Простая техника наложения манжеты при трансплантации левого легкого у мышей

Краткое содержание

В настоящем протоколе описана техника использования манжеты для модели трансплантации левого легкого у мыши. Этот метод разрабатывался в течение нескольких лет и хорошо зарекомендовал себя, эффективно служа в иммунологических исследованиях.

Аннотация

За последнее десятилетие наша лаборатория добилась значительного прогресса в разработке и совершенствовании моделей васкуляризированной трансплантации легких мышей с использованием эффективной и высоконадежной «манжетной техники» трансплантации. В данной статье описывается сложный и комплексный метод ортотопической трансплантации легких в васкуляризированной ортотопической модели легкого, представляющий собой наиболее физиологическую и клинически значимую модель трансплантации легких мышей на сегодняшний день. Процесс трансплантации состоит из двух отдельных этапов: забор донора и последующая имплантация реципиенту. Метод был успешно освоен, и после нескольких месяцев достаточного обучения опытный практикующий специалист может выполнить процедуру примерно за 90 минут от кожи к коже. Удивительно, но как только люди преодолевают начальную кривую обучения, выживаемость в периоперационном периоде приближается почти к 100%. Мышиная модель позволяет использовать несколько коммерчески доступных трансгенных и мутантных штаммов мышей, что позволяет изучать толерантность и отторжение. Кроме того, уникальные особенности этой модели делают ее ценным инструментом для изучения биологии опухолей и иммунологии.

Введение

В то время как заместительная терапия, такая как диализ и желудочковые вспомогательные устройства, существуют для пациентов с почечной и сердечной недостаточностью, трансплантация легких остается основным вариантом лечения для пациентов, страдающих терминальной стадией легочной болезни. Эта процедура служит единственным спасительным выбором для людей с диагнозом легочный фиброз¹. Кроме того, он используется для продления продолжительности жизни тех, кто сталкивается с терминальной стадией обструктивных заболеваний легких, таких как эмфизема, а также тех, кто страдает гнойными состояниями, такими как муковисцидоз¹.

В то время как краткосрочные показатели выживаемости улучшились благодаря техническим усовершенствованиям, усовершенствованию периоперационного ухода и достижениям в области иммуносупрессии, долгосрочные результаты после трансплантации легких заметно уступают таковым при других солидных органах. Общая пятилетняя выживаемость реципиентов легочного трансплантата составляет всего 50%, что намного ниже, чем у тех, кто получает аллотрансплантаты сердца, почек или печени¹. Наша команда и другие специалисты подозревают, что причиной такого расхождения является отсутствие клинически значимых биологических моделей для полного понимания путей, ведущих к отторжению и/или толерантности к аллотрансплантату легких, поскольку экспериментальные манипуляции с физиологически значимыми мышиными моделями внесли значительный вклад в долгосрочную выживаемость других твердых или клеточных аллотрансплантатов^.

До разработки мышиной модели ортотопической трансплантации легких исследователи полагались на более крупные животные модели для своих исследований. Тем не менее, эти более крупные модели имели ограничения, в том числе отсутствие трансгенных мутантов, необходимых для изучения механистических^{вопросов.} Кроме того, исследования на крысах столкнулись с аналогичными ограничениями⁴, а неваскуляризированные гетеротопические модели трансплантации трахеи у мышей также были ограничены их полезностью⁵. Исследования показали важность использования васкуляризированных трансплантатов вместо неваскуляризированных в различных системах органов. Например, неваскуляризированные трансплантаты неонатальной сердечной ткани, вставленные в ушную раковину мышей-реципиентов, не имеют прямого взаимодействия с эндотелием сосудов и кровотоком реципиента. Поэтому их актуальность ограничена по сравнению с васкуляризированными сердечными трансплантатами человека⁶. Аналогичным образом, модель гетеротопной трансплантации трахеи, в которой отсутствует васкуляризация и аэрация, значительно отличается от трансплантации легких человека, особенно в наблюдаемых изменениях дыхательных путей в мелких дыхательных путях после трансплантации. Более того, быстрое начало фиброзной окклюзии в гетеротопических аллотрансплантатах трахеи не отражает наблюдений в легких человека или в васкуляризированных трансплантатах легких у более крупных животных или^крыс7.

В нашей исследовательской лаборатории создание ортотопической модели трансплантации легких у мышей было вдохновлено ортотопической моделью трансплантации одного легкого, установленной на крысах ^8,9. В отличие от людей, мыши и крысы имеют только одну долю в левом легком, составляющую всего двадцать пять процентов от общей массы легких. Эта функция позволяет успешно выполнять трансплантацию левого легкого на мышиных моделях без необходимости поддержки кровообращения^10,11. Со временем мы внесли технические изменения в модель, и в этом контексте были выяснены ключевые шаги, которые повышают простоту выполнения процедуры.

Помимо своего значения в исследованиях в области трансплантационной иммунобиологии, ортотопическая модель трансплантации легких у мышей предлагает надежный инструмент для изучения роли легочных негемопоэтических стромальных клеток в различных патологических процессах. Это происходит потому, что мутантный сингенный трансплантат одного легкого приводит к почти полной замене гемопоэтических клеток на клетки, полученные от реципиента, в то время как негемопоэтические стромальные клетки продолжают происходить от донора. Следовательно, «химерный орган» может быть создан без облучения хозяина или специфической для легких экспрессии трансгена¹². Более того, нативное легкое противоположной стороны может функционировать как внутренний контроль в пределах одного и того же животного, не вызывая широкомасштабных изменений в иммунной системе хозяина. Эта модель имеет большие перспективы для продвижения исследований в области трансплантации легких и других путей заболевания, связанных с тромбальными клетками легочной артерии.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными, проводились в соответствии с Комитетом по уходу за животными и их использованию в Университете штата Мэриленд в Балтиморе и получили от него одобрение. Рекомендуется использовать самцов мышей BALB/c в возрасте 8-12 недель (20-25 г) в качестве донора и мышей C57BL/6 в качестве реципиента. Животные были получены из коммерческого источника (см. Таблицу материалов).

1. Подготовка бронхиальных и сосудистых манжет

Хронометраж: 10 мин (для трех манжет)

1. Подготовьте бронхиальную манжету с помощью ангиокатетера 18 G и легочную венозную манжету с помощью ангиокатетера 20 G длиной 1 мм (без учета удлинительной ручки) (см. Таблицу материалов). Используйте скальпель #11 и металлическую иглу ангиокатетера, служащую режущей поверхностью (Рисунок 1).
2. Препарируйте манжету легочной артерии с помощью ангиокатетера 24 G длиной 0,6 мм (см. Таблицу материалов) аналогичным образом.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Общие фундаментальные принципы манжетной методики создания микрососудистых анастомозов заключаются в следующем: при создании микрососудистых анастомозов для трансплантации легких мышей используются специфические манжетные техники в связи с малыми размерами сосудов. В отличие от более крупных сосудов, которые могут быть сшиты напрямую, микроскопические бронхиальные и сосудистые соединения требуют отдельного метода. Основополагающий принцип заключается в прохождении донорского сосуда через жесткую круглую манжету, которая немного больше самого сосуда.

2. Процедура донорства

Хронометраж: 10-15 мин

1. Внутрибрюшинное введение 50 мг/кг кетамина и 10 мг/кг ксилазина (см. Таблицу материалов) для обезболивания донорской мыши (в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами).
2. После обеспечения адекватной анестезии путем защемления пальцев ног побрейте мышь-донора и поместите ее в лежачее положение под операционный микроскоп с 10-кратным увеличением.
3. Введите 50 мкл гепарина (см. Таблицу материалов) через вену полового члена (рис. 2А).
4. Разрежьте трахею и вставьте ангиокатетер 20 G, а затем обвите его шелковым швом 6-0 (см. Таблицу материалов). Подсоедините катетер к аппарату искусственной вентиляции легких (рисунок 2B).
5. Выполните разрез по средней линии живота (лапаротомию) и сделайте круговой разрез в области диафрагмы (рисунок 2C).
6. Проведите стернотомию по средней линии¹² и расположите два щипца по обе стороны от грудины для гемостаза и ретракции от краев кости (рисунок 2D).
7. Удалите тимус и иссеките придатки правого и левого предсердий, чтобы облегчить выход любых дренажей из легких.
8. Введите 3 мл холодного раствора для консервации 4 °C (см. Таблицу материалов) непосредственно в правый желудочек или корень легочной артерии с помощью иглы 27 г на шприце объемом 3 мл, чтобы смыть всю кровь из легких.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Внутрижелудочковая инъекция или инъекция легочной артерии может привести к повреждению донорского легкого. Крайне важно поддерживать достаточную вентиляцию во время промывки, чтобы обеспечить равномерное распределение консервационного раствора.
9. Зажмите трахею проксимально, а затем разделите трахею дистально. Далее рассекаем трахею каудально и^{сзади 12}.
10. Снимите блок искусственного кровообращения и переложите его в маленькую чашку Петри, стерильную и застеленную марлей, смоченной раствором для холодной консервации. Затем поместите эту чашку Петри в большую чашку, наполненную льдом (Рисунок 2E).
11. Чтобы обнажить левый волосок, наложите небольшую марлю на ткани левого и правого легких для ретракции (рисунок 2F).
12. Аккуратно отделите прикорневые структуры друг от друга с помощью изогнутых щипцов с точностью. Рассеките левую легочную артерию (ЛК) от бронха (Рисунок 2G). Затем рассеките легочную вену (ЛВ), расположенную в самой каудальной части ворот от бронха аналогичным образом (рис. 2H).
    1. Разрежьте PA и PV на максимально возможной длине для правильного застегивания манжет. Старайтесь избегать иссечения чрезмерного количества жира или лимфоидной ткани, так как это может затруднить выполнение операции с манжетами.
13. Расположите ФВ-манжету примерно на 2 мм над легочной артерией с помощью стабилизирующего зажима, а затем вставьте ФВ внутрь манжеты. Сложите PV над манжетой, тем самым обнажив эндотелиальную поверхность (рисунок 2I). Закрепите его вокруг манжеты швом 10-0 (2 узла) (Рисунок 2J).
14. Отделите ПА от ворот и положите манжету на ПА таким же образом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Воздержитесь от разрезания бронхов на этом этапе. Вместо этого обязательно наденьте манжету на бронх непосредственно перед имплантацией, чтобы предотвратить попадание консервирующего раствора в дыхательные пути во время хранения. Погрузите легочный блок в консервационный раствор при температуре 4 °C.

3. Порядок действий получателя

Хронометраж: 50-60 мин

1. Обезболите мышь-реципиента смесью кетамина (50 мг/кг) и ксилазина (10 мг/кг) (внутрибрюшинно) (в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами). Далее побрейте левую грудную клетку и интубируйте¹².
2. Проводите интубацию под прямым наблюдением, осторожно вытягивая язык изо рта и тем самым обнажая голосовые связки. Выполняйте это под препарирующим эндоскопом с 10-кратным увеличением. Интубируйте животное, вставив ангиокатетер размером 20 г x 1,25 дюйма непосредственно между голосовыми связками.
3. Поместите животное в правое боковое положение пролежня и очистите грудную стенку 70% этанолом. (Рисунок 3А).
4. С помощью ножниц сделайте надрез на коже и полностью завершите левую торакотомию с помощью электрокаутера (см. Таблицу материалов).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы свести к минимуму потерю крови от грудной стенки во время этого этапа, используйте электрокаутеризацию для всех частей этого диссекции. Кожу необходимо высушить после протирания этанолом, так как электрокоагуляция несет риск получения ожогов при сочетании с этанолом.
5. Войдите в грудную клетку с^3-го или^4-го межреберья и поставьте два ретрактора грудной клетки (см. Таблицу материалов) (рисунок 3Б).
6. После торакотомии переведите мышь в положение лежа на спине. Слегка согните корпус мыши-получателя, чтобы приблизить левую грудь к оператору, улучшив обзор ворот для улучшения видимости и доступности.
7. Расположите щипцы для артерии под прямым углом (6 дюймов) на левом легком получателя и аккуратно втяните легкое. Это позволяет обнажить переднюю часть ворот, облегчая дальнейший хирургический доступ и манипуляции (Рисунок 3C).
8. Отделите легочную артерию (ПА) от бронха с помощью изогнутых щипцов для рассечения, следя за тем, чтобы не порвать сосуд. Оптимальным местом рассечения является средняя часть, достаточно расстояния в 2 мм (рисунок 3D).
9. Аналогичным образом отделите ПВ от бронхов (рис. 3E).
10. Чтобы затруднить воздушный поток и кровоток в левом легком реципиента, поместите микрозажим для аневризмы (см. Таблицу материалов) у основания ворот (рис. 3F).
11. Сделайте небольшой V-образный разрез в легочной артерии (ПА) и легочной вене (ВП) реципиента с помощью микроножниц. Аккуратно расширьте бронхиальные и сосудистые отверстия с помощью прямых или изогнутых щипцов, чтобы создать подходящее отверстие для установки донорских манжет.
12. Аккуратно промойте разведенным гепарином (гепарин: физраствор = 1:9), чтобы удалить кровь.
13. Поместите нейлон 10-0 вокруг PA и оставьте его свободным (для фиксации манжет на более позднем этапе).
14. Затем разрежьте донорский бронх и завяжите его манжетой аналогично PA и PV. Откажитесь от донорской правой легочно-сердечной блокады.
15. Удерживая левое легкое реципиента, расположите донорское легкое поверх ретракционных щипцов и накройте его небольшой влажной марлей.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Левое легкое реципиента должно оставаться в положении, позволяющем оказывать напряжение на плечо реципиента, тем самым облегчая процесс анастомоза.
16. Спереди обнажите прикорневые структуры манжеты и начните анастомоз, поместив донора в легочную артерию (ПА) реципиента, при этом нижним образом удерживая манжету. На этом этапе ПА донора будет испытывать некоторое растяжение (Рисунок 3G).
17. После того, как донорская легочная артерия (ПА) расположена в ПА реципиента, закрепите структуры, поместив микрозажим поперек удлинителя манжеты. Затем закрепите ранее установленный нейлоновый шов 10-0 вокруг легочной артерии (ПА) реципиента и манжету двумя узлами (см. рисунок 3H). Наконец, отделите микрозажим от удлинительной манжеты.
18. Аналогичным образом вставьте ЧВ донора в ЛВ реципиента (Рисунок 3I).
19. Вставьте донорский бронх в бронх реципиента, следя за тем, чтобы донорский бронх находился под некоторым растяжением (рисунок 3J). Отпустите микрозажим на воротах, чтобы восстановить перфузию и вентиляцию (Рисунок 3K).
20. В грудную полость введите донорское легкое и иссеките левое легкое реципиента, разрезав оставшиеся части легочной артерии реципиента (PA), легочной вены (PV) и бронха спереди (рис. 3L). Утилизируйте левое легкое реципиента.
21. Закройте грудную клетку с помощью шва 6-0 PDS (см. Таблицу материалов), тем самым закрепив одно ребро ниже и одно ребро выше разреза грудной клетки. Непосредственно перед тем, как закрыть грудную клетку, сделайте одному большому вдоху, чтобы выпустить оставшийся воздух из грудной клетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В отличие от модели крысы, мышам нет необходимости вставлять плевральные дренажные трубки.
22. Сшить кожу и подлежащую подкожную клетчатку с помощью непрерывного подкожного шелкового шва 6-0 (см. Таблицу материалов).

4. Восстановление животных

Хронометраж: 12 ч

1. Дайте животному восстановиться с неограниченным доступом к пище и воде в отделении интенсивной терапии для мелких животных (портативном отделении интенсивной терапии для животных, см. Таблицу материалов) в течение ночи.
2. Бупренорфин вводят подрано (0,5-1 мг/кг) каждые 12 ч для минимизации послеоперационной боли.

Результаты

Основываясь на опыте работы с этой моделью за последние 10 лет, особям с базовыми навыками микрохирургии обычно требуется кривая обучения примерно в 50 животных. После того, как уровень владения языком достигнут, процедуры для доноров обычно занимают 15-30 минут, в то время как процедуры для реципиентов занимают около 60 минут. После начальной кривой обучения периоперационная смертность, как правило, очень низкая.

На рисунках 4A,B морфология легких через семь дней после приживления левых легких донора Balb/cJ реципиентам C57/B6J показывает, что у мышей, получавших костимулирующую блокаду, наблюдалась сохраненная, нормальная морфология. Напротив, у мышей без иммуносупрессии наблюдались признаки отторжения.

На рисунках 4C,D окрашивание H & E мышей, получавших костимулирующую блокаду, показало минимальную иммунореактивность, что свидетельствует об иммунной толерантности. Напротив, у мышей без иммуносупрессии наблюдалась выраженная лимфоцитарная инфильтрация, свидетельствующая о реакции отторжения.

Рисунок 1: Создание манжеты. Используя лезвие #11, (A) сосудистые и бронхиальные манжеты изготовлены с удлинительной ручкой манжеты для облегчения размещения. (B) Катетеры 18 G/20 G/24 G использовались для бронхов/легочной вены/легочной артерии (слева направо). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Донорская операция. Донорская процедура заключается в инъекции гепарина через вену полового члена (А), интубации (В), рассечении диафрагмы (С) и стернотомии по средней линии (D). Иссеченный блок легкого (E) поддерживали во влажном состоянии, закрывая гуазовые прокладки (F). Ворота рассекаются, начиная с донорской плюмонарной артерии (G), легочной вены (H). Сосуд захватывали через просвет манжеты, а затем заворачивали поверх манжеты, обнажая эндотелиальную/эпителиальную поверхность (I). Далее он был закреплен нейлоновым швом 10-0 вокруг манжеты (2 узла) (J). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Операция с получателем. Процедура реципиента продолжается эндотрахеальной интубацией, правым боковым пролежнем (А) и левой торакотомией (В). Левое легкое реципиента освобождается от прикреплений в воротнике, передняя проекция (С) и реципиент рассекается легочной артерии (D), легочная вена (Е) и бронх. Проксимальный контроль ворот реципиента достигается с помощью клипсы для аневризмы (F). Донорская легочная артерия с манжетой вставляется в легочную артерию реципиента с помощью V-образной артериотомии 1/3 (G), а ручка манжеты контролируется вторым зажимом для аневризмы для поддержания стабильности манжеты, а затем фиксируется нейлоновой завязкой 10-0 (2 узла) (H). Был удален^2-й клипс, и та же процедура была применена для легочной вены (I) и бронха (J). ^1-й зажим был удален, чтобы дать легкому возможность реперфузии (К). легкое надувается, а затем помещается обратно в грудную клетку (L). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4: Морфология и гистология трансплантированного легкого. Через семь дней после приживления донорских левых легких Balb/cJ реципиентам C57/B6J у мышей, получавших костимулирующую блокаду, наблюдалась сохраненная нормальная морфология (A). Напротив, у мышей, получавших лечение без иммуносупрессии, наблюдались признаки отторжения (В). Окрашивание H & E мышей, получавших костимулирующую блокаду, показало минимальную иммунореактивность, что свидетельствует об иммунной толерантности (C). У мышей, получавших лечение без иммуносупрессии, наблюдалась выраженная лимфоцитарная инфильтрация, что свидетельствует об ответе на отторжение (D). Масштабные линейки: 100 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Обсуждение

Техника «манжеты» для трансплантации левого легкого у мышей представляет собой значительный шаг вперед в исследованиях в области трансплантации^10,11. Важнейшие шаги включают точное и тщательное рассечение прикорневой структуры и безопасные анастомозы. Модификации могут быть внесены в соответствии с экспериментальными потребностями, но для этого потребуется пройти кривую обучения. Наша группа изменила положение мыши-реципиента с заднего на переднее, получив лучший обзор ворот за счет изгиба мыши-реципиента, что сокращает кривую обучения.

Ограничения включают проблемы с мышами за пределами указанного диапазона веса и потребность в квалифицированных хирургах с предыдущим опытом в микрохирургии. Чтобы снизить риск ателектаза трансплантата, настоятельно рекомендуется применять положительное давление в конце выдоха (PEEP) после приживления и обеспечить соответствующее введение анальгетиков. Для профилактики венозных разрывов рекомендуется использовать манжету меньшего размера (22 г). Кроме того, для предотвращения перекрута артерии рекомендуется свести к минимуму движение трансплантата после подготовки и проявлять максимальную осторожность при корректировке ориентации донорского легкого во время процедуры анастомоза.

Несмотря на ограничения, васкуляризированный подход метода превосходит неваскуляризированные модели и обеспечивает лучшую физиологическую значимость. Она также преодолевает недостатки гетеротопических моделей трахеи⁷, что делает ее идеальной моделью для изучения трансплантационной иммунобиологии и патологических процессов. Преобразующая особенность модели позволяет постепенно заменять донорские гемопоэтические клетки клетками-хозяевами, облегчая исследования болезней и^{злокачественных} новообразований. Кроме того, он дает представление о вкладе легочных стромальных клеток, что важно для понимания патофизиологии легких и таргетной терапии.

В целом, метод манжеты обещает продвинуть исследования в области трансплантационной биологии, заболеваний легких и иммунологии с потенциальными применениями в различных областях. Исследователи должны помнить о его кривой обучения и способности адаптироваться к конкретным исследовательским потребностям. Мы стремимся повысить эффективность и успех процедуры путем внесения практических изменений, таких как изменение положения животного после торакотомии для лучшего хирургического обзора. Хотя основная техника остается прежней, эти усовершенствования могут значительно облегчить процесс, особенно для своевременного анастомоза легких в экспериментальных условиях. В этой статье содержатся ценные советы по улучшению технических характеристик в полевых условиях.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
10-0 Нейлоновый шовный материал	Surgical Specialties Corporation, Рединг PA	AK-0106
2 Пинцы Dumont #5	Fine Science Tools Inc., Фостер-Сити, Калифорния	11251-20
2 Зажим Холстед-Москито изогнутый наконечник	Fine Science Tools Inc., Фостер-Сити, Калифорния	91309-12
6-0 плетеный шелковый шовный материал	Henry Schein Inc., Мелвилл, Нью-Йорк,	100-5597
6-0 Полидиоксанон PDS II шовный материал и	Ethicon Inc., Сомервилль, Нью-Джерси.	Z117H
70% этанол	Pharmco Products Inc., Брукфилд, Коннектикут,	111000140
щипцы Адсона	Fine Science Tools Inc., Фостер-Сити, Калифорния	91127-12
Мышей Balb/c	Jackson Laboratories, Бар-Харбор, Мэн, США	000651	8– 12 недель; Мужской
Биполярный коагулятор	Valleylab Inc., Боулдер, Колорадо	SurgII-20, E6008/E6008B
C57BL/6 мышей	Jackson Laboratories, Бар-Харбор, Мэн, США	000664	8– 12 недель; Мужской
Прозрачный хлоргексидин	Hibiclens, Mö lnlycke Health Care US, LLC, Норкросс, Джорджия	57591
Электрокаутерия	Bovie
Fine vannas стиль пружинные ножницы	Fine Science Tools Inc., Фостер-Сити, Калифорния	15000-03
Иглодержатель Хэлси	Fine Science Tools Inc., Фостер-Сити, Калифорния	91201-13
Гарвардский аппарат Аппарат искусственной вентиляции легких для мыши VentElite	Гарвардский аппарат, Холлистон, Массачусетс	55-7040	настроек 3L O2/minute, частота дыхания 130 уд/мин, 0,4 куб. см дыхательного объема
раствор гепарина	Abraxis Pharmaceutical Products, Шаумбург, Иллинойс	504031	100 Ед/мл
Инъекционный нормальный физиологический раствор	Hospira Inc., Лейк Форест, Иллинойс;	NDC 0409-4888-20
Кетамин	VetOne, Бойсе, ID	501072	50 мг/кг
Konig Mixter Микро Педиатрические щипцы Прямоугольные челюсти	Medline, Нортфилд, Иллинойс,	MDS1247714	Экстра Мелкий, Общая Длина 5 1/2" (14 см)
Высокотемпературное прижигание Medline, с тонким наконечником	Leica Microsystems, Inc., Аллендейл, Нью-Джерси	10 450 290
Микроскоп Leica M80 F12 Напольная подставка	Fine Science Tools Inc., Фостер-Сити, Калифорния	15396-00
Мория экстратонкие пружинные ножницы	Parkland Scientific, Корал Спрингс, Флорида	V3000i
Огайо Изофлурановый вапорайзер	Vitrolife Inc., Энглвуд, Колорадо,	19001
Перфадекс  раствор глюкозы с низким содержанием декстрана	калия Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ	353025	раствор для консервации электролитов
полистирол петридиш	Fine Science Tools Inc., Фостер-Сити, Калифорния	00632-11 и 00649-11	150 × 25 мм и 60 × & 25 mm
S& T SuperGrip Щипцы с прямым и угловым наконечником	Fine Science Tools Inc., Фостер-Сити, Калифорния	18200-20
Система втягивания мелких животных	Puritan Medical Company LLC, Гилфорд, Мэн	823-WC	конические мини-аппликаторы с хлопковым наконечником 3 дюйма
стерильные ватные палочки	Terumo Medical Corporation, Элктон, Мэриленд
Катетер для внутривенного вливания Surflo etfe, желтый, 24 G x 0,75 дюйма	Terumo Medical Corporation, Элктон, штат Мэриленд	SROX1851Z
катетер для внутривенного вливания Surflo etfe; Зеленый, 18 G x 2"	Terumo Medical Corporation, Элктон, Мэриленд	SROX2032Z
Surflo etfe IV катетер; Розовый, 20 г x 1,25 дюйма Thermocare	, Inc., Инклайн Виллидж, Невада;
Система интенсивной терапии для мелких животных ThermoCare,	от А до Я Vet Supply, Дрезден, Теннесси	008679	10 мг/кг
ксилазина	Эскулап, Инк., Сентер-Вэлли, Пенсильвания,	FT480T
Yasargil Clip Applier	Aesculap, Inc., Сентер-Вэлли, Пенсильвания,	FT264T
Yasargil Зажимы для временной аневризмы	Medline, Нортфилд, Иллинойс;