Возможность проведения высокопроизводительных исследований экспрессии трансгенов с использованием автоматизированной работы с жидкостями для этиолированных протопластов листьев кукурузы

Summary

В этом протоколе описывается создание рандомизированной схемы трансфекции с использованием автоматизированного обработчика жидкостей, протокола выделения протопластов для этиолированных листьев кукурузы и 96-луночной процедуры трансфекции с использованием обработчика жидкостей.

Abstract

В последние годы в области биотехнологии растений произошли замечательные успехи, которые произвели революцию в области манипулирования и конструирования растений для различных целей. Однако по мере того, как исследования в этой области становятся все более разнообразными и все более сложными, потребность в ранних, эффективных, надежных и высокопроизводительных решениях для скрининга переходных процессов для сужения стратегий, ведущих к стабильной трансформации, становится все более очевидной. Одним из методов, появившихся в последние годы, является использование растительных протопластов, для которых методы выделения и трансфекции доступны у многих видов, тканей и стадий развития. В данной работе описывается простой автоматизированный протокол рандомизированного получения плазмиды в 96-луночном планшете, метод выделения этиолированных протопластов листьев кукурузы и автоматизированная процедура трансфекции. Внедрение автоматизированных решений в биотехнологии растений, примером которых являются эти новые протоколы обработки жидкостей для трансфекции растительных протопластов, представляет собой значительный шаг вперед по сравнению с ручными методами. Используя автоматизацию, исследователи могут легко преодолеть ограничения традиционных методов, повысить эффективность и ускорить научный прогресс.

Introduction

Трансфекция растительных протопластов, введение чужеродного генетического материала в растительные клетки, лишенные клеточных стенок, является ключевым методом и за последние полвека охватывает множество видов в поддержку исследований в области биотехнологии растений. Тем не менее, использование этих методов может быть болезненным и ограниченным по масштабу, даже при миллионах протопластов, производимых на одну изоляцию. Традиционные методы трансфекции растительных протопластов часто являются трудоемкими, трудоемкими, подверженными изменчивости и технически сложными, что приводит к созданию нишевых систем с низкой воспроизводимостью^. Тем не менее, потенциал, который открывают автоматизированные решения в последние годы, высвечивает возможность вдохнуть новую жизнь в эту 60-летнюю молодую технику ^2,3. Благодаря потенциалу автоматизации критически важных, но повторяющихся этапов, таких как подготовка материала, инкубация полиэтиленгликоля (ПЭГ) и последующее дозирование реагентов для трансфекции, исследователи могут значительно снизить требования к физической обработке и другие потенциальные источники человеческих ошибок^. Кроме того, точный контроль и однородность, обеспечиваемые автоматизированными системами обработки жидкостей, обеспечивают стабильные и воспроизводимые результаты трансфекции.

В то время как выделение протопластов является тщательным процессом, включающим измельчение, сбраживание, инкубацию, фильтрацию и центрифугирование, трансфекционная часть этих протоколов специально разработана для автоматизированных обработчиков жидкостей. Процедура для большинства протоколов трансфекции протопластов является ПЭГ-опосредованной, и смешивание выделенного протопласта в присутствии ПЭГ и очищенной плазмидной ДНК в течение определенного периода времени в точной концентрации (в зависимости от вида и ткани) позволяет этим клеткам поглощать плазмидную ДНК⁵. За этой трансфекцией следует серия этапов промывки, кульминацией которых является ночная инкубация⁶. После инкубационного периода, если все было спроектировано и поставлено должным образом, эксперимент приводит к выражению интересующего компонента и/или потенциалу оценки различных регуляторных компонентов^. Все этапы аспирации, диспенсирования и перемешивания/смешивания, связанные с этой процедурой, обычно выполняются с помощью ручной пипетки. Выполнение такого протокола вручную, по одной отдельной реакции за раз, является трудоемким и вносит ненужные различия между образцами, а также ограничивает емкость, которую можно оценить в любой момент времени. Автоматизированные протоколы манипуляций с клетками млекопитающих или насекомых и химического синтеза в фармацевтической промышленности практикуются уже несколько лет ^4,8,9. Использование протопластов и протоколов, включающих автоматизированную обработку жидких растительных материалов, находится на подъеме 10,11,12,13.

Внедрение автоматизированных протоколов работы с жидкостями для трансфекции растительных протопластов имеет большие перспективы для исследовательских применений. Исследователи могут изучать более обширные генетические библиотеки, проводить скрининг конкретных функций генов в ускоренном темпе и более^{всесторонне исследовать} сложные генетические взаимодействия, связанные со стрессом растений. Масштабируемость автоматизированных подходов с использованием 96-луночных капсул в сочетании с флуоресцентным скринингом позволяет проводить эксперименты с высокой производительностью и позволяет ученым быстро генерировать данные и идеи, которые могут способствовать прогрессу в биотехнологии растений^. Однако с увеличением пропускной способности, приводящим к созданию сотен, если не тысяч точек данных, необходим дополнительный контроль качества, учитывающий любые источники ошибок, которые могут исказить^{результаты.} Одним из элементов, который был определен в качестве фактора, способствующего развитию во многих научных дисциплинах, является эффект края. Некоторые стратегии смягчения последствий предложат наилучшую плиту для использования или заполнения межскважинного пространства или самых внешних скважин водой для борьбы с этим явлением^16,17. Тем не менее, эти стратегии увеличивают время, и если конкретного одноразового продукта нет, единственный вариант — согласиться на меньшее или отложить. С другой стороны, изучение стратегий, которые учитывают этот эффект с помощью схемы блокировки, не приводит к потере пропускной способности или задержки выполнения.

Этот протокол этиолированных протопластов листьев кукурузы и два его автоматизированных метода, показанные на рисунке 1 , направлены на решение проблемы изменчивости, присущей экспериментам с протопластами, путем автоматизации нескольких частей канонического метода протопластов, распределения плазмидного материала в сосуде, используемом для трансфекции, и самой трансфекции. Эти методы продемонстрированы на примере этиолированной платформы протопластов листьев кукурузы, поскольку она является хорошо охарактеризованной, простой и эффективной платформой для протопластов. Все описанные здесь шаги немедленно доступны протоколам трансфекции протопластов, в которых используются аналогичные или те же буферные решения. Тем не менее, особое внимание следует уделить уникальным характеристикам исходной ткани и видов протопластов, прежде чем внедрять эти методы. Эти усовершенствования за счет автоматизации упрощают подготовку материала для отдельных экспериментов и значительно повышают производительность: от последовательной трансфекции по одной до 96 трансфекций, выполняемых одновременно. В этой работе также будет показано обоснование использования рандомизированных неполных блоков для учета смещения положения пластин.

Protocol

1. Создание трансфекционной пластины

1. Создание схемы деки: Чтобы создать метод рандомизации ДНК-пластин, откройте программное обеспечение для обработки жидкостей. Нажмите кнопку «Новый метод » в строке меню, чтобы создать новый метод. Добавьте линию Instrument Setup между линиями Start и Finish, нажав кнопку Instrument Setup на левой панели.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Соответствующие скриншоты, которые следуют вместе с этим автоматизированным протоколом, можно найти на дополнительном рисунке 1, дополнительном рисунке 2 и дополнительном рисунке 3.
2. Нажмите на строку «Настройка инструмента », найдите нужную лабораторную посуду в меню категории «Лабораторная посуда » и перетащите ее на схему деки, как показано на дополнительном рисунке 1.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если лабораторное оборудование ранее не определено, то его необходимо запрограммировать в манипулятор жидкостей в соответствии со спецификацией производителя, но такие инструкции выходят за рамки данного протокола.
3. Настройка переноса из файла: Нажмите кнопку Перенести из файла на палитре шагов и поместите строку Перенести из файла ниже строки Настройка инструмента. Убедитесь, что выбор и замена наконечника показаны на дополнительном рисунке 3.
4. Убедитесь , что в поле Файл есть строка заголовка , и убедитесь, что информация в столбце верна.
5. Нажмите на область источника , чтобы активировать ее, и щелкните на исходной пластине на макете деки, определите целевую пластину и введите количество ДНК для пипетирования.
6. Нажмите кнопку «Настроить», чтобы подробно определить технику пипетирования, например, касаться кончиком стены.
7. Укажите количество плазмидной ДНК для переноса. В этом протоколе используется 20 мкл 1 мкг/мкл плазмидной ДНК на трансфекцию (лунку).
   Примечание: количество плазмидной ДНК, которая переносится на трансфекционную пластину до трансфекции протопластов, будет зависеть от используемой платформы протопластов.
8. Создайте перенос из файла .csv документа.
   1. Этот документ состоит из двух колонок. Подготовьте первый столбец, т.е. столбец From, в котором указано расположение стоковой плазмидной ДНК внутри штатива для пробирок, т.е. для образца 1; это было бы хорошо A01. Поскольку этот перенос происходит три раза (три повторения), три строки должны обозначать A01 в столбце «От».
   2. Подготовьте вторую колонку, т.е. колонку To, используемую для указания ячейки назначения плазмидной конструкции 96-луночного планшета. Например, образцом 1 (A01) могут быть B02, D04 и H07. Сохраните его как файл .csv для совместимости с программным обеспечением для работы с жидкостями.
9. Перед запуском протокола убедитесь, что позиции на палубе загружены, лабораторное оборудование правильно определено, документ рандомизации включает местоположения всех образцов ДНК в штативе для пробирок, а также что в пробирках достаточно образца плазмиды для выполнения протокола.
10. Разверните меню «Свойства файла » на шаге «Передача из файла», выберите .csv созданный файл и запустите протокол.
11. Накройте трансфекционные пластины уплотнителем из алюминиевой фольги, когда протокол будет успешно выполнен. Храните трансфекционные пластины при температуре -20 °C до использования. Изолированный этиолированный протопласт листьев кукурузы будет добавлен в эту трансфекционную пластину на этапе 3.3.

2. Выделение протопластов этиолированных листьев кукурузы

1. Чтобы начать выделение этиолированных протопластов листьев кукурузы, получают совместимый с протопластами генетический фон, такой как NP222, который использовали здесь¹⁸. Перед началом эксперимента подготовьте только 3 буфера, а именно буферы MMg, W5 и WI, перечисленные в таблице 1 , и поддерживайте при температуре 4 °C. Приготовьте раствор для дигезирования и ПЭГ в день эксперимента для достижения наилучших результатов.
2. Поверхностная стерилизация 25 семян путем погружения их в 25% раствор коммерческого отбеливателя и встряхивания на встряхивателе с вращающейся платформой в течение примерно 15-20 минут при комнатной температуре.
3. После перемешивания семена тщательно промойте с помощью стерильной воды (DI). Повторите шаг полоскания 5 раз. Замочите семена в стерильной воде на ночь комнатной температуры.
4. Посейте семена во влажную, автоклавную почву на следующий день. Добавьте сухие глиняные гранулы, чтобы отвести лишнюю влагу из почвы и предотвратить грибковое заражение.
5. Выращивайте рассаду кукурузы в 16-часовой светлой камере для выращивания при температуре 28 °C (относительная влажность (RH) 30%) в течение примерно 3 дней, пока колеоптиля не окажется на высоте 1-2 см над почвой, а затем перенесите в темную камеру с той же температурой и относительной влажностью еще на 5-7 дней.
6. Соберите первую настоящую ткань листьев, разрезав ее чуть выше первого воротника.
7. Поверхность кратковременно простерилизовать в 25% коммерческом отбеливателе и 250 мкл 20% раствора Tween 20 в течение 1 минуты. Тщательно промойте листовой материал 5 раз деионизированной водой.
8. Слегка обсушите ткань листьев кукурузы безворсовыми салфетками и с помощью острого лезвия удалите ~1,5 см как от кончика, так и от основания каждой листовой пластинки.
9. Оставшуюся ткань листа нарежьте узкими (0,5 мм - 1 мм) поперечными полосками и поместите в чашку Петри размером 100 х 25 мм.
10. Отфильтруйте и стерилизуйте 25 мл раствора для сбраживания через шприц-фильтр 0,22 мкм непосредственно в чашку Петри, содержащую нарезанную ткань.
11. Вакуумная инфильтрация тканей листа раствором для сбраживания путем применения вакуума в течение 30 минут при комнатной температуре в вакуумном эксикаторе при давлении примерно -75 мбар.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Давление вакуума в помещении для многочисленных академических и частных лабораторий должно быть достаточным для этого этапа.
12. Поместите на встряхиватель с вращающейся платформой и встряхивайте при температуре 25 °C в темноте со скоростью 60 об/мин в течение 2,5–3 часов. Когда до конца периода сбраживания осталось 10 минут, увеличьте скорость до 90 об/мин.
13. Вылейте раствор для сбраживания и любой непереваренный растительный материал через воронку в верхней части ситового фильтра 40 мкм в пробирку объемом 50 мл.
14. Центрифугируйте раствор внутри пробирки объемом 50 мл при давлении 150 x g в течение 4 минут, чтобы гранулировать протопласт. Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 10 - 15 мл раствора MMg Buffer.
15. Повторите центрифугирование и удалите надосадочную жидкость. Повторно суспендируйте в 5 - 10 мл свежего MMg буфера.
16. С помощью гемоцитометра тщательно измерьте плотность выделенного протопласта. Ресуспендирование до приблизительной плотности 5 x 10⁵ протопластов на мл.
17. Дайте изоляту отдохнуть на льду в течение ~30 минут перед трансфекцией. За это время приготовьте раствор ПЭГ. Полностью растворите ПЭГ в растворе с помощью водяной бани при температуре 37 °C и оставьте его там до трансфекции.

3. Автоматизированная трансфекция протопластов

ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги с 3.6 по 3.15 полностью управляются автоматическим обработчиком жидкостей, за исключением двух пользовательских пауз на шагах 3.10 и 3.13, которые требуют ручного центрифугирования. Соответствующие скриншоты, которые следуют вместе с этим автоматизированным протоколом, можно найти в дополнении, Дополнительный рисунок 1, Дополнительный рисунок 3, Дополнительный рисунок 4 и Дополнительный рисунок 5.

1. Подготовьте схему деки манипулятора для обработки жидкостей в соответствии с методом трансфекции протопластов, описанным в следующих шагах. Соберите следующие материалы: конечную пластину (в данном случае это будет 96-луночная черная пластина с прозрачным дном микропластины для измерения флуоресценции), одну коробку с широкими наконечниками для автоматизации объемом 25 - 250 мкл для этапа аспирации ПЭГ, пять коробок с наконечниками для дозатора объемом 25 - 250 мкл для остальных этапов работы с жидкостью, три пластиковых желоба в качестве резервуаров для реагентов, одна пустая 96-луночная пластина для сбора отходов, оставшаяся трансфекционная буферная промывка растворов, W5 и WI.
2. Непосредственно перед началом процедуры трансфекции фильтруйте стерилизующий раствор ПЭГ через стерильную одноразовую вакуумную фильтрующую установку 0,22 мкм в свежую пробирку объемом 50 мл.
3. Из протопласта, ресуспендированного в буфере MMg, добавьте 100 мкл (примерно 50 000 протопластов) в каждую лунку предварительно подготовленной, размороженной трансфекционной пластины. Для этого нужно налить протопластсодержащий буферный раствор в стерильное корыто объемом 10 мл и использовать многоканальную пипетку. Продолжайте осторожное перемешивание желоба, чтобы предотвратить оседание протопласта из раствора во время этого ручного этапа переноса.
4. Налейте раствор ПЭГ в соответствующее корыто и установите трансфекционную пластину, теперь содержащую протопласт и плазмидную ДНК, содержащую трансфекционную пластину, приготовленную на шаге 1, в указанном месте в соответствии с планировкой палубы.
5. Чтобы создать метод трансфекции протопластов, откройте программное обеспечение для обработки жидкостей и выполните описанные ниже действия.
   1. Перемещение лабораторной посуды между палубами: Замените пустой ящик для чаевых на загрузочной палубе на новый с помощью команды «Переместить лабораторную посуду». Выберите колоды From и To в представлении Configuration .
   2. При объемах более 200 μл: Не заменяйте наконечники между пересадками. Загрузите чаевые для первого шага переноса и выгрузите после последнего шага перемещения, что требует правильного указания параметров загрузки/выгрузки для каждого шага перемещения, как показано на дополнительном рисунке 3.
6. Создание макета деки: Как и в случае с методом создания трансфекционной пластины, чтобы создать автоматизированный метод трансфекции ДНК, откройте программное обеспечение для обработки жидкостей. Нажмите кнопку «Новый метод » в строке меню, чтобы создать новый метод. Добавьте линию настройки инструмента между линиями Start и Finish, нажав кнопку Instrument Setup на левой панели. Создайте схему колоды в соответствии с схемой, показанной на дополнительном рисунке 1.
7. Смешивание клеток/ДНК: Добавьте шаг для смешивания протопластов и ДНК перед добавлением ПЭГ с помощью кнопки действия устройства и настройки устройства (встряхивание, автоматического позиционера лабораторной посуды или ALP), скорости встряхивания (1500 об/мин) и времени встряхивания (10 с).
8. Добавление и смешивание ПЭГ: Чтобы начать трансфекцию, добавьте стадию переноса, чтобы добавить 110 мкл ПЭГ из резервуара ПЭГ с помощью пипетки на 96 капсул. Убедитесь, что правильное исходное и конечное положения запрограммированы в соответствии с заданной планировкой деки. Запрограммируйте этап переноса на аспирацию ПЭГ на расстоянии 1 мм от дна резервуара и нанесение ПЭГ на расстоянии 3 мм от основания 96-луночного планшета, содержащего смесь протопласта и ДНК. Добавьте еще один шаг встряхивания после добавления PEG, скопировав и вставив ранее запрограммированные шаги.
9. Инкубация ПЭГ: Добавьте шаг паузы, нажав кнопку «Пауза », выберите шейкер и введите заранее определенное время инкубации, которое начинается с добавления ПЭГ.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Таймер для паузы будет продолжаться, если не произойдет каких-либо прерываний или сбоев в работе световой завесы, которые приведут к появлению сообщения об ошибке. Убедитесь, что в случае необходимости манипуляций с колодой эти сообщения были удалены, прежде чем уйти.
10. Добавление/смешивание буфера W5: Добавьте три линии Transfer по 200 μL для переноса в общей сложности 600 μL буфера W5 на трансфекционную пластину для гашения реакции инкубации PEG. После добавления буфера W5 встряхните и сделайте паузу, чтобы обеспечить центрифугирование трансфекционной пластины.
11. Пауза для пользователя 1: Центрифугируйте протопластовую трансфекционную пластину при давлении 100 x g в течение 4 минут. Верните трансфекционную пластину, теперь с гранулированным протопластом, обратно в соответствующее положение деки. Добавьте пользователю паузу нажатием кнопки Пауза , за исключением того, что теперь с помощью паузы вся система и отображение выбранного варианта сообщения .
    ПРИМЕЧАНИЕ: Всплывающее окно с сообщением о паузе должно быть удалено, прежде чем обработчик жидкостей продолжит работу с остальной частью протокола.
12. Удаление надосадочной жидкости: Добавьте две строки Переноса, чтобы удалить 400 μл надосадочной жидкости и перенести на пластину для отходов. Чтобы избежать аспирации клеток во время удаления надосадочной жидкости, установите расстояние от дна 6 мм.
13. Добавление/смешивание WI Добавьте 3 строки Transfer для переноса 580 μL буфера WI на трансфекционную пластину. Добавьте еще один шаг встряхивания после добавления WI, скопировав и вставив ранее запрограммированные шаги. Перейдите к следующей паузе пользователя.
14. Пауза для пользователя 2: Центрифугируйте протопластную трансфекционную пластину при давлении 100 x g в течение 4 минут. Верните трансфекционную пластину, теперь с гранулированным протопластом, обратно в соответствующее положение деки.
15. Удаление надосадочной жидкости: Добавьте четыре строки Переноса, чтобы удалить 680 мкл надосадочной жидкости и перенести на пластину для отходов. Чтобы избежать аспирации клеток во время удаления надосадочной жидкости, установите расстояние от дна 6 мм.
16. Перенос протопластов на микропланшет: Окончательный перенос этого протокола состоит из двух этапов переноса по 150 μL. Перед каждым отдельным этапом повторно аспирируйте протопласты со скоростью 50 мкл/с на расстоянии 2 мм от дна трансфекционной пластины и дозируйте со скоростью 3 мм. Затем, используя те же наконечники для пипетки, перенесите на микропланшет назначения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Объем буфера для аспирации и дозирования над гранулой перед переносом на микропланшет нарушит все оставшиеся протопласты, гранулированные в нижней части трансфекционной пластины, чтобы гарантировать отсутствие потери образца. Поскольку рандомизация была проведена во время создания трансфекционной пластины, на этом автоматизированный протокол завершен.
17. Инкубируйте микропланшет при комнатной температуре в темноте в течение 24–48 часов перед первым измерением флуоресценции.

Results

Получить данные наблюдений, подтверждающие, что краевые эффекты могут влиять на измерения отклика; Для подтверждения этих подозрений было проведено пилотное исследование. В данном исследовании вышеуказанные методы были применены к трем реплицированным 96-луночным планшетам с только одним уровнем обработки; все протопласты трансфицировали с использованием pSYN11250¹⁹, плазмиды, которая конститутивно экспрессирует ZsGreen, с целью показать, что существуют систематические различия в уровне отклика для единиц на краю пластины по сравнению со вторым рядом, а также в центральных областях пластины. 36 скважин на внешнем краю пластины определены как блок 1, 28 скважин во втором ряду от края - как блок 2, а центральные 32 скважины - как блок 3 - см. Рисунок 2А внизу справа. Эта схема может вместить 28 уровней обработки в виде рандомизированного дизайна полного блока (RCBD) или 32 уровня обработки в виде рандомизированного дизайна неполного блока (RIBD). На рисунке 2A для каждой репликации (rep) исходные точки данных для каждой скважины были нормализованы по среднему значению из соответствующей пластины. Во всех трех повторах эксперимента реакции на краю пластины в среднем в 1-1,5 раза больше минимальной. На рисунке 2B изображено среднее значение блоков в процентах от общего среднего значения пластины для каждой реплики. В таблице 2 показаны односторонние таблицы ANOVA от подгонки линейной модели с блоком в качестве фиксированного эффекта. По причинам, связанным с ограниченной рандомизацией, связанной с проектированием блоков, вывод, основанный на проверке гипотез для блокирующего фактора, считается в лучшем случае приблизительным, а в худшем — неверным. Тем не менее, подгонка модели с фиксированным коэффициентом блокировки полезна для оценки эффективности схемы блокировки. Mn_Sq (блок) представляет собой среднее квадратичное отклонение среднего значения блока относительно общего среднего. Mn_Sq (Error) представляет собой среднее квадратичное отклонение отдельных наблюдений относительно их соответствующих групповых средних, в данном случае общее среднее, поскольку в модели отсутствует фактор лечения. Когда Mn Sq (блок) больше, чем Mn Sq (ошибка), т.е. F-отношение больше единицы, размер среднеквадратичной ошибки был эффективно уменьшен по сравнению с полностью рандомизированным дизайном (CRD), тем самым увеличивая статистическую мощность для сравнения интересующих нас методов лечения и уменьшая ширину доверительных интервалов, оценивающих контрасты лечения. На рисунке 2B показаны F-отношения, которые значительно превышают единицу, и измеренный отклик имеет тенденцию уменьшаться по мере его продвижения к центру на всех трех реплицируемых пластинах. Во всех трех повторах 95% доверительные интервалы наблюдаются на уровне 0,05 по меньшей мере для одного блока, который не покрывает наблюдаемое среднее значение пластины. Таким образом, можно сделать вывод, что схема блокировки существенно повышает точность этих оценок. Помимо меньшей точности, неспособность учесть пространственную изменчивость может привести к ложным результатам из-за возможности смешивания эффектов лечения с краевым эффектом.

Несмотря на то, что существует долгая история протоколов выделения и трансфекции этиолированных протопластов кукурузы, восходящая к началу 1990-х годов, этот протокол вносит некоторые дополнительные изменения в традиционную процедуру, чтобы лучше облегчить воспроизводимое выделение протопластов в объеме для целей высокопроизводительной трансфекции протопластов²⁰. Этапы стерилизации поверхности семян и тканей листьев перед вывариванием снижают грибковое загрязнение, не требуя асептической среды. Использование почвы также поможет снизить затраты по сравнению с использованием специальных питательных сред или покупкой стерильных одноразовых контейнеров. Протокол на нескольких этапах может быть масштабирован для обеспечения различных уровней пропускной способности. Примерно 2 г ткани первого листа дают от 5 x 10⁶ до 10 x^{10 6} протопластов. Поскольку требуется 5 x 10⁶ протопластов на 96-луночную трансфекцию, протокол изоляции, как он написан, может вместить 2 прогона протокола трансфекции. В этом протоколе также используется MMg в качестве моющего раствора вместо канонического раствора W5. Первоначально этот вывод был получен из публикаций о протопласте корня Arabidopsis как средстве уменьшения числа буферных растворов, используемых для любого конкретного этапа процедуры трансфекции протопластов²¹. Тем не менее, он также использовался для этиолированных протопластов листьев кукурузы в течение²⁰²² года. Дальнейшим улучшением выделения и трансфекции любого протокола протопластов будет упрощение и сокращение буферных растворов. В настоящее время этот протокол переключается между буфером канонического разложения, буфером W5, буфером MMg и буфером WI. Упрощение решений было бы очень полезным для улучшения воспроизводимости экспериментов с протопластами и уменьшения вариабельности между экспериментами от человека к человеку или от партии к партии. Примечательно, что последним новшеством протокола является отсутствие полного удаления буферных растворов после трансфекции ПЭГ. Причина, по которой автоматизация возможна, заключается в том, что протопласты, этиолированная кукуруза, показанные здесь и другие, которые мы испытали, заключаются в том, что они, по-видимому, допускают разбавление в качестве средства гашения реакции, а не полного удаления различных буферных^{растворов}. Результаты репортеров, как показано в нашем используемом здесь контроле трансфекции GFP, указывают на то, что протопласт может переносить до 5% ПЭГ без негативного влияния на интенсивность флуоресценции (дополнительный рисунок 6). Это значение более чем в два раза превышает ожидаемую концентрацию ПЭГ после завершения работы над описанным здесь протоколом.

Рисунок 1: Иллюстративная схема процедуры выделения и трансфекции протопластов. Шаги, на которых была внедрена автоматизация, обозначены пунктирными красными линиями и соответствующими синими рамками. Числа, окруженные красным кругом, соответствуют трем описанным методам. Создано с помощью BioRender.com. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

(A) Топографические карты, показывающие кратное изменение интенсивности флуоресценции для 96-луночных планшетов, трансфицированных pSYN11250, относительно среднего значения в планшете для 3 независимых экспериментов с репликацией (Rep). Среднее значение этих экспериментов также показано на схеме блокировки, обозначенной пунктирными линиями разного цвета, наложенными сверху. (B) Ленточные диаграммы, показывающие среднее значение блока в процентах от общего среднего значения пластин для репликации пластин 1, 2 и 3 слева направо. Полупрозрачные круги представляют собой исходные точки данных после деления на среднее значение пластины. Полосы погрешностей представляют собой 95% доверительные интервалы на уровне 0,05, где центральное тире обозначает среднее значение. Коричневый, золотой и серый цвета обозначают край, второй ряд и внутреннюю часть пластины соответственно. Пунктирная красная линия на 100% представляет общее среднее значение по пластине. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Буфер	Реагент
Пищеварение	1,5% целлюлозы Rs
	0,3% Макрофермент
	0,6 М Маннитол
	10 мМ MES (ph 5.7)
	1 мМ CaCl2
	0,1% (по мас./об.) БСА
	0,5 нМ β-меркаптоэтанол или 0,5 мМ DTT
Ммг	0,6 М Маннитол
	15 мМ MgCl2
	4 мМ MES, pH 5,7
П5	154 мМ NaCl
	125 мМ CaCl2
	5 мМ KCl
	2 мМ MES, pH 5,7
ВИС	0,6 М Маннитол
	4 мМ MES, pH 5,7
	4 мМ KCl
КОЛЫШЕК	30% ПЭГ (по объему)
	0,6 М Маннитол
	100 мМ CaCl2

Таблица 1: Буферные растворы для выделения и трансфекции этиолированных протопластов кукурузы.

Репс	Источник	Df	Сумма Sq	Мн Скв	Значение F	Пр (>Ж)
Повторить 1	Блок	2	0.26	0.13	10.64	<0,001
	Остаточный	93	1.135	0.012
Репликация 2	Блок	2	0.507	0.25	21.41	<0,001
	Остаточный	93	1.102	0.012
Репликация 3	Блок	2	0.179	0.09	4.48	0.014
	Остаточный	93	1.861	0.02

Таблица 2: Таблица односторонних ANOVA для трех реплик эксперимента по трансфекции pSYN11250 на 96 лунок. Для каждой повторяющейся пластины: столбец Source обозначает источник изменения, Df обозначает степени свободы, Sum Sq обозначает сумму квадратов, Mn Sq обозначает средние квадраты (Sum Sq/Df), значение F обозначает отношение Mn_Sq (блок) к Mn_Sq (ошибка), а Pr(>F) обозначает p-значение глобального F-критерия.

Дополнительный рисунок 1: Скриншоты панели управления программным обеспечением. Категории выбора, относящиеся к созданию нового метода, а также макеты колод для протоколов рандомизации и трансфекции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 2: Ключевые шаги в настройке протокола создания трансфекционной пластины. Скриншоты сделаны во время создания протокола создания трансфекционной пластины. Номер и название каждой панели соответствуют шагам в протоколе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 3: Скриншоты для манипуляций с лабораторным оборудованием и загрузки чаевых для создания протокола трансфекции. Они представляют собой шаги, которые повторяются множество раз на протяжении всего протокола, поэтому, чтобы избежать повторного упоминания, здесь показаны репрезентативные шаги. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 4: Смешивание клеточной ДНК через паузу пользователя 1. Скриншоты, сделанные во время создания протокола трансфекции. Номер и название каждой панели соответствуют шагам в теле протокола. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 5: Удаление надосадочной жидкости после паузы пользователя 1 путем переноса образцов на микропланшет. Скриншоты, сделанные во время создания протокола трансфекции. Номер и название каждой панели соответствуют шагам в теле протокола. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 6: ZsGreen трансфицированный этиолированный протопласт листьев кукурузы, обработанный различными концентрациями ПЭГ в течение буферного времени WI. Гистограмма, показывающая относительную интенсивность флуоресценции протопластов после лечения ПЭГ через 24, 48 и 72 ч с измерением с помощью считывателя микропланшетов. Погрешность = SD, n = 4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Discussion

В данной рукописи описан протокол автоматизации создания трансфекционных пластин и выделения этиолированных протопластов листьев кукурузы с помощью автоматизированной трансфекции. Для успешного завершения части протокола, связанной с созданием трансфекционной пластины, требуется автоматизированный робот для работы с жидкостями, оснащенный 8-канальной капсулой. Для протокола трансфекции рекомендуется использовать 96-луночную капсулу для полной и равномерной 96-луночной трансфекции планшетами. Метод трансфекции может быть выполнен с использованием 8-канальной капсулы, но особое внимание необходимо уделять количеству времени, которое занимают этапы аспирации и дозирования, а также времени, которое можно отнести к изменению наконечников между колонками. Хорошо известно, что различия в продолжительности инкубации ПЭГ оказывают значительное влияние на эффективность и экспрессию ПЭГ, и поэтому необходимо уделять особое внимание этим факторам, чтобы предотвратить неравенство^{в работе} с образцами. Прежде чем приступать к работе с протоколом работы с жидкостями, важно рассмотреть его этапы и определить, можно ли выполнять определенные действия одновременно. В этом протоколе используется устройство, которое загружает наконечники на 96-луночный контейнер из 1 позиции на палубе. Обработчик жидкостей для этого протокола включает в себя функцию, при которой робот меняет коробки с наконечниками во время инкубационных периодов или во время паузы пользователя, чтобы избежать добавления дополнительного времени к протоколу. Принимая решение о покупке манипулятора для работы с жидкостями, подумайте о функциональности и потенциальной экономии времени.

Несмотря на то, что этот протокол был разработан для использования устройств Beckman Coulter NXp и Biomek FX, этот протокол может быть адаптирован к любому аналогичному устройству для работы с жидкостями. Все манипуляторы для работы с жидкостями имеют некоторые средства для обозначения того, как и в каком объеме перемещать объемы из одного места в другое. Для этого протокола эти устройства использовали команду Transfer from File line. Если лабораторное оборудование правильно определено, пользователь может пересаживаться с любого судна или на него. В исключительных обстоятельствах, например, если штативы или адаптеры для труб не доступны в продаже, можно использовать 3D-печать таких разъемов. Для типичных протоколов трансфекции протопластов 20 мкг ДНК в концентрации 1 мкг/мкл является стандартным объемом материала для многочисленных протопластовых платформ¹³_. Во время создания трансфекционной пластины, в качестве дополнительной меры предосторожности, используйте фильтрующие наконечники объемом 0,2 - 20 мкл, чтобы свести к минимуму риск загрязнения из-за аэрозольной плазмиды во время переноса. Исключение человеческого компонента препарата снижает вариации с течением времени и улучшает воспроизводимость этих высокопроизводительных экспериментов. Кроме того, тарелки можно готовить заблаговременно. Эта подготовка снимет стресс ученого-трансфекциониста в день эксперимента. Тем не менее, важно избегать хранения этих пластин плазмидной ДНК при температуре 4 °C в течение длительного периода времени, так как образцы могут испариться. Образцы должны храниться в морозильной камере при температуре -20 °C, а затем могут быть разморожены в холодильнике при температуре 4 °C перед трансфекцией. После того, как этот протокол создания трансфекционной пластины запрограммирован, его следует легко воспроизвести, указав новый перенос из файла .csv и заняв те же места деки для образцов, лабораторного оборудования и реагентов.

Для автоматизированной процедуры трансфекции (этап 3) подготавливают избыток раствора ПЭГ, чтобы обеспечить равномерную аспирацию вязкой жидкости из желоба, обычно избыток 40 мл для учета мертвого объема. Использование точно необходимого количества для трансфекции может привести к втягиванию воздуха в пипетки и неравномерному отсасыванию объемов ПЭГ через 96-канальную головку. Хотя этот раствор также можно приготовить заранее, его рекомендуется готовить в день переработки. Стерилизация раствора ПЭГ может быть выполнена с помощью шприцевого фильтра, но из-за вязкости она может быть затруднена. Использование вакуумного фильтрующего устройства происходит быстрее и может облегчить любое разочарование или боль, связанные с этой деятельностью. Как и в случае с раствором PEG, для обеспечения равномерного пипетирования по 96-канальной головке также обеспечивается избыток других растворов трансфекционного буфера (W5, WI). Буферные растворы (W5 и WI) могут быть заранее приготовлены навалом для использования в будущих прогонах работы с жидкостями. Несмотря на то, что реагенты не являются дорогостоящими, буферный раствор приносит в жертву значительную сумму. С увеличением количества рейсов в день, возможно, лучше использовать альтернативы резервуару, которые уменьшат избыток, выбрасываемый в конце прогона. Во время выполнения протокола обработки жидкостей W5 и WI могут быть добавлены в соответствующие желоба до начала протокола, во время 15-минутной инкубации или во время паузы пользователя в протоколе. Будьте осторожны при добавлении буферов в период инкубации из-за функций безопасности, таких как световая завеса. Обязательно удалите все предупреждающие сообщения из программного обеспечения, чтобы предотвратить непреднамеренное нарушение работы протокола.

Этот протокол отражает надежное, воспроизводимое и широко применимое усовершенствование ранее задокументированных автоматизированных протоколов для работы с протопластами^12,13. Этот метод можно адаптировать к, казалось бы, бесконечному репертуару протоколов протопластов, поскольку многие из них зависят от одной и той же серии этапов работы с буфером. Смягчение краевого эффекта с помощью RICBD во время автоматизированного создания трансфекционной пластины одновременно снижает количество усилий и вариативность при применении статистически значимой коррекции краевого эффекта. Трансфекция протопластов на 96 лунок исключает возможность каких-либо изменений, связанных со временем инкубации ПЭГ, проводя реакцию во всех 96 лунках одновременно. Несмотря на то, что протокол был предназначен для полной автоматизации этапов трансфекции, паузы пользователя потребуют физического вмешательства со стороны специалиста по трансфекции. В последние годы было достигнуто много успехов в области устойчивых к дисбалансу и совместимых с автоматизацией центрифуг. С помощью этого оборудования можно было бы автоматизировать весь метод без участия пользователя. В качестве альтернативы, в других протоколах центрифугирование избегают, позволяя протопласту оседать на дно лунки после трансфекции^12,13. Однако это добавит дополнительное время к процедуре трансфекции и лишнее время инкубации в буфере W5 перед ночной инкубацией в WI.

Во многих местах метода трансфекции описывается работа с объемами, превышающими 200 μл, где работа с жидкостью должна осуществляться с использованием нескольких пересадок. В зависимости от возраста и модели манипулятора жидкости этот этап может и должен быть выполнен в виде одного объема. Для более старых манипуляторов жидкостей, таких как описанная здесь модель, максимум, который можно аспирировать с использованием напора 96 лунок, составляет 200 мкл. Очевидным улучшением метода как с точки зрения эффективности, так и точности было бы сокращение количества переносов, чтобы свести к минимуму любой потенциальный риск разлива, капель или загрязнения. Другие соображения по совершенствованию протоколов работы с жидкостями изложены в обзорах этих технологий и их использования в области биотехнологии²³.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
(2)&бета;-меркаптоэтанол	Sigma	M6250
2-(N-морфолино)этансульфоновая кислота (MES) моногидрат	Sigma	69892
50 мл центрифужные пробирки с плоской крышкой стерильные	Fisher	22-010-064
96 Well Оптический Btm Plt PolymerBase черный с крышкой клеточной культуры стерильный PS .4 мл Well	Fisher	12-566-70
Axygen Biomek FX/NX Роботизированные наконечники, нестерильные, с широким отверстием	Fisher	14-222-096
Axygen Роботизированные наконечники 30 мкл фильтр, стерильный, стеллажный	Fisher	14-222-103
Bel-Art SP Scienceware Lab Companion Круглые вакуумные десикаторы	Fisher	08-648-10
Bemis 2 IN. X 250 футов Рулонная лаборатория Парафильм	Фишер	13-374-16
Biomek FXP	Beckman Coulter	902508
Дигидрат хлорида кальция	Sigma	C5080
Chemglass Life Sciences Одноразовый гемоцитометр	Fisher	50-131-1352
Clorox бактерицидный отбеливатель, концентрированный	Fisher	NC1871274
Corning Microplate Алюминиевая уплотнительная лента	Fisher	07-200-684
Corning 96-луночные пробные блоки, 2 мл, 96 лунки стандартные	Fisher	07-200-701
DL-дитиотреитол (DTT)	Сигма	10197777001
D-маннитол	Sigma	M9546
Пластиковый шприц Fisherbrand 60 мл	Fisher	14-955-461
Стерильный клеточный ситечко Fisherbrand 40 мкм	Fisher	22-363-547
Чашки Петри Fisherbrand с прозрачной крышкой, штабелируемые, 100 мм x 25 мм, Кейс 325	Fisher	FB0875711
Гексагидрат хлорида магния	Sigma	M2670
Millex Шприцевой фильтрующий блок стерильный 33 мм PES .22 мкм	Fisher	SLGPR33RS
Millex Шприцевой фильтрующий блок стерильный 33 мм PVDF.45 мкм		Fisher
MillliporeSigma Steriflip Стерильные одноразовые вакуумные фильтрующие блоки 50 мл PES	Fisher	SCGP00525
полиэтиленгликоль 4000	Sigma	81240
Redi-Earth Вилка и Смесь для рассады	Wyatt Quarles	GP92747
Обычные лезвия для бритвы с одним лезвием, стальная задняя часть .009RD	Fisher	12-640
Research Products International Corp Cellulase RS	Fisher	50-213-232
Research Products International Corp Macerozyme R-10	Fisher	50-213-444
Хлорид натрия	Sigma	S7653
Вкладыш для лотка - 36 ячеек - 6x6 вложенный	Hummert	11635000
Твин-20	Sigma	P1379
VACUUBRAND ME1 Вакуумный насос, 100-120 В, 50/60 Гц, американская вилка	VWR	97058-164