Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Качественный и количественный анализ продукции сидерофоров синегнойной палочки

7.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/65980

⸱

15 марта 2024 г.

 ,  , 
1Department of Microbiology and Biotechnology Centre, Faculty of Science, The Maharaja Sayajirao University of Baroda

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол обеспечивает как качественный, так и количественный анализ общего количества сидерофоров, пиовердина и пиохелина синегнойной палочки.

Аннотация

Синегнойная палочка (P. aeruginosa) известна тем, что вырабатывает разнообразный спектр факторов вирулентности для установления инфекций в организме хозяина. Одним из таких механизмов является поглощение железа путем производства сидерофоров. P. aeruginosa продуцирует два различных сидерофора: пиохелин, который имеет более низкое железо-хелатное сродство, и пиовердин, который имеет более высокое железо-хелатное сродство. Этот отчет демонстрирует, что пиовердин может быть непосредственно количественно определен из бактериальных надосадочных растворов, в то время как пиохелин должен быть извлечен из надосадочной жидкости перед количественным определением.

Основным методом качественного анализа производства сидерофоров является анализ агаровых пластин на основе хром-азурола сульфоната (CAS). В этом анализе высвобождение красителя CAS из комплекса Fe3+-Dye приводит к изменению цвета с синего на оранжевый, что указывает на образование сидерофора. Для количественного определения общего количества сидерофоров бактериальные надосадочные жидкости смешивали в равных пропорциях с красителем CAS в микротитровой пластине с последующим спектрофотометрическим анализом при длине волны 630 нм. Пиовердин определяли непосредственно из бактериальной надосадочной жидкости путем смешивания его в равных пропорциях с 50 мМ Tris-HCl с последующим спектрофотометрическим анализом. Пик на длине волны 380 нм подтвердил наличие пиовердина. Что касается Пиохелина, то прямое количественное определение из бактериальной надосадочной жидкости было невозможно, поэтому его пришлось сначала экстрагировать. Последующий спектрофотометрический анализ выявил присутствие пиохелина с пиком на 313 нм.

Введение

Организмы нуждаются в железе для выполнения различных жизненно важных функций, таких как перенос электронов ирепликация ДНК. Известно, что Pseudomonas aeruginosa, грамотрицательный условно-патогенный патоген, обладает различными факторами вирулентности для установления инфекции в организме хозяина, одним из механизмов которых является образование сидерофора2. В условиях истощения железа P. aeruginosa высвобождает специализированные молекулы, называемые сидерофорами, которые гасят железо из окружающей среды. Сидерофоры хелатируют железо внеклеточно, и образующийся железо-сидерофорный комплекс активно транспортируется обратно в клетку3.

Известно, что P. aeruginosa продуцирует два сидерофора: пиовердин и пиохелин. Известно, что пиовердин обладает более высоким хелатным сродством железа (1:1), тогда как пиохелин, как известно, имеет меньшее хелатное сродство железа (2:1)4. Пиохелина также называют вторичным сидерофором, потому что он имеет более низкое хелатное сродство железа5. У P. aeruginosa6 производство и регулирование сидерофоров активно контролируется системами Quorum Sensing (QS).

Помимо гашения железа, сидерофоры также участвуют в регуляции факторов вирулентности и играют активную роль в образовании биопленки7. Сидерофоры играют дополнительную важную роль, включая участие в клеточной сигнализации, защите от окислительного стресса и содействии взаимодействию между микробными сообществами8. Сидерофоры обычно классифицируются в зависимости от конкретных функциональных групп, через которые они хелатируют железо. Тремя основными бидентатными лигандами в этой классификации являются катехолат, гидроксамат и α-гидроксикарбоксилат3. Пиовердины являются отличительными признаками флуоресцентных видов Pseudomonas, таких как P. aeruginosa и P. fluorescens5. Они состоят из смешанного зеленого флуоресцентного хромофора, соединенного с олигопептидом, содержащим 6-12 аминокислот. В их синтезе участвуют несколько нерибосомных пептидных синтетаз (NRP)9. Четыре гена, участвующие в производстве и регуляции пиовердина, — это pvdL, pvdI, pvdJ и pvdD10. Пиовердин также отвечает за инфекцию и вирулентность у млекопитающих11. Отмечается, что P. aeruginosa продуцирует пиохелин в условиях умеренного ограничения железа, в то время как пиовердин вырабатывается в тяжелых железолимитирующих средах12. Два оперона, участвующих в выработке пиохелина, — это pchDCBA и pchEFGHI13. Отмечено, что в присутствии пиоцианина пиохелин (катехолаты) индуцирует окислительное повреждение и воспаление и генерирует гидроксильные радикалы, которые вредны для тканей хозяина11.

Анализ на сульфонат азурола хрома (CAS) широко применяется благодаря его полноте, высокой чувствительности и большему удобству по сравнению с микробиологическими анализами, которые, хотя и чувствительны, могут быть чрезмерно специфичными14. Анализ CAS может проводиться на поверхности агара или в растворе. Он основан на изменении цвета, которое происходит, когда ион трехвалентного железа переходит от своего интенсивного синего комплекса к оранжевому. Колориметрический анализ CAS количественно определяет истощение железа из тройного комплекса Fe-CAS-поверхностно-активного вещества. Этот конкретный комплекс, состоящий из металла, органического красителя и поверхностно-активного вещества, имеет синий цвет и демонстрирует пик поглощения на длине волны 630 нм.

В настоящем докладе представлен метод качественного детектирования продукции сидерофоров, при котором можно обнаружить образование сидерофоров на агаровой пластине. Также предложен метод количественной оценки суммарной продукции сидерофоров в микротитровой пластине, а также детекции и количественного анализа двух сидерофоров, пиовердина и пиохелина, из P. aeruginosa.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все бактериальные изоляты P. aeruginosa были получены из медицинских микробиологических лабораторий в Вадодаре и Джайпуре, Индия. Все отобранные клинические изоляты обрабатывались в шкафу биобезопасности (BSL2), и во время экспериментов применялась максимальная осторожность при обращении с бактериальными изолятами. Подробная информация обо всех реагентах/растворах приведена в таблице материалов.

1. Приготовление красителя и агаровой среды на основе сульфоната хрома (CAS)

  1. Приготовьте краситель CAS (100 мл) со следующим составом:
    1. Растворите 60 мг CAS в 50 мл дистиллированной воды (раствор 1).
    2. Растворить 2,7 мг FeCl3·6H2Oв 10 мл 10 мМ HCl (раствор 2).
    3. Растворите 73 мг бромида цетримония (HDTMA) в 40 мл дистиллированной воды (раствор 3).
    4. Тщательно перемешайте Раствор 1, Раствор 2 и Раствор 3. Хранят его в стеклянной бутылке.
  2. Приготовьте агар CAS, выполнив следующие действия:
    1. Добавьте 100 мл раствора соли MM9 в 750 мл дистиллированной воды.
    2. Растворить 32,24 г пиперазина-N,N'-бис(2-этансульфоновой кислоты) (PIPES) свободной кислоты.
    3. Добавить 15 г агар-агара. Отпаркуйте в автоклав и дайте ему остыть.
    4. Добавьте в смесь 30 мл стерильного раствора касаминокислоты и 10 мл стерильного 20% раствора глюкозы.
    5. Добавьте 100 мл красителя CAS, перемешайте и залейте в асептических условиях.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовление среды MM9, раствора касаминокислоты и 8-гидроксихинолина приведено в Дополнительном файле 1. Буфер PIPES чувствителен к pH. Он не растворится до тех пор, пока не будет достигнут рН 5,6. Убедитесь, что pH постоянно контролируется, потому что, когда PIPES начнет растворяться в воде, это еще больше снизит pH. Экстракт Казаминокислоты с таким же объемом 3%-го 8-гидроксихинолина растворяют в хлороформе. Оставьте несмешивающийся раствор при температуре 4 °C примерно на 20 минут и осторожно соберите верхнюю фазу раствора, не нарушая нижнюю фазу.

2. Качественный анализ производства сидерофоров

  1. Установите наружный диаметр600 нм равным 0,2 для 24 ч выращенных культур P. aeruginosa.
  2. Используя стерильную проволочную петлю, нанесите бактериальную культуру на агаровую пластину CAS.
  3. Инкубируют при 30 °C в течение 24 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для разбавления бактериальной культуры можно использовать пептонную водную среду или 0,8% физиологический раствор. Если в течение 24 ч рост бактерий не наблюдается, инкубируют планшеты CAS в течение 48–72 ч.

3. Количественная оценка общего количества сидерофоров

  1. Повторно высейте 24-часовые культуры P. aeruginosa в пептонные водные среды после регулировки наружного диаметра600 нм до 0,25 и инкубируйте при 30 °C в течение 48 ч.
  2. Через 48 ч центрифугируют бактериальную культуру при 4650 х г в течение 10 мин при комнатной температуре.
  3. После центрифугирования добавляют 100 мкл внеклеточной надосадочной жидкости в 96-луночный микротитровый планшет и добавляют к нему 100 мкл красителя CAS.
  4. Накройте тарелку алюминиевой фольгой и выдержите при комнатной температуре 20 мин.
  5. После инкубации снимают спектрофотометрические показания на длине волны 630 нм.
  6. Рассчитайте полученные результаты для количественной оценки общего количества сидерофоров в процентах сидерофорных единиц (PSU).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Блок питания можно рассчитать как: [(Ar - As)/Ar] x 100
    где, Ar = поглощение эталона при 630 нм, As = поглощение бесклеточной надосадочной жидкости образца. Для справки, краситель CAS следует добавлять в неинокулированную пептную водную среду. Наполните всю стеклянную посуду, такую как пробирки, колбы и т. д., 6 M HCl в течение 2 ч и дважды промойте ее дистиллированной водой, чтобы удалить следы железа.

4. Количественная оценка пиовердина

  1. Повторно инокулируют выращенные в течение 24 ч культуры P. aeruginosa в пептонные водные среды после регулировки наружного диаметра600 нм до 0,25 и инкубируют при 30 °C в течение 48 ч.
  2. Через 48 ч измерьте наружный диаметр600 нм роста бактерий, прежде чем продолжить.
  3. Центрифугируют бактериальную культуру при 4650 х г в течение 10 мин при комнатной температуре.
  4. После центрифугирования добавляют 100 мкл бесклеточной надосадочной жидкости в 96-луночный микротитровый планшет и добавляют к нему 100 мкл 50 мМ Tris-HCl (pH 8,0).
  5. Снятие спектрофотометрических показаний при наружном диаметре405 нм.

5. Экстракция пиохелина и спектрофотометрия

  1. Повторно высевать выращенные в течение 24 ч культуры P. aeruginosa в среду King's B (Дополнительный файл 1) после корректировки наружного диаметра600 нм до 0,25 и инкубировать при 30 °C в течение 24 ч.
  2. Через 24 ч принимают 100 мл культуры и центрифугируют при 4650 х г в течение 10 мин при комнатной температуре.
  3. После центрифугирования добавляют в надосадочную жидкость 5 мл 1 М лимонной кислоты. Дважды экстрагируйте 50 мл этилацетата.
  4. Органическую фазу с сульфатом магния процеживают через шприцевой фильтр. Отфильтрованную органическую фазу хранить при температуре -20 °C.
  5. Снимают спектрофотометрические показания на длине волны 320 нм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку пиохелин является очень нестабильным соединением при комнатной температуре, выполняйте процесс экстракции на льду. Используйте стерильный шприц объемом 50 мл для разделения фильтра. Положите вату на кончик шприца и добавьте на нее 1 г сульфата магния. Закрепите стерильный шприцевой фильтр на кончике шприца и соберите фильтрат в стерильную пробирку.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Перед количественным определением сидерофоров из клинических изолятов был проведен качественный скрининг на продукцию сидерофоров, чтобы обеспечить получение сидерофоров. Качественное обнаружение сидерофоров из клинических изолятов наблюдалось по полосатым бактериям на агаровых пластинах CAS. Для исследования были выбраны три клинических изолята, а именно MR1, TL7, J3, а также PAO1 (референтный штамм). Все три клинических изолята и PAO1 показали положительные результаты в отношении продук...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Этот протокол позволяет исследователям количественно определить общее количество сидерофоров и двух различных сидерофоров P. aeruginosa, а именно пиовердина и пиохелина, из бактериальной внеклеточной надосадочной жидкости. В анализе агаровых пластин CAS краситель CAS и ионы Fe3+ образуют комплекс. Когда бактерии производят сидерофоры, они гасят ионы Fe3+ из комплекса CAS-Fe3+, что приводит к изменению цвета вокруг роста бактерий. Это изменение приводит к появлению четкого оранжев...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Авторы выражают признательность за финансирование со стороны DBT - Biotechnology Teaching Program, DBT - BUILDER Program и FIST. MR благодарит за стипендию, полученную от SHODH. Компания HP выражает благодарность за стипендию, полученную от CSIR.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Агар Агар, тип IHIMEDIAGRM666
8-гидроксихинолинLoba Chemie4151
Касаминовая кислотаSRL Химикаты68806
Цетилтриметиламмония бромид (CTAB)HIMEDIARM4867-100G
ХлороформMerck1070242521
хрома азуролсульфонатHIMEDIARM336-10G
Лимонная кислотаMerck 100241
Моногидрат декстрозыMerck108342
ДихлорметанMerck107020
Гексагидрат хлорида железаHIMEDIAGRM6353
стеклянные колбыBorosil5100021
стеклянные пробиркиBorosil9820U05
Соляная кислотаSDFCL20125
Королевская среда B БазаHIMEDIAM1544-500G
M9 Минимальная средняя сольHIMEDIAG013-500G
Сульфат магния Qualigens10034
MultiskanGO УФ-спектрофотометрThermo Scientific51119200
пептон типа I, бактериологическийHIMEDIARM667-500G
PIPES свободные кислотыMP Biomedicals190257
дигидрофосфат калияMerck1048731000
пептон протеозыHIMEDIARM005-500G
УФ-Вид спектрофотометр Shimadzu2072310058
Sigma LaborzentrifugeSigma-Aldrich3-18K
Sodium chlorideQualigens15915

Ссылки

  1. Wang, J., Pontopolous, K. Regulation of iron cellulatar metabolism. Biochemical Journal. 434 (3), 365-381 (2011).
  2. Schalk, I., Perraud, Q. Pseudomonas aeruginosa and its multiple strategies to access iron. Environmental Microbiology. 25 (4), 811-831 (2022).
  3. Ghssein, G., Ezzeddine, Z. A review of Pseudomonas aeruginosa metallophores: Pyoverdine, pyochelin and pseudopaline. Biology. 11 (12), 1711(2022).
  4. Sanchez-Jimenez, A., Marcos-Torres, F. J., Llamas, M. A. Mechanisms of iron homeostasis in pseudomonas aeruginosa and emerging therapeutics directed to disrupt this vital process. Microbial Biotechnology. 16 (7), 1475-1491 (2023).
  5. Dingemans, P., Cornelis, J. Pseudomonas aeruginosa adapts its iron uptake strategies in function of the type of infections. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 4 (11), (2013).
  6. Lin, J., Cheng, J., Shen, X. The pseudomonas quinolone signal (pqs): Not just for quorum sensing anymore. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8 (7), 1-9 (2018).
  7. Sass, G., et al. Intermicrobial interaction: Aspergillus fumigatus siderophores protect against competition by pseudomonas aeruginosa. PLoS ONE. 14 (5), 1-19 (2019).
  8. Dao, K. -H. T., Hamer, K. E., Clark, C. L., Harshman, L. G. Pyoverdine production by pseudomonas aeruginosa exposed to metals or an oxidative stress agent. Ecological Applications. 9 (2), 441-448 (1999).
  9. Visca, P., Imperi, F., Lamont, I. L. Pyoverdine siderophores: From biogenesis to biosignificance. Trends in Microbiology. 15 (1), 22-30 (2007).
  10. Ackerley, D. F., Caradoc-Davies, T. T., Lamont, I. L. Substrate specificity of the nonribosomal peptide synthetase pvdd from pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology. 185 (9), 2848-2855 (2003).
  11. Geum-Jae-Jeong,, et al. Pseudomonas aeruginosa virulence attenuation by inhibiting siderophore functions. Applied Microbiology and Biotechnology. 107 (4), 1019-1038 (2023).
  12. Dumas, Z., Ross-Gillespie, A., Kummerli, R. Switching between apparently redundant iron-uptake mechanisms benefits bacteria in changeable environments. Biological Sciences. 280 (1764), 20131055(2013).
  13. Gaille, C., Reimmann, C., Haas, D. Isochorismate synthase (pcha), the first and rate-limiting enzyme in salicylate biosynthesis of pseudomonas aeruginosa. Journal of Biological Chemistry. 278 (19), 16893-16898 (2003).
  14. Schwyn, B., Neilands, J. B. Universal chemical assay for the detection and determination of siderophores. Analytical Biochemistry. 160 (1), 47-56 (1987).
  15. Louden, B. C., Haarmann, D., Lynne, A. M. Use of blue agar cas assay for siderophore detection. Journal of Microbiology & Biology Education. 12 (1), 51-53 (2011).
  16. Arora, N. K., Verma, M. Modified microplate method for rapid and efficient estimation of siderophore produced by bacteria. 3 Biotech. 7 (381), 1-9 (2017).
  17. Frac, M., Gryta, A., Oszust, K., Kotowicz, N. Fast and accurate microplate method (biolog mt2) for detection of fusarium fungicides resistance/sensitivity. Frontiers in Microbiology. 7 (4), 1-16 (2016).
  18. Cezard, C., Farvacques, N., Sonnet, P. Chemistry and biology of pyoverdines, pseudomonas primary siderophores. Current Medicinal Chemistry. 22 (2), 165-186 (2015).
  19. Braud, A., Hoegy, F., Jezequel, K., Lebeau, T., Schalk, I. J. New insights into the metal specificity of the pseudomonas aeruginosa pyoverdine-iron uptake pathway. Environmental Microbiology. 11 (5), 1079-1091 (2009).
  20. Brandel, J., et al. a siderophore of pseudomonas aeruginosa: Physicochemical characterization of the iron(iii), copper (ii) and zinc (ii) complexes. Dalton Transactions. 41 (9), 2820-2834 (2012).
  21. Hoegy, F., Mislin, G. L. A., Schalk, I. J. Pseudomonas methods and protocols. Methods in Molecular Biology. 1149, (2014).
  22. Cunrath, O., et al. The pathogen pseudomonas aeruginosa optimizes the production of the siderophore pyochelin upon environmental challenges. Metallomics. 12 (12), 2108-2120 (2020).
  23. Ji, A. J., et al. A novel and sensitive LC/MS/MS method for quantification of pyochelin in human sputum samples from cystic fibrosis patients. Biomarkers & Applications. 4 (1), 135(2019).
  24. Visaggio, D., et al. A highly sensitive luminescent biosensor for the microvolumetric detection of the pseudomonas aeruginosa siderophore pyochelin. ACS Sensors. 6 (9), 3273-3283 (2021).
  25. Miethke, M., Marahiel, M. A. Siderophore-bases iron acquisition and pathogen control. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 71 (3), 443-451 (2007).
  26. Il, J. M. R., Lin, Y. -M., Lu, Y., Miller, M. J. Studies and syntheses of siderophores, microbial iron chelators, and analogs as potential drug delivery agents. Current Medicinal Chemistry. 7 (2), 159-197 (2000).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Количественное определение пиовердинаэкстракция пиохелинаанализ на CAS-агареспектрофотометрический анализбесклеточный супернатантфакторы вирулентностизахват железамикропланшет
Качественный и количественный анализ продукции сидерофоров синегнойной палочки
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.