранения (Veterinary Services, Préfecture des Bouches-du-Rhône, Marseille)).

1. Животные

  1. Проводите эксперименты с участием 19-25-дневных крыс породы Лонг Эванс обоего пола (массой от 50 до 90 г).
  2. Размещайте животных в обычных пластиковых клетках вместе с матерью и однопометником. Поддерживайте постоянную температуру с помощью 12-часового цикла света/темноты и свободного доступа к воде и пище.

2. Острые срезы крысиного dLGN

  1. Приготовьте решения для резки/восстановления и внеклеточной записи.
    1. Для приготовления раствора для резки/восстановления смешайте 92 мМ n-метил-D-глутамин, 30 мМ NaHCO3, 25 мМ D-глюкозы, 10 мМ MgCl2, 2,5 мМ KCl, 0,5 мМ CaCl2, 1,2 мМ2PO4, 20 мМ Hepes, 5 мМ аскорбата натрия и 3 мМ пирувата натрия и барботируйте 95% O2-5% CO2 (pH 7,4). Держите режущий раствор холодным во время процедуры нарезки.
    2. Приготовьте записывающий раствор (искусственную спинномозговую жидкость, ACSF) путем смешивания 125 мМ NaCl, 26 мМ NaHCO3, 2 мМ CaCl2, 2,5 мМ KCl, 2 мМ MgCl2, 0,8 мМ2PO4 и 10 мМ D-глюкозу и постоянно уравновесьте ее 95% O, 2-5% CO2.
  2. Подготовьте инструменты для рассечения и две ледяные платформы (Рисунок 1A).
  3. Положите лед во внешний резервуар и заполните камеру нарезки вибратома ледяным раствором для резки (Рисунок 1B).
  4. Глубоко обезболить молодую крысу Лонг Эванса (возраст: P19-P25) изофлураном (5%). После подтверждения того, что животное глубоко обезболито (путем сильного ущипывания ноги без какой-либо реакции), усыпьте животное путем обезглавливания ножницами или гильотиной (в зависимости от возраста/размера животного) на уровне мозгового вещества. Поместите голову на первую ледяную платформу и каждые 10 с поливайте изолированную ткань кислородным раствором для ледяной нарезки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Процедуры анестезии и эвтаназии должны проводиться в отдельном помещении помещения для животных.
  5. Разрежьте кожу головы в каудальном направлении, а с помощью маленьких ножниц разрежьте череп с двух сторон. С помощью тупых щипцов вскрыть череп и быстро извлечь мозг из черепа с помощью шпателя и положить его на вторую ледовую платформу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Время не должно превышать 2 минут от обезглавливания до извлечения мозга.
  6. Сделайте 2 разреза во фронтальной плоскости мозга по всему мозгу: первый для удаления передней части коры и обонятельных луковиц (см. рисунок 1C) и второй на уровне нижнего холмика для удаления задней части коры и мозжечка.
  7. Приклейте мозговой блок на пластину вибратома ростральной стороной вверх (см. рисунок 1D,E). Регулярно (каждые 10 с) поливайте мозг в течение всей процедуры до тех пор, пока он не будет погружен в камеру для резки вибратома.
  8. Сделайте тонкие ломтики размером 350 мкм, содержащие dLGN с вибратомом (Рисунок 1G). Удалите кору и гиппокамп из среднего мозга с помощью карандаша, аккуратно потянув за эти структуры.
  9. Стремитесь к ломтикам с помощью сломанной пастеровской пипетки, подключенной к гибкой резиновой присоске (Рисунок 1H).
  10. Дайте ломтикам восстановиться в течение 20-30 минут в растворе для восстановления (Рисунок 1I).

3. Электрофизиология целоклеточного патч-хомута

ПРИМЕЧАНИЕ: Для записи целых клеток с помощью патч-клэмпа от релейных нейронов dLGN, используйте специальный усилитель патч-клэмпа.

  1. Включите насосы установки, чтобы внеклеточный регистрирующий физиологический раствор (см. состав в шаге 2.1) циркулировал в записывающей камере.
  2. Приготовьте внутриклеточный раствор, смешав 120 мМ K-глюконат, 20 мМ KCl, 10 мМ Hepes, 0,5 мМ EGTA, 2 мМ MgCl2, 2 мМ Na2АТФ и 0,3 мМ NaGTP (pH 7,4).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Внутриклеточный раствор можно приготовить заранее и хранить в замороженном виде при температуре -80°C. В размороженном состоянии раствор хранится при температуре 4 °C.
  3. Добавьте блокатор каналов ГАМКА, пикротоксин (конечная концентрация 100 мкМ) и антагонист ионотропных глутаматных рецепторов, кинуренат (2 мМ, конечная концентрация), к внеклеточному физиологическому раствору.
  4. Перенесите срез в погружную камеру, установленную на вертикальном микроскопе. Температура в камере регулируется на уровне 30 °C и непрерывно перфузируется уравновешенным аCSF.
  5. Поместите U-образную платиновую проволоку на срез и расположите срез так, чтобы визуализировать dLGN (Рисунок 2A).
  6. Приготовьте патч-пипетки из боросиликатных стеклянных пробирок, вытянутых с помощью съемника. Убедитесь, что патч-пипетки имеют сопротивление 5-10 МОм при заполнении внутриклеточным раствором.
  7. Визуализируйте dLGN при большом увеличении (40x или 60x) и выберите нейрон для записи патч-зажима с помощью дифференциальной интерференционно-контрастной инфракрасной видеомикроскопии (рисунок 2B). Подбирайте нейроны, исходя из их здорового внешнего вида (т.е. слегка набухших с острыми мембранными контурами).
  8. Расположите пластырь-пипетку на выбранном нейроне с постоянным положительным давлением с помощью микроманипулятора.
    1. Установите усилитель в режим VC и введите шаг напряжения 5 мВ. Установите напряжение на -65 мВ. Затем сбросьте положительное давление, чтобы получить уплотнение с высоким сопротивлением (соответствующим уменьшению тока в ответ на ступени напряжения). Слегка устремитесь через пипетку, чтобы получить прозрачные переходные процессы.
    2. Установите усилитель в режим CC, отбалансируйте мост, чтобы компенсировать сопротивление доступа, и удерживайте нейрон на -65 мВ.

4. Сбор данных

  1. Регистрация сигналов на частоте 20 кГц для лучшего обнаружения потенциалов быстрого действия. Установите фильтр нижних частот на 10 кГц для сигналов напряжения и тока.
  2. Контролируйте возбудимость нейронов в течение контрольного периода около 10 мин путем введения положительного импульса тока (обычно ~80-250 пА в течение 500 мс), достаточного для вызова 3-5 потенциалов действия в контрольных условиях с частотой 0,1 Гц.
  3. Контролируйте входное сопротивление нейрона на протяжении всего эксперимента с помощью короткого отрицательного импульса тока (обычно -20 пА в течение 100 мс). Поддерживайте постоянную амплитуду импульса тока до и после индукции LTP-IE.

5. Индукция LTP-IE

  1. После контрольного периода индуцируйте LTP-IE путем вызова последовательностей из 15 спайков, вызванных 15 короткими шагами (2-5 мс) деполяризующего тока, подаваемого с частотой 40 Гц в течение 10 минут.
  2. Выберите амплитуду импульса тока, чтобы каждый раз вызывать один потенциал действия (т. е. 15 потенциалов действия на цепочку).
    Примечание: Каждая цепь из 15 шипов вызывается с частотой 0,1 Гц (т.е. 60 линий и 900 шипов).

6. Анализ данных

ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура анализа одинакова до (условия контроля) и после индукции LTP-IE.

  1. Для каждой зарегистрированной кривой рассчитайте входное сопротивление (Rin) по реакции напряжения на небольшой импульс отрицательного тока, введенный перед шагом испытания тока (Rin =V step/Istep). Если в течение контрольного периода наблюдается разгон или спад входного сопротивления (более 10%), эксперимент следует прекратить.
  2. Выберите записанные трассы на основе потенциала мембраны перед инжекцией любого тока. Сохраняйте только следы с мембранным потенциалом покоя от -67 до -63 мВ.
  3. Количественно оцените LTP-IE в течение 10 минут, 20 минут после начала постиндукционного периода, измеряя количество AP, вызываемых каждым импульсом тока, и усредняя каждую минуту с помощью самодельной процедуры в программном обеспечении для анализа данных (см. Дополнительный файл 1 для процедуры Igor Pro). Обнаружение скачков напряжения при пересечении сигналом напряжения 0 мВ.
    Примечание: LTP-IE выражается в виде числа потенциалов действия, вызванных инжекцией импульса тока после протокола индукции по сравнению с предыдущим (%). Анализ проводился на -10-0 мин для исходного уровня и +20/+30 мин для теста.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Регистрация нейронов dLGN проводилась в конфигурации с целым &=nbsp;клеточным (whole-cell), а LTP-IE индуцировали путем подачи потенциалов действия с частотой 40 Hz в течение 10 min в присутствии антагонистов ионотропных глутаматных и ГАМК-рецепторов (Рисунок 3A). Через 20-30 min после индукции наблюдалось трехкратное увеличение количества потенциалов действия (Рисунок 3B) без изменений входного сопротивления, Rin (Рисунок 3C

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В данной работе мы сообщаем об индукции LTP-IE в нейронах dLGN, сохраняющихся живыми в острых срезах мозга путем стимуляции записанного нейрона для вызова потенциалов действия с частотой 40 Гц в течение 10 минут. Этот протокол легко внедрить в любой нейрофизиологической лаборатории, так как он требует минимального количества оборудования (слайсер, микроскоп, 1 усилитель, 1 плата сбора данных и компьютер). Тем не менее, необходимо выполнить несколько важных шагов для сбора ценных данных. Первым важным шагом в рамках прото...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

При поддержке INSERM, CNRS (для DD), AMU (для MR), FRM (DVS20131228768 для DD и DEQ20180839583 для DD), NeuroSchool (программа "France 2030" через A*Midex (Initiative d'Excellence d'Aix-Marseille Université, AMX-19-IET-004) и финансирование ANR (ANR-17-EURE-0029 для AW) и ANR (LoGiK, ANR-17-CE16-0022 для DD, Plastinex, ANR-21-CE16-013 для DD). Мы благодарим компанию A Venture & K Milton за отличный уход за животными.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Автоматизированное вибрационное лезвие микротомаLeicaVT-1200Sвибратом/слайсер
Боросиликатная стеклянная трубкаPhymepB-15086-10
Контроллер Typ VLuigs& NeumannTyp V
Программное обеспечение Игорь программное обеспечениеволновой анализа
Инфракрасная видеомикроскопияOlympusXM-10 Камера
KynurenateMerk/SigmaK3375AMPA/NMDA Блокатор рецепторов AMPA/NMDA
Малошумящая система сбора данныхAxon - Молекулярные приборыDigidata 1440AАналогово-цифровой интерфейс
МикроманипуляторыLuigs & NeumannLN Mini25
Multiclamp 200BAxon - Молекулярные приборыН/ДПатч-клэмп усилитель
Multiclamp 700BAxon - Молекулярные приборыН/Дпатч-клэмп усилитель
PC-100 ПуллерNarishigePC-100Пуллер микропипеток
PClamp10Axon - Молекулярные приборыН/Дпатч-клэмп программное обеспечение
ПикротоксинAbCamab120315блокатор рецепторов ГАМК
Срез мини-камера Луигс и ВертикальныйLN Chambre Slice mini I-IIпогружной камерой
OlympusBX51 WI
для записи вертикальный микроскоп Neumann с

Ссылки

  1. Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 391 (2), 85-100 (1981).
  2. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).
  3. Wiesel, T. N., Hubel, D. H. Effect of visual deprivation on morphology and physiology of cells in the cat's lateral geniculate body. J Neurophysiol. 26, 978-993 (1963).
  4. Sherman, S. M. The thalamus is more than just a relay. Curr Opin Neurobiol. 17 (4), 417-422 (2007).
  5. Rose, T., Bonhoeffer, T. Experience-dependent plasticity in the lateral geniculate nucleus. Curr Opin Neurobiol. 53, 22-28 (2018).
  6. Duménieu, M., Marquèze-Pouey, B., Russier, M., Debanne, D. Mechanisms of plasticity in subcortical visual areas. Cells. 10 (11), 3162(2021).
  7. Hess, R. F., Thompson, B., Gole, G., Mullen, K. T. Deficient responses from the lateral geniculate nucleus in humans with amblyopia. Eur J Neurosci. 29 (5), 1064-1070 (2009).
  8. Hammer, S., Monavarfeshani, A., Lemon, T., Su, J., Fox, M. A. Multiple retinal axons converge onto relay cells in the adult mouse thalamus. Cell Rep. 12 (10), 1575-1583 (2015).
  9. Morgan, J. L., Berger, D. R., Wetzel, A. W., Lichtman, J. W. The fuzzy logic of network connectivity in mouse visual thalamus. Cell. 165 (1), 192-206 (2016).
  10. Rompani, S. B., et al. Different modes of visual integration in the lateral geniculate nucleus revealed by single-cell-initiated transsynaptic tracing. Neuron. 93 (4), 767-776 (2017).
  11. Sommeijer, J. -P., et al. Thalamic inhibition regulates critical-period plasticity in visual cortex and thalamus. Nat Neurosci. 20 (12), 1715-1721 (2017).
  12. Jaepel, J., Hübener, M., Bonhoeffer, T., Rose, T. Lateral geniculate neurons projecting to primary visual cortex show ocular dominance plasticity in adult mice. Nat Neurosci. 20 (12), 1708-1714 (2017).
  13. Mozzachiodi, R., Byrne, J. H. More than synaptic plasticity: role of nonsynaptic plasticity in learning and memory. Trends Neurosci. 33 (1), 17-26 (2010).
  14. Debanne, D., Inglebert, Y., Russier, M. Plasticity of intrinsic neuronal excitability. Curr Opin Neurobiol. 54, 73-82 (2019).
  15. Sourdet, V., Russier, M., Daoudal, G., Ankri, N., Debanne, D. Long-term enhancement of neuronal excitability and temporal fidelity mediated by metabotropic glutamate receptor subtype 5. J Neurosci. 23 (32), 10238-10248 (2003).
  16. Campanac, E., Gasselin, C., Baude, A., Rama, S., Ankri, N., Debanne, D. Enhanced intrinsic excitability in basket cells maintains excitatory-inhibitory balance in hippocampal circuits. Neuron. 77 (4), 712-722 (2013).
  17. Incontro, S., et al. Endocannabinoids tune intrinsic excitability in O-LM interneurons by direct modulation of postsynaptic Kv7 channels. J Neurosci. 41 (46), 9521-9538 (2021).
  18. Sammari, M., Inglebert, Y., Ankri, N., Russier, M., Incontro, S., Debanne, D. Theta patterns of stimulation induce synaptic and intrinsic potentiation in O-LM interneurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (44), e2205264119(2022).
  19. Cudmore, R. H., Turrigiano, G. G. Long-term potentiation of intrinsic excitability in LV visual cortical neurons. J Neurophysiol. 92 (1), 341-348 (2004).
  20. Nataraj, K., Le Roux, N., Nahmani, M., Lefort, S., Turrigiano, G. Visual deprivation suppresses L5 pyramidal neuron excitability by preventing the induction of intrinsic plasticity. Neuron. 68 (4), 750-762 (2010).
  21. Aizenman, C. D., Akerman, C. J., Jensen, K. R., Cline, H. T. Visually driven regulation of intrinsic neuronal excitability improves stimulus detection in vivo. Neuron. 39 (5), 831-842 (2003).
  22. Desai, N. S., Rutherford, L. C., Turrigiano, G. G. Plasticity in the intrinsic excitability of cortical pyramidal neurons. Nat Neurosci. 2 (6), 515-520 (1999).
  23. Brown, A. P. Y., Cossell, L., Margrie, T. W. Visual experience regulates the intrinsic excitability of visual cortical neurons to maintain sensory function. Cell Rep. 27 (3), 685-689 (2019).
  24. Denman, D. J., Contreras, D. On parallel streams through the mouse dorsal lateral geniculate nucleus. Front Neural Circuits. 10, 20(2016).
  25. Sriram, B., Meier, P. M., Reinagel, P. Temporal and spatial tuning of dorsal lateral geniculate nucleus neurons in unanesthetized rats. J Neurophysiol. 115 (5), 2658-2671 (2016).
  26. Duménieu, M., et al. Visual activity enhances neuronal excitability in thalamic relay neurons. bioRxiv. , (2023).
  27. Chen, C., Regehr, W. G. Developmental remodeling of the retinogeniculate synapse. Neuron. 28 (3), 955-966 (2000).
  28. Sherman, S. M. Thalamus plays a central role in ongoing cortical functioning. Nat Neurosci. 19 (4), 533-541 (2016).
  29. Cudmore, R. H., Fronzaroli-Molinieres, L., Giraud, P., Debanne, D. Spike-time precision and network synchrony are controlled by the homeostatic regulation of the D-type potassium current. J Neurosci. 30 (38), 12885-12895 (2010).
  30. Zbili, M., et al. Homeostatic regulation of axonal Kv1.1 channels accounts for both synaptic and intrinsic modifications in the hippocampal CA3 circuit. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (47), e2110601118(2021).
  31. Gray, C. M., Singer, W. Stimulus-specific neuronal oscillations in orientation columns of cat visual cortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (5), 1698-1702 (1989).
  32. Galuske, R. A. W., Munk, M. H. J., Singer, W. Relation between gamma oscillations and neuronal plasticity in the visual cortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (46), 23317-23325 (2019).
  33. Inglebert, Y., Aljadeff, J., Brunel, N., Debanne, D. Synaptic plasticity rules with physiological calcium levels. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (52), 33639-33648 (2020).
  34. Blitz, D. M., Regehr, W. G. Timing and specificity of feed-forward inhibition within the LGN. Neuron. 45 (6), 917-928 (2005).
  35. Chrobok, L., Palus-Chramiec, K., Chrzanowska, A., Kepczynski, M., Lewandowski, M. H. Multiple excitatory actions of orexins upon thalamo-cortical neurons in dorsal lateral geniculate nucleus - implications for vision modulation by arousal. Sci Rep. 7 (1), 7713(2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Визуальные таламусные нейроныметод локальной фиксации потенциала (патч-кламп)подготовка среза мозгаконфигурация «целая клетка»генерация потенциалов действияпластичность ионных каналоввизуальная пластичность
Индукция долговременной пластичности внутренней возбудимости нейронов в нейронах дорсального латерального коленчатого ядра
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.