Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

Summary

В этой статье представлен протокол, который позволяет проводить неинвазивную и автоматизированную оценку мелкой моторики, а также адаптивное и ассоциативное моторное обучение при выполнении задач с помощью устройства под названием Erasmus Ladder. Сложность задачи может быть титрована для выявления двигательных нарушений в диапазоне от основных до незначительных степеней.

Abstract

Поведение формируется действиями, а действия требуют двигательных навыков, таких как сила, координация и обучение. Ни одно из видов поведения, необходимых для поддержания жизни, не было бы возможным без способности переходить из одного положения в другое. К сожалению, двигательные навыки могут быть нарушены при широком спектре заболеваний. Таким образом, изучение механизмов двигательных функций на клеточном, молекулярном и цепном уровнях, а также понимание симптомов, причин и прогрессирования двигательных нарушений имеет решающее значение для разработки эффективных методов лечения. Для этой цели часто используются модели мышей.

В этой статье описывается протокол, который позволяет контролировать различные аспекты двигательной производительности и обучения у мышей с помощью автоматизированного инструмента под названием Erasmus Ladder. Тест включает в себя две фазы: начальную фазу, в которой мышей обучают перемещаться по горизонтальной лестнице, построенной из неправильных ступеней («обучение мелкой моторики»), и вторую фазу, когда на пути движущегося животного появляется препятствие. Возмущение может быть неожиданным («проблемное моторное обучение») или предваряться слуховым тоном («ассоциативное моторное обучение»). Задача проста в проведении и полностью поддерживается автоматизированным программным обеспечением.

В этом отчете показано, как различные показания теста, при анализе с помощью чувствительных статистических методов, позволяют точно контролировать моторику мышей с использованием небольшой когорты мышей. Мы предполагаем, что метод будет высокочувствителен для оценки двигательных адаптаций, обусловленных изменениями окружающей среды, а также тонких моторных дефицитов на ранних стадиях у мутантных мышей с нарушенными двигательными функциями.

Introduction

Для оценки моторных фенотипов у мышей было разработано множество тестов. Каждый тест дает информацию о конкретном аспекте двигательного^{поведения1}. Например, тест открытого поля информирует об общей локомоции и тревожном состоянии; испытания на координацию и равновесие на вращающейся и шагающей балке; Анализ футпринта связан с походкой; беговая дорожка или беговое колесо на принудительных или произвольных физических упражнениях; А сложное колесо — это обучение моторике. Чтобы проанализировать моторные фенотипы мышей, исследователи должны проводить эти тесты последовательно, что требует много времени и усилий, а часто и нескольких когорт животных. Если есть информация на клеточном или сетевом уровне, исследователь обычно выбирает тест, который отслеживает связанный аспект и вытекает из него. Тем не менее, парадигмы, которые бы различали различные аспекты моторного поведения автоматическим способом, отсутствуют.

В этой статье описывается протокол использования Erasmus Ladder ^2,3, системы, которая позволяет комплексно оценить различные особенности моторного обучения у мышей. Основными преимуществами метода являются воспроизводимость и чувствительность метода, а также способность титровать моторные трудности и отделять дефицит двигательных функций от нарушения ассоциативно-моторного обучения. Основной компонент состоит из горизонтальной лестницы с чередующимися высокими (H) и низкими (L) перекладинами, оснащенных сенсорными датчиками, которые определяют положение мыши на лестнице. Лестница изготовлена из 2 x 37 ступеней (L, 6 мм; H, 12 мм), расположенные на расстоянии 15 мм друг от друга и расположенные попеременно слева и справа с зазорами 30 мм (рис. 1А). Перекладины можно перемещать по отдельности для создания различных уровней сложности, то есть создания препятствия (поднимая высокие ступени на 18 мм). В сочетании с автоматизированной системой регистрации и ассоциацией модификаций паттерна ступеней с сенсорными стимулами, лестничные тесты Эразма для обучения мелкой моторики и адаптации двигательных функций в ответ на вызовы окружающей среды (появление более высокой ступени для имитации препятствия, безусловный стимул [УЗИ]) или ассоциацию с сенсорными стимулами (тон, условный стимул [CS]). Тестирование включает в себя два отдельных этапа, каждый из которых оценивает улучшение двигательных характеристик в течение 4 дней, в течение которых мыши проходят сеанс из 42 последовательных испытаний в день. На начальном этапе мышей обучают перемещаться по лестнице, чтобы оценить «хорошее» или «квалифицированное» моторное обучение. Вторая фаза состоит из чередующихся испытаний, где на пути движущегося животного появляется препятствие в виде более высокой ступени. Возмущение может быть неожиданным для оценки «проблемного» моторного обучения (испытания только для США) или сигналом слуха для оценки «ассоциативного» моторного обучения (парные испытания).

Лестница Эразма была разработана относительно недавно ^2,3. Он не получил широкого распространения, потому что настройка и оптимизация протокола требовали целенаправленных усилий и был специально разработан для оценки ассоциативного обучения, зависящего от мозжечка, без детального изучения его потенциала для выявления других двигательных дефицитов. На сегодняшний день его способность выявлять тонкие двигательные нарушения, связанные с дисфункцией мозжечка, у мышей 3,4,5,6,7,8. Например, мыши с нокаутом connexin36 (Cx36), у которых в оливарных нейронах нарушены щелевые контакты, демонстрируют дефицит возбуждения из-за отсутствия электротонической связи, но моторный фенотип было трудно определить. Тестирование с использованием лестницы Эразма показало, что роль нижних оливарных нейронов в задаче обучения мозжечковой моторики заключается в кодировании точного временного кодирования стимулов и облегчении зависимых от обучения реакций на неожиданные^{события.} Мышь с нокаутом Fragile X Messenger Ribonucleoprotein 1 (Fmr1), модель синдрома Fragile-X-Syndrome (FXS), демонстрирует хорошо известные когнитивные нарушения наряду с более легкими дефектами в формировании процедурной памяти. Нокауты Fmr1 не показали существенных различий во времени шагов, ошибках в каждом испытании или улучшении двигательных характеристик по сравнению с занятиями по лестнице Эразма, но не смогли приспособить свой паттерн ходьбы к внезапно появившемуся препятствию по сравнению с их однопометниками дикого типа (WT), что подтверждает специфический дефицит процедурной и ассоциативной памяти ^3,5. Кроме того, клеточно-специфические мутантные линии мышей с дефектами функции мозжечка, включая нарушение выхода клеток Пуркинье, потенцирования и выхода клеток интернейронов или гранул молекулярного слоя, демонстрировали проблемы в координации движений с измененным приобретением эффективных шаговых паттернов и в количестве шагов, предпринятых для пересечения^{лестницы.} Травма головного мозга у новорожденных вызывает мозжечковый дефицит обучения и дисфункцию клеток Пуркинье, которые также могут быть обнаружены с помощью лестницы Эразма ^7,8.

В этом видео мы представляем подробное пошаговое руководство, в котором подробно описана настройка поведенческой комнаты, протокол поведенческого теста и последующий анализ данных. Этот отчет создан для того, чтобы быть доступным и удобным для пользователя, и разработан специально для помощи новичкам. Этот протокол дает представление о различных фазах двигательной тренировки и ожидаемых двигательных паттернах, которые усваивают мыши. Наконец, в статье предлагается систематический рабочий процесс для анализа данных с использованием мощного нелинейного регрессионного подхода, дополненный ценными рекомендациями и предложениями по адаптации и применению протокола в других исследовательских контекстах.

Protocol

В настоящем исследовании использовались взрослые (2-3 месяца) мыши C57BL/6J обоего пола. Животные содержались от двух до пяти человек в клетке с неограниченным доступом к пище и воде в помещении для животных, за которыми ведется наблюдение, и содержались в среде с контролируемой температурой в течение 12-часового цикла темноты/света. Все процедуры были проведены в соответствии с европейскими и испанскими правилами (2010/63/UE; RD 53/2013) и были одобрены Этическим комитетом Женералитата Валенсианы и Комитетом по благополучию животных Университета Мигеля Эрнандеса. 1. Настройка поведенческой комнаты Резервируйте комнату для поведенческого тестирования каждый день в одно и то же время и устанавливайте список и порядок использования мышей, а также организуйте их размещение. Держите подопытных мышей за пределами испытательной комнаты, чтобы они не слышали звуков воздушного компрессора и звуковых сигналов Erasmus Ladder, когда их не тестируют. Убедитесь, что все компоненты системы Erasmus Ladder в порядке и готовы к использованию: сетевой маршрутизатор, компьютер с программным обеспечением (см. Таблицу материалов), воздушный компрессор, два ящика для ворот и лестница с правильно расположенными перекладинами. Тщательно очищайте ящики для ворот, лестницу и перекладины водой после каждого животного и водой с 70% этанолом в конце каждого тренировочного дня. 2. Протокол поведенческого теста Создайте эксперимент и введите протокол в программное обеспечение (дополнительный рисунок S1).Включите программное обеспечение. Чтобы создать эксперимент, выберите Файл | Новый эксперимент | Новый или настроенный | Протокол эксперимента.ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол по умолчанию, используемый в этом исследовании, называется EMC и был разработан в Медицинском центре Университета Эразма в Роттердаме. Присвойте эксперименту имя и нажмите кнопку ОК. Убедитесь, что выбранный протокол ЭМС по умолчанию состоит из 4 дней сеансов без помех (42 испытания без помех в день) и 4 дней сеансов испытаний (42 ежедневных смешанных испытания: без помех, только CS (тональный сигнал), только для США (препятствие), парный (препятствие объявляется звуковым сигналом) (см. рисунок 1B). На правой боковой панели также проверьте световой сигнал (максимальная продолжительность 3 с), воздушный сигнал (максимальная продолжительность 45 с) и попутный ветер (да во всех типах испытаний), используемые для того, чтобы побудить мышь пересечь лестницу, и звуковой сигнал (250 мс, Да только в CS-only и парных испытаниях). Чтобы создать другой протокол, выберите Настройка | Протокол эксперимента | Новинка | С нуля или Скопируйте из протокола ЭМС и просто измените его, отредактировав строки таблицы, относящиеся к количеству сеансов (дней эксперимента) и количеству и типу испытаний в день.ПРИМЕЧАНИЕ: Время отдыха, тип сигналов и активация, длительность, интенсивность и интервал также могут быть адаптированы в соответствии с экспериментальными вопросами. Чтобы открыть список сеансов и присвоить темам имена, выберите Настройка | Список сеансов. Нажмите « Добавить темы и переменные». Введите каждый конкретный идентификатор мыши, дату рождения, пол, генотип и соответствующие категории, следуя упорядоченному списку мышей. Начните сеанс (дополнительный рисунок S2).Перед запуском убедитесь, что программное обеспечение открыто, затем включите Ladder. Убедитесь, что воздушный компрессор подключен и включен. Чтобы открыть окно Сбор данных, откройте созданный эксперимент. Выберите Приобретение | Открытое приобретение. Поместите мышь с идентификатором, указанным программным обеспечением, в поле стартовой цели (правая сторона лестницы). Выберите идентификатор мыши , который будет получен в первом сеансе. Нажмите « Начать приобретение». Нажмите красную ручку меню лестницы 3 раза. Убедитесь, что сеанс запускается и автоматически контролирует и записывает движения мыши до конца последней попытки сеанса. Завершите сеанс.Убедитесь, что в конце42-й попытки на дисплее отображаются сообщения Sending Data (Отправка данных ) и Acquired (Получено). Верните мышь в домашнюю клетку. Очистите лестницу и ящики для ворот. Поместите следующую мышь и повторите, начиная с шага 2.2.6. Выполняйте выбранный тип сеанса каждый день до конца протокола. Повторяйте шаги 2.2 и 2.3 каждый день в соответствии с выбранным протоколом. Экспортируйте данные (дополнительный рисунок S2).Чтобы визуализировать записанные данные, выберите в меню «Анализ » « Статистика пробной версии», «Статистика сеанса» и «Групповая статистика и диаграммы».ПРИМЕЧАНИЕ: Данные могут быть загружены в виде электронной таблицы с данными по отдельным испытаниям и средними значениями для тех же типов испытаний в рамках сеанса. Сеансы также могут быть отфильтрованы по переменным, выбранным для конкретного анализа. Нажмите кнопку «Экспорт» в правом верхнем углу, выбрав формат файла (таблицу) и расположение папки. Щелкните правой кнопкой мыши по автоматически сгенерированным диаграммам и выберите «Сохранить в файл как *.jpg». 3. Анализ данных ПРИМЕЧАНИЕ: Лестница Эразмуса автоматически измеряет список параметров на основе мгновенной записи действий сенсорных датчиков. Для анализа выходные параметры, выбранные пользователем, организуются и обрабатываются в электронных таблицах. Наряду с графиками, сгенерированными программным обеспечением, пользователи могут создавать графики с помощью выбранного программного обеспечения для построения графиков для визуализации конкретных изменений различных параметров в течение сеансов. Выберите конкретные параметры для анализа базальной мотивации или тревожных состояний, сенсорных реакций, моторики и обучения мелкой моторике в течение первых 4 дней.Выберите и постройте график управляющих параметров, включая время отдыха в поле ворот и время выхода из поля ворот после периода отдыха в ответ на сигналы света и воздуха (рис. 2A).ПРИМЕЧАНИЕ: Время покоя или реакция на сигналы относительно постоянны у мышей WT. Другие параметры, такие как частота выходов, в основном пренебрежимо малы у мышей WT – животные редко покидают бокс отдыха без сигналов или возвращаются один раз в лестнице, что приводит к частоте выхода, равной 1 за попытку. Если животное выходит на улицу до того, как будут применены сигналы, активируется воздушный поток, заставляющий мышь вернуться к воротам; Это не считается пробной версией программного обеспечения. Выберите и постройте график времени на лестнице после сигналов, измеряемого как время, затраченное на пересечение лестницы после того, как мышь покинула поле ворот (рис. 2B).ПРИМЕЧАНИЕ: Степенная нелинейная регрессия является надежным методом оценки обучения. Коэффициенты Пирсона или Спирмена (R) обеспечивают меру того, является ли подгонка данных хорошей (значения R, близкие к единице, когда животные обучаются/совершенствуются в течение сеансов; Значения R, близкие к 0, означают, что данные постоянны и мыши не обучаются. Выберите и постройте график параметров пошагового шаблона , таких как процент проб с ошибками , в качестве чувствительного параметра обучения (рис. 2C) .Определите правильный шаг как шаг от верхней ступени до другой высокой ступени (H-H), независимо от длины шага. Считайте, что типы шагов, включающие более низкую ступень, являются ошибками. Разделите правильные шаги и оплошности на короткие и длинные шаги, шаги назад и прыжки в зависимости от длины и направленности шага между нажатыми ступенями (см. рис. 1А). Выберите и постройте график для оценки проблемного моторного обучения (испытания только в США) и ассоциативного обучения (парные испытания) за последние 4 дня.Выберите и постройте график времени на лестнице после подсказок (рис. 3). Выберите и постройте график процента испытаний с ошибками (рис. 4A). Выберите и постройте график времени шага до и после возмущения, определяемого как разность точности в мс между активацией ступени непосредственно перед (контрольный шаг) и после препятствия (адаптированный шаг) на той же стороне лестницы (рисунок 4B). ПРИМЕЧАНИЕ: Для сравнения данных внутри каждого типа сеанса необходимо провести анализ времени шага до и после возмущения. Параметр измеряет способность мышей предсказывать и преодолевать препятствия во время ассоциативного обучения. Анализируйте данные с помощью специального статистического программного обеспечения (например, SigmaPlot). Выполняйте силовой нелинейный регрессионный анализ данных, собранных из одного и того же типа испытания в разных сессиях, чтобы более эффективно описать процесс обучения, и используйте двусторонние повторные измерения (RM) ANOVA для сравнения типов испытаний.

Representative Results

Устройство, настройка и протокол Erasmus Ladder представлены на рисунке 1. Протокол состоит из четырех спокойных и четырех пробных сессий (по 42 испытания в каждой). Каждое испытание представляет собой одну пробежку по лестнице между стартовой и конечной ячейками ворот. В начал?…

Discussion

Лестница Эразма предоставляет значительные преимущества для оценки моторного фенотипа по сравнению с существующими подходами. Тестирование легко проводить, оно автоматизировано, воспроизводимо и позволяет исследователям оценивать различные аспекты двигательного поведения по отде…

Materials

C57BL/6J mice (Mus musculus)	Charles Rivers
Erasmus Ladder device	Noldus, Wageningen, Netherlands
Erasmus Ladder 2.0 software	Noldus, Wageningen, Netherlands
Excel software	Microsoft
Sigmaplot software	Systat Software, Inc.