Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Быстрое и эффективное обогащение микроглии спинного мозга мышей

2.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/65961

⸱

22 сентября 2023 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Epidemiology, Endocrinology & Nutrition, Mexico Children's Hospital, 2Pharmacy Department, National School of Biological Sciences, National Polytechnic Institute, 3Graduate Department, Dr. Eduardo Liceaga General Hospital of Mexico, 4Pain Clinic and Palliative Care, Dr. Eduardo Liceaga General Hospital of Mexico, 5General Surgery Service, Metropolitan Angeles Hospital

В этой статье

Краткое содержание

Микроглия считается одной из самых универсальных клеток в организме, способных к морфологической и функциональной адаптации. Их гетерогенность и многофункциональность позволяют поддерживать гомеостаз мозга, а также связаны с различными неврологическими патологиями. Здесь описана методика очищения микроглии спинного мозга.

Аннотация

Позвоночный столб определяет позвоночное животное и формирует спинномозговой канал, полость, которая окружает и защищает спинной мозг. Правильное развитие и функционирование центральной нервной системы млекопитающих в значительной степени зависят от активности резидентных макрофагов, известных как микроглия. Микроглия проявляет гетерогенность и многофункциональность, обеспечивая различную экспрессию и поведение генов в спинном и головном мозге. В многочисленных исследованиях изучалась функция церебральной микроглии, подробно описывались методы очистки. Однако очищение микроглии от спинного мозга у мышей не имеет исчерпывающего описания. В отличие от этого, использование высокоочищенной коллагеназы, в отличие от нерафинированного экстракта, не находит отклика в тканях центральной нервной системы. В этом исследовании позвоночный столб и спинной мозг были вырезаны у 8-10-недельных мышей C57BL/6. В последующем расщеплении использовалась высокоочищенная коллагеназа, а в очистке микроглии использовался градиент плотности. Клетки подвергались окрашиванию для проточной цитометрии, оценивая жизнеспособность и чистоту с помощью окрашивания CD11b и CD45. Результаты показали среднюю жизнеспособность 80% и среднюю чистоту 95%. В заключение, манипуляции с микроглией мыши включали в себя пищеварение высокоочищенной коллагеназой с последующим градиентом плотности. Этот подход эффективно привел к созданию значительных популяций микроглии спинного мозга.

Введение

Определяющей характеристикой позвоночных является позвоночный столб или позвоночник, в котором хорда заменена последовательностью сегментированных костей, называемых позвонками, разделенных межпозвоночными дисками. Эта последовательность костного материала формирует спинномозговой канал, полость, которая окружает и защищает спинной мозг1. У рода Rodentia позвоночник обычно образован семью шейными позвонками, тринадцатью грудными позвонками, шестью поясничными позвонками и переменным числом хвостовых позвонков 2,3. Длина спинного мозга аналогична длине позвоночника, а концевая нить является ненервной структурой, которая прикрепляет спинной мозг к крестцу. Кроме того, нервные волокна выходят через межпозвонковое отверстие1.

Развитие и правильное функционирование центральной нервной системы у млекопитающих в решающей степени зависит от активности резидентных макрофагов нервной системы, называемых микроглией4. Хотя микроглия первоначально описывалась как резидентные фагоциты мозга, недавние исследования приписывают этим клеткам множество динамических функций 5,6. Размер микроглии колеблется от 7 до 10 мкм в гомеостазе; Они считаются одними из самых универсальных клеток в организме и могут морфологически и функционально адаптироваться к постоянно меняющейся окружающей среде7. Эти клетки демонстрируют высокую гетерогенность как на эмбриональной, так и на взрослой стадиях8,9, в то время как на взрослой стадии они также демонстрируют сложную функциональную гетерогенность, основанную на их пространственно-временном контексте10. Гетерогенность и множественность функций микроглии обеспечивают дифференцированную экспрессию и поведение генов в спинном и головном мозге. Показано, что экспрессия CD11b, CD45, CD86 и CCR9 выше в спинном мозгепо сравнению с головным мозгом 8,9.

Существует несколько протоколов для выделения церебральной микроглии11,12; Однако для микроглии спинного мозга13,14 существует лишь несколько. Оптимизация метода очистки микроглии от спинного мозга способствует развитию многочисленных исследований, направленных на изучение физиологии микроглии. Этот протокол направлен на описание простого и высоковоспроизводимого извлечения спинного мозга мыши и очистки микроглии (рис. 1).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Исследование проводилось в соответствии с официальным мексиканским стандартом NOM-062-ZOO-1999 и руководством по уходу и использованию лабораторных животных. Одобрение на проведение исследования было получено от комитетов по исследованиям, этике и биобезопасности Детской больницы Мексики (HIM/2023/006) и Комитета по исследованиям и биоэтике Больницы общего профиля Мексики имени Эдуардо Лисеаги (DI/21/501/04/62). Три мыши C57BL/6 в возрасте от 6 до 8 недель были получены из Детской больницы Мексики, где они выращивались в изолированных условиях в вентилируемых стойках в соответствии с рекомендациями по уходу за животными и их использованию.

1. Подготовка материалов и реагентов

  1. Предварительно прогрейте до 37 °C свободный от Ca 2+ и Mg2+ PBS, а также сбалансированный солевой раствор Хэнка (HBSS).
  2. Дополните раствор HBSS 100 мкг/мл либеразы и 4 мкг/мл ДНКазы (HBSS-LD). Следите за тем, чтобы раствор поддерживал физиологический рН 7,4.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимо 1 мл рабочего раствора на спинной мозг.
  3. Приготовьте изотонический 90%-ный раствор для центрифугирования с градиентом плотности (имеется в продаже, см. Таблицу материалов) и подогрейте его до 37 °C.
  4. Приготовьте буфер для окрашивания, смешав 5% инактивированную при нагревании фетальную бычью сыворотку (FBS) с PBS, и храните смесь на льду.
  5. Предварительно нагрейте Modified Eagle's Medium-high глюкозы Dulbecco (1 г/л) (DMEM) до 37 °C.
  6. Для получения DMEM-S добавляют в среду DMEM 10% FBS, 2 мМ L-глютамина, 200 ЕД/мл пенициллина, 200 мкг/мл стрептомицина и 500 пг/мл амфотерицина B (см. таблицу материалов).

2. Рассечение и препарирование спинного мозга

  1. Усыпляют мышь внутрибрюшинной передозировкой пентобарбитала в дозе 150 мг/кг. Стерилизуйте грудную клетку и спину мыши, используя 70% этанол.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что эвтаназия прошла успешно, прежде чем приступать к вскрытию мыши.
  2. Побрейте грудопоясничную область и закрепите конечности на доске для препарирования с помощью клейкой ленты.
  3. С помощью скальпеля сделайте аккуратный надрез вдоль дорсальной средней линии от затылочной до крестцовой области (рисунок 2).
  4. С помощью стереоскопического хирургического микроскопа рассекают послойно, пока не дойдете до поясничного отдела позвоночника и не определите последнюю реберную дугу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 13 реберных дуг сочленяются в грудных позвонках; при рассечении они становятся видимыми выше L1 позвонка2.
  5. Определите последний шейный позвонок и крестец, затем сделайте надрез для отделения позвоночника (рисунок 2).
  6. С помощью рассекающих щипцов выполняют дорсальную ламинэктомию позвонков для извлечения спинного мозга (рис. 3A-D).
    ПРИМЕЧАНИЕ: За исключением первых двух шейных позвонков (атланта и оси), все подвижные позвонки имеют общий морфологический дизайн в различных областях (шейном, грудном или поясничном). Каждый типичный подвижный позвонок имеет цилиндрическое тело позвонка на переднем конце. К задней части тела прикреплена костная дуга, известная как дуга позвонка (невральная дуга), состоящая из пластинок и остистых отростков. Между этими структурами лежит позвоночное отверстие15.
  7. Удаляют нервы, выходящие через отверстия (дорсальные и вентральные корешки), которые составляют периферическую нервную систему и могут содержать инфильтрированные макрофаги (рис. 3D).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Нет необходимости удалять pia mater или мозговые оболочки, так как среда градиента плотности эффективно устраняет загрязнение астроцитов. Кроме того, сохранение мозговых оболочек сокращает время очистки и повышает жизнеспособность.

3. Расщепление тканей и выделение микроглии

  1. Поместите спинной мозг на препарирующую доску и ножницами Vannas разрежьте спинной мозг на кусочки по 2 мм, в среднем получится 10 кусочков.
  2. Перенесите участки спинного мозга в плоскодонную микропробирку объемом 2 мл (рис. 3E, F).
  3. Добавьте 1 мл рабочего раствора HBSS-LD (шаг 1.2). Инкубируйте при температуре 37 °C в течение 25 минут, энергично взбалтывая каждые 5 минут.
  4. Пропускайте содержимое каждого разложения через ситечко 40 мкм, а затем добавляйте 7 мл HBSS с 2% FBS, чтобы нейтрализовать разложение.
  5. Измельчите оставшуюся ткань с помощью поршня шприца объемом 1 мл. Центрифугу суспензии в конической пробирке объемом 50 мл в течение 5 мин при 220 x g, 4 °C.
  6. Выбросьте надосадочную жидкость с помощью микропипетки объемом 1 мл и повторно суспендируйте гранулу в 2 мл HBSS с 2% FBS в конической пробирке объемом 15 мл. Смешайте с 2 мл среды с градиентом изотонической плотности 90%. Центрифуга в течение 25 мин при 160 x g, 18 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте медленное ускорение и избегайте использования тормоза.
  7. Используйте пипетку для переноса, чтобы извлечь границу раздела и перенести ее в коническую пробирку объемом 15 мл. Промойте клетки 10 мл PBS и центрифугируйте в течение 5 минут при 220 x g, 4 °C.
  8. Ресуспендируйте клетки в DMEM-S (шаг 1.6) и храните их на льду.

4. Определение чистоты/жизнеспособности

  1. Для количественного определения жизнеспособных клеток с помощью камеры гемоцитометра используют 0,4%-ный краситель трипанового синего (см. таблицу материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: В среднем, одна мышь обеспечивает 4-6 миллионов клеток.
  2. Для количественного определения жизнеспособных клеток с помощью проточного цитометра используют коммерчески доступное амино-реактивное окрашивание флуоресцентными красителями (см. таблицу материалов).
    1. Перенесите 1 миллион клеток в полистирольную пробирку с круглым дном (FACS) объемом 5 мл. Флуоресцентный краситель разбавляют ПБС в соотношении 1:1000 (создавая рабочий раствор жизнеспособности).
    2. Инкубируют образцы с раствором жизнеспособности в темноте при 4 °С в течение 30 мин. Промойте клетки ледяным ПБС дважды. Ресуспендируйте клетки в 400 мкл окрашивающего буфера (шаг 1.4).
    3. Заблокируйте ячейки 2.4G2 anti-FcRIII/I (см. таблицу материалов) в ледяном окрашивающем буфере на 15 мин при 4 °C.
    4. Разработайте рецепт для окрашивания антителами, добавив флуоресцентно меченные моноклональные антитела CD45-PerCP и CD11b-eFluor 450 в окрашивающий буфер (в разведении 1:300) (см. таблицу материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на то, что доступны оба метода, выберите тот, который лучше всего соответствует последующему протоколу.
    5. Инкубируют образцы с коктейлем из окрашивания антителами в темноте при 4 °C в течение 30 мин. Промойте клетки ледяным красящим буфером дважды. Ресуспендируйте клетки в 400 мкл окрашивающего буфера.
    6. Регистрируйте 250 000 событий на проточном цитометре, как описано в стратегии стробирования на шаге 6 (рис. 4).

5. Иммунофлуоресцентное окрашивание

  1. Поместите предварительно обработанный покровный листок в углубление 6-луночной пластины.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для обработки покровных стекол поместите их в чашку Петри с 500 мкл раствора L-полилизина (0,01 мг/мл, см. таблицу материалов) и инкубируйте в течение 1 ч. После этого трижды промойте их дистиллированной водой и дайте высохнуть.
  2. Высевают 200 000 клеток на обработанное покровное стекло, используя 500 мкл раствора DMEM-S. Инкубируют в течение 24 ч.
  3. Снимите покровные стекла и зафиксируйте ячейки с помощью 3,7% параформальдегида (PFA) в течение 20 минут при комнатной температуре. Трижды промойте покровные стекла ледяным ПБС.
  4. Пермеабилизацию клеток 0,2% Triton X-100 в PBS в течение 15 мин при комнатной температуре. Впоследствии трижды промойте покровные стекла холодной ПБС. Блокируйте клетки 0,2% БСА в PBS в течение 1 ч при комнатной температуре.
  5. Флуоресцентно-меченные моноклональные антитела разводят (в разведении 1:300, см. таблицу материалов) в блокирующем растворе и инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре. Трижды промойте покровные стекла ледяным ПБС.
  6. Нанесите монтажный материал, содержащий DAPI, на предметное стекло, а затем запечатайте его покровным стеклом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Предметные стекла можно сразу же проанализировать с помощью флуоресцентного или конфокального микроскопа, или они могут храниться до 3 месяцев при -20°C.

6. Стратегия стробирования при микроглии спинного мозга

  1. Сгенерируйте точечную диаграмму и установите ворота для выделения жизнеспособных клеток на основе окрашивания жизнеспособности и пустого флуоресцентного канала16. Исключите нежизнеспособные клетки.
  2. Постройте еще один график с использованием параметров прямого и бокового рассеяния для устранения мусора16.
  3. Разработайте дополнительную точечную диаграмму и проанализируйте экспрессию CD11b и CD45 для дифференциации микроглии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

С использованием тканей спинного мозга мышей ферментативное пищеварение проводили с использованием смеси, сильно обогащенной коллагеназой и термолизином. Полученная переваренная ткань проходила через фильтр 40 мкм для удаления непереваренного материала. Собранные клетки обогащали с помощью градиента плотности по Перколлу, где 90% в нижней части и 45% в верхней. Клетки, обогащенные микроглией в пределах интерфейса, затем окрашивали антителами к CD45 и CD11b и подвергали проточному цитометрическому анализу (

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Было разработано множество протоколов для изучения микроглии из-за ее значимости в гомеостазе мозга. В этих методах микроглия обычно поступает из полушарий головного мозга эмбриональных или неонатальных крыс и мышей17. Ограниченное число исследований было посвящено очистке микроглии из спинного мозга взрослых мышей13,14. Эти методы включают ферментативное расщепление с использованием коллагеназы и/или папаина вместе с ДНКазой, часто в соче...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантами стипендии, предоставленной Национальным советом по науке и технологиям (CONACYT) (702361). Авторы отмечают докторантуру по биологическим химическим наукам Национальной школы биологических наук Национального политехнического института.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
15 мл пробиркидля сбора Corning, США430790
мл микропробиркиAxygen, СШАMCT-200-G
2.4G2 анти-FcRBioLegend, США101302
50 мл для сбора пробирокCorning, США430829
70% этанол
Антибиотик-антимикотик (пенициллин, стрептомицин, амфотерицин b)Gibco, США15240062
антитело CD11b eFluor 450 против мышейeBioscience, США48-0112
антитело CD45 PerCP против мышей   BioLegend, США103130
Сбалансированный раствор соли (PBS) без кальция и магнияCorning, США46-013-CM
Сетчатый фильтр для голубых клеток 40 μ mCorning, США352340
Costar 6-луночный прозрачный без обработки Corning, СШАCLS3736
Coverslips
Цифровой подогрев Встряхивание Drybath Thermo Scientific Digital HS Drybath, США88870001
Щипцы для препарирования для микрохирургииFT от DUMONT
DNaseRoche, США4536282001
Dulbecco´ s Модифицированный Eagle´ s Средне-высокий уровень глюкозы (DMEM) Merck, СШАD6429
Электробритва
FACS трубкаThermo, США 352058
Фетальная бычья сыворотка (FBS)PAN Biotech, AlemaniaP30-3306
Проточный цитометр Cytoflex Бекман Коултер
Хэнк s сбалансированный солевой раствор Merck, СШАH2387
L-глютаминCorning, США 
Liberase TM Roche, США5401119001
Камера Нойбауэра Счетные камерыКитай1103
Пентобарбитал
Percoll Merck, СШАцентрифугирование 17089101 градиентом плотности 
Раствор поли-L-лизина Merck, СШАP8920
Скальпель No 25 HERGOM, МексикаH23
Snaplock Микроцентрифужные пробирки 2 млAxygen, США10011-680
Стереоскопический микроскопVelab, МексикаHG927831
Прямые хирургические ножницы (10 см)HERGOM, Мексика
Прямые ножницы VannasHERGOM, Мексика
Triton X100Merck, СШАX100
Морилка трипановая синяя 0.4% Merck, США15250-061
Вихревой смесительDLAB, Китай8031102000
Zombie Aqua Fixable Viability KitBioLegend, США423102аминоактивное окрашивание флуоресцентным красителем 
2 15393631

Ссылки

  1. Schröder,, Moser,, Huggenberger, Neuroanatomy of the Mouse. , Springer, Switzerland. 59-78 (2020).
  2. Sengul, G., et al. Cytoarchitecture of the spinal cord of the postnatal (P4) mouse. Anat Rec. 295, 837-845 (2012).
  3. Bab, I., et al. Microtomographic atlas of the mouse skeleton. VIII, First ed, Springer. 205(2007).
  4. Nayak, D., et al. Microglia development and function. Annu Rev Immunol. 32, 367-402 (2014).
  5. Martinez, F. O., et al. Macrophage activation and polarization. Front Biosci. 13, 453-461 (2008).
  6. Masuda, T., et al. Microglia heterogeneity in the single-cell era. Cell Rep. 30 (5), 1271-1281 (2020).
  7. Prinz, M. Microglia biology: one century of evolving concepts. Cell. 179 (2), 292-311 (2019).
  8. de Haas, A. H., et al. Region-specific expression of immunoregulatory proteins on microglia in the healthy CNS. Glia. 56 (8), 888-894 (2008).
  9. Xuan, F. L., et al. Differences of microglia in the brain and the spinal cord. Front Cell Neurosci. 13, 504(2019).
  10. Paolicelli, R. Microglia states and nomenclature: A field at its crossroads. Neuron. 110 (21), 3458-3483 (2022).
  11. Li, Q., et al. Spinal IL-36γ/IL-36R participates in the maintenance of chronic inflammatory pain through astroglial JNK pathway. Glia. 67 (3), 438-451 (2019).
  12. Prinz, M., et al. Microglia and central nervous system-associated macrophages-from origin to disease modulation. Annu Rev Immunol. 39, 251-277 (2021).
  13. Yip, P. K., et al. Rapid isolation and culture of primary microglia from adult mouse spinal cord. J Neurosci Methods. 183 (2), 223-237 (2009).
  14. Akhmetzyanova, E. R., et al. Severity- and time-dependent activation of microglia in spinal cord injury. Int J Mo. Sci. 24 (9), 1-16 (2023).
  15. Mahadevan, V. Anatomy of the vertebral column. Surgery. 36 (7), 327-332 (2018).
  16. Krukowski, K., et al. Temporary microglia-depletion after cosmic radiation modifies phagocytic activity and prevents cognitive deficits. Sci Rep. 8 (1), 1-13 (2018).
  17. Cardona, A., et al. Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nat Protoc. 1, 1947-1951 (2006).
  18. Schmidt, V. M., et al. Comparison of the enzymatic efficiency of Liberase TM and tumor dissociation enzyme: effect on the viability of cells digested from fresh and cryopreserved human ovarian cortex. Reprod Biol Endocrinol. 16 (57), 1-14 (2018).
  19. Kusminski, C. M., et al. MitoNEET-parkin effects in pancreatic α- and β-cells, cellular survival, and intrainsular cross talk. Diabetes. 65 (6), 1534-1555 (2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Очистка микроглииградиент плотностиколлагеназное перевариваниепроточная цитометрияокрашивание на CD11bокрашивание на CD45гетерогенность микроглиидорзальная ламинэктомия
Быстрое и эффективное обогащение микроглии спинного мозга мышей
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.