В данной статье представлен оптимизированный протокол установления модели пульпита у мышей с использованием инновационного ротового кляпа с последующим гистологическим анализом.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Создание модели воздействия пульпы мыши с новым кляпом для исследования пульпита
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Пульпит, распространенная причина естественной потери зубов, приводит к некрозу и потере биологической активности в воспаленной пульпе зуба. Разгадка механизмов, лежащих в основе пульпита, и его эффективное лечение находятся в центре внимания эндодонтических исследований. Таким образом, понимание воспалительного процесса в пульпе зуба жизненно важно для улучшения сохранности пульпы. По сравнению с другими экспериментами in vitro , модель пульпита у мышей предлагает более достоверный и генетически разнообразный контекст для наблюдения за патологическим прогрессированием пульпита. Тем не менее, использование мышей, несмотря на их экономическую эффективность и доступность, создает трудности из-за их небольшого размера, плохой координации и низкой переносимости, что усложняет внутриротовые и стоматологические процедуры. Этот протокол представляет собой новую конструкцию и применение кляпа для обнажения пульпы мыши, способствуя более эффективным внутриротовым процедурам. Кляп, состоящий из зубной дуги, легко доступной для большинства стоматологов, может значительно ускорить хирургическую подготовку даже к первым процедурам. Для выявления изменений морфологии и экспрессии клеток использовали микрокомпьютерную томографию, окрашивание гематоксилин-эозином (ПЭ) и иммунофлуоресцентное окрашивание. Цель данной статьи – помочь исследователям разработать более воспроизводимую и менее сложную процедуру создания модели воспаления пульпы с использованием этого нового кляпа.
Введение
Пульпа зуба, неотъемлемая часть зуба, отвечает за множество важных функций, таких как снабжение питательными веществами, образование дентина, сенсорная функция и защитные реакции1. Тем не менее, пульпа зуба, окруженная твердыми тканями, подвержена повреждениям и повреждениям в результате глубокого кариеса, пульпита, травмы или последующих методов лечения 2,3. Отсутствие функциональной пульпы зуба увеличивает риск хрупкости зубов4. Кроме того, потеря жизнеспособности пульпы в молодых постоянных зубах может негативно сказаться на созревании зубов, а современные методы протезирования не могут восстановить нервную обратную связь, обеспечиваемую здоровой пульпой4. Эта ситуация заставила исследователей изучить альтернативные решения для борьбы с воспаленной пульзой, помимо простого удаления.
В 2007 году Мюррей и др. инициировали применение тканевой инженерии в регенеративной эндодонтии, тем самым вызвав повышенный интерес к сохранению и регенерации пульпы5. Тем не менее, воспаленная ткань пульпы представляет собой проблему, поскольку клетки выделяют воспалительные факторы, такие как IL-6, которые рекрутируют воспалительные клетки и приводят к некрозу клеток, потере жизнеспособности пульпы и осложнениям в функциональном восстановлении 6,7. Таким образом, понимание воспаления и связанной с ним гибели клеток имеет решающее значение для прогресса в сохранении жизненно важной пульпы. Существует ряд экспериментов, которые были проведены для изучения молекулярной биологии воспламененной пульпы in vivo или in vitro 8,9. Несмотря на то, что эксперименты in vitro, такие как 2D или 3D клеточные культуры, разрабатываются в течение многих лет и становятся все более зрелыми и широко используются для проверки реакций клеток пульпы на воспалительные факторы, эти эксперименты не могут отразить взаимодействие между тканью пульпы и системнойиммунной системой. Если изучаемое явление получено из клеток другого тканевого происхождения, таких как иммунная, сосудистая и нервная системы, то культура клеток чистой пульпы приведет к тупику. Поэтому эксперименты in vivo очень нужны и референтны.
Мыши все чаще становятся распространенным выбором в исследованиях воспаления in vivo из-за их экономической эффективности, высокой фертильности и жизнеспособности. Тем не менее, в настоящее время отсутствует комплексный протокол для модели пульпита мышей, который мог бы служить эталоном. Небольшие размеры мышей и их чувствительность к стимуляции создают значительные проблемы во время экспериментальных процедур. Наблюдение за крошечными зубами, скрытыми глубоко во рту мыши, часто требует использования консольного микроскопа, несмотря на более распространенное присутствие настольных микроскопов в лабораториях. Отсутствие открывателя рта требует помощи со стороны окружающих. Чтобы решить эту проблему, группа разработала кляп для рта с использованием легкодоступных материалов, целью которого является обеспечение стандартизированного и воспроизводимого протокола для построения модели пульпита мышей. В этой статье подробно описана процедура, охватывающая предоперационную подготовку, иммобилизацию, операцию по экспозиции пульпы и сбор образцов у мышей C57. Этот протокол рекомендует использовать кляп для рта, предоставляя информацию о его структуре, производстве и применении, чтобы облегчить другим исследователям воспроизведение процедуры.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Экспериментальные процедуры в этом исследовании были одобрены этическим комитетом Западно-Китайской школы стоматологии Сычуаньского университета (WCHSIRB-D-2021-125). Взрослые мыши C57BL/6 были получены от компании Gempharmatech Experimental Animals Company, Чэнду, Китай. Вся коронка первого моляра верхней челюсти прорезывается через 21 день после рождения. Мыши для операции должны быть старше 21 дня при нормальной жизнеспособности11. Здесь для моделирования использовались мыши в возрасте от 6 до 8 недель. На рисунке 1 показана блок-схема, показывающая используемый протокол.
1. Предоперационная подготовка (Рисунок 2)
- Приобретите следующие инструменты: Стереоскопический микроскоп, фиксирующую пластину, медицинскую ленту, рот-кляп, малоинвазивный зубной бор диаметром 0,6 мм, стоматологический высокоскоростной стоматологический наконечник, пилку 8#C+, грелку, шприц объемом 1 мл, стерильный ватный тампон, глазные щипцы.
- Приобретают следующие препараты: смесь для анестезии, ветеринарную мазь.
2. Приготовление рта-кляпа
- Взвесьте и обезболите мышь путем внутрибрюшинного введения раствора анестезиологической смеси (10% кетамина гидрохлорид + 5% ксилазин + 85% стерильный изотонический раствор) в дозе 0,007 мл/г массы тела и подтвердите надлежащую анестезию методом щипкового пальца ноги. Нанесите на глаза офтальмологическую смазывающую мазь, чтобы предотвратить травмирование глаз из-за высыхания во время операции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимы медицинские шапки, маски, перчатки и комбинезоны, а также другие средства индивидуальной защиты. Убедитесь, что операционная среда и мышиная камера чистые и безопасные. Грелка для термоподдержки на протяжении всей процедуры необходима. - Приготовьте кляп для рта, как описано ниже (Рисунок 3).
- Приобретите следующие материалы: ортодонтическую дуговую проволоку диаметром 8 мкм, молодые плоскогубцы для изгиба петли, тяжелый кусачок для проволоки, маркер, резиновый колпачок длиной 3 мм и диаметром сечения 1 мм.
- Сначала выпрямите арочную проволоку левой рукой для фиксации и большим пальцем, указательный палец правой руки слегка согните против дуги проволоки. Повторите это действие несколько раз, это облегчит изгиб до правильного трехмерного угла.
- С помощью плоскогубцев для изгиба петли Йонг согнуть верхний край (Рисунок 3G, a-i) трапеции (Рисунок 3C, a-l-k-b) длиной около 8 мм в средней точке носовой проволоки. Убедитесь, что точка a (рисунок 3) находится на краю клюва плоскогубцев.
- Держите плоскогубцы левой рукой, зажмите свободный конец носовой проволоки большим и указательным пальцами правой руки и согните луковую проволоку от точки А под углом около 120°. Продублируйте предыдущее действие в точке i (рисунок 3G). Проверьте, находится ли арочный провод на одной плоскости, положив его на горизонтальный стол без поддевания.
- Оставьте около 9 мм длины с каждой стороны (Рисунок 3D, a-b, l-k) и согните свободный конец под углом 75°, используя тот же навык, что и в шаге 2.2.4, при этом следя за тем, чтобы каждый край находился в одной плоскости. Загните этот острый угол кончиком плоскогубца клюва.
- Найдите точку c примерно в 5 мм от точки b. Следуйте тому же умению, чтобы согнуть угол 105° в точке c. Согните еще один угол 105° в точке d на 5 мм от точки c. Отойдите примерно на 4,5 мм от точки d и найдите точку e. Согните свободный конец в точке e так, чтобы образовался угол около 100-105° (Рисунок 3E).
ПРИМЕЧАНИЕ: У 6-8-недельных мышей C57, которых мы использовали, было около 20 г. Расстояние в 5 мм могло не только заклинивать верхние и нижние челюсти мышей, не двигаясь, но и не давило бы на кожу мышей и не вызывало бы дискомфорта. Если используются мыши других видов или возрастов, пожалуйста, отрегулируйте длину частей c-d и i-h в соответствии с фактической ситуацией (рис. 3E, G). - Согните дополнительный депрессор языка для нижней челюсти (Рисунок 3G, j-i-h-g).
- Повторите шаги гибки детали a-b-c на детали l-k-j. Зажмите детали i-k и k-j одновременно и согните свободный конец в точке j, чтобы он стал вертикальным по отношению к плоскости i-k-j. В точке зажима i, которая находится в 5 мм от точки j, согните свободный конец так, чтобы он был параллельен плоскости i-k-j и c-d части (Рисунок 3H).
- Оставьте 5 мм длины от точки i, в точке h согните арку вертикально к i-h части и параллельно плоскости j-i-h. Найдите точку g на расстоянии 5 мм от точки h. Зажмите плоскость j-i-h-g и согните свободный конец симметрично k-j части. Тогда свободный конец после точки f должен быть симметричен точке e-свободный конец (рисунок 3H).
- Наденьте резиновые колпачки на свободный конец (рисунок 3F).
3. Иммобилизация
- Зафиксируйте мышь лежа на фиксирующей пластине конечностями, закрепленными кожной лентой. Сожмите свободные концы рта-кляпа большим и указательным пальцами.
- Зафиксируйте передние резцы мыши в трапециевидной бороздке двух рук. Убедитесь, что рука с депрессором языка предназначена для нижней челюсти. Отрегулируйте кляп для рта, чтобы убедиться, что язык мыши обездвижен, но не ишемичен.
4. Оценка зубов
- Убедитесь, что первый моляр верхней челюсти для операции не должен иметь кариеса, травм и одонтогенеза. Убедитесь, что на окружающей десне нет покраснения, отека или свища. Убедитесь, что противоположные зубы здоровы и готовы выступать в качестве здоровой контрольной группы.
5. Воздействие пульпы
- Используйте зубной бор для сверления на окклюзионной стороне первого моляра верхней челюсти со скоростью 20 000 об/мин. Следите за тем, чтобы эмаль была удалена. Проводите операцию с помощью стоматологического наконечника только в неглубоком слое дентина, чтобы предотвратить чрезмерную термическую стимуляцию тканей пульпы зуба12.
- В то же время предотвратите перегрев, используя шприц, чтобы капать обычный физиологический раствор на зуб каждые 3 минуты во время операции.
- Поместите напильник 8# или 10# C+ на самое нижнее место просверленной ямы и проткните последний дентин, чтобы обнажить камеру пульпы. Это будет явное ощущение падения, когда будет тщательно удален местный дентин. Не копайте слишком глубоко, иначе ткань пульпы зуба может быть выведена из пульповой камеры.
- Очистите фрагменты вокруг зуба. Снимите кляп; Операция завершена. Используйте противоположный первый моляр верхней челюсти в качестве контрольного без операции.
6. Послеоперационный уход
- После операции введите карпрофен (5 мг/кг) подкожно и поместите мышь на хемотермическую грелку в положении лежа до восстановления после анестезии. Накормите мышей и обеспечьте питьевой водой. Процесс восстановления должен находиться под контролем. Никакие другие животные не должны находиться в той же камере до тех пор, пока мышь полностью не выздоровеет.
7. Сбор и хранение проб
- Усыпить мышь с вывихом шейки матки под глубокой анестезией через 24 ч после операции или в любой другой момент времени согласно эксперименту9. Разрежьте скелетные мышцы, прикрепленные к верхней челюсти и скуловой кости, офтальмологическими ножницами. Удалите скелет, лобную кость и мягкие ткани и удалите гнатостегит пластинки с верхнечелюстными коренными зубами.
ПРИМЕЧАНИЕ: Согласно He et al., рекомендуется собирать образец пульпита менее чем через 72 ч после операции, чтобы избежать обширного некрозав ткани пульпы зуба. - Сагиттально разделите гнатостегит пополам и храните ткань в 4% параформальдегиде в PBS, pH 7,4, при 4 °C в течение 24 часов.
8. Гистологический анализ
- Промойте ткани фосфатно-солевым буфером (PBS) и декальцифицируйте их в ежедневно меняемом растворе декальцинации 5% ЭДТА и 4% сахарозы в PBS, pH 7,4, при 4 °C в течение 2-4 недель10.
- Заделайте 1/2 гнатостегит в парафин и убедитесь, что сагиттальное лицо без зубов находится на дне тканевых кассет.
- Парафиновый блок нарезать на ломтики толщиной 5 мкм с помощью парафинового микротома. Отрегулируйте угол парафинового блока в соответствии с проксимальным, дистальным, верхним, а также нижним соотношением, наблюдаемым под микроскопом, чтобы обеспечить возможность разрезания всей пульпы коронки и перфорации первого моляра.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Описанная выше процедура была выполнена на первом моляре правой верхней челюсти у 3 мышей C57BL/6 в возрасте 6-8 недель, при этом первые моляры левой верхней челюсти были сохранены в качестве контроля. Для демонстрации были использованы результаты гистологии и иммунофлюоресценции холостого контроля, образцы пульпита через 12 ч и пульпита через 24 ч.
В соответствии с протоколом КТ-анализа от Goldman et al.15, воздействие пульпы было подтверждено с помощью микро-КТ и реко...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Являясь единственной мягкой тканью в зубах, пульпа зуба выполняет решающую роль в поддержании биологической активности зуба, но при этом остается высокочувствительной. Сохранение этой жизненно важной пульпы стало предпочтительным начальным подходом в современных эндодонтических методах лечения, что требует всестороннего понимания воспалительных механизмов пульпы зуба16. Пространственно-временные колебания воспалительного микроокружения и взаимодействия между резидентными типами клеток при пульпите...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Благодарности
Это исследование было профинансировано грантами Национального фонда естественных наук Китая U21A20368 (L. Y.), 82101000 (H. W.) и 82100982 (F. L.), а также Сычуаньской научно-технической программой 2023NSFSC1499 (H. W.). Все исходные данные и изображения включены в эту статью.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Animal | |||
| C57/B6J мыши | Gempharmatech Experimental Animals Company | C57/B6J | Для установления воздействия пульпы |
| Equipment | |||
| 1 мл шприц | Chengdu Xinjin Shifeng Medical Apparatus & Instruments Co. LTD. | SB1-074(IV) | Применять при введении наркотиков. |
| 8# C+ файл | Readysteel | 0010047 | Применить при обнажении крыши пульповой камеры. |
| Раствор смеси для анестезии | 10% кетамина гидрохлорид + 5% ксилазин + 85% стерильный изотонический раствор. | ||
| DAPI Окрашивающий раствор | Beyotime | C1005 | Применяется при иммунофлуоресцентном окрашивании для контрокрашивания ядер. |
| Стоматологический высокоскоростной стоматологический наконечник | Jing yuan технология электронной коммерции | WJ-422 | Применяется при воздействии пульпы. |
| Тяжелый кусачок для проволоки | Jirui Medical Instrument Co., Ltd. | нет | Применяйте индуговую резку. |
| Набор для окрашивания гематоксилином и эозином | Biosharp | BL700B | для гистологического анализа предметных стекол. |
| Антитело к IL-6 | Novus | NBP2-89149 | Применяется при иммунофлуоресцентном окрашивании для выявления воспаления пульпы зуба. |
| Кетамин (Кетамина гидрохлорид) | Vet One, Бойсе, Айдахо, США | C3N VT1 | 100 мг/кг, IP. Применять при обезболивании. |
| Кран медицинский | 3М | 1530 | Применять при иммобилизации мышей. |
| Ортодонтическая дуга с проволокой | Шанхай Вэй Жун Медикал Аппарат Ко. Лтд. | K417 | Диаметр 8&микро; |
| m Круглый зубной бор (0,6 мм) | Shofu global | 072208 | Применяется при удалении эмали и неглубокого слоя дентина. |
| Молодые клещи для изгиба петель | Jirui Medical Instrument Co., Ltd. | нет | Применяется при изгибе дуги. |
Ссылки
- Kleinert, A., Kleinert, L., Ozimirska, M., Chałas, R. Endodontium - together or separately. Folia Morphol. 77 (3), 409-415 (2018).
- Dhillon, H., Kaushik, M., Sharma, R. Regenerative endodontics-Creating new horizons. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 104 (4), 676-685 (2016).
- Prati, C., Pirani, C., Zamparini, F., Gatto, M. R., Gandolfi, M. G. A 20-year historical prospective cohort study of root canal treatments. A Multilevel analysis. Int Endod J. 51 (9), 955-968 (2018).
- Su, Y., Wang, C., Ye, L. Healing rate and post-obturation pain of single- versus multiple-visit endodontic treatment for infected root canals: a systematic review. J Endod. 37 (2), 125-132 (2011).
- Murray, P. E., Garcia-Godoy, F., Hargreaves, K. M. Regenerative endodontics: a review of current status and a call for action. J Endod. 33 (4), 377-390 (2007).
- Arora, S., et al. Potential application of immunotherapy for modulation of pulp inflammation: opportunities for vital pulp treatment. Int Endod J. 54 (8), 1263-1274 (2021).
- Eramo, S., Natali, A., Pinna, R., Milia, E. Dental pulp regeneration via cell homing. Int Endod J. 51 (4), 405-419 (2018).
- Hasan, A., et al. Expression of Toll-like receptor 2, Dectin-1, and Osteopontin in murine model of pulpitis. Clin Oral Investig. 27 (3), 1177-1192 (2023).
- Wang, Y., et al. DDIT3 aggravates pulpitis by modulating M1 polarization through EGR1 in macrophages. Int Immunopharmacol. 120, 110328(2023).
- Richert, R., et al. A critical analysis of research methods and experimental models to study pulpitis. Int Endod J. 55 (Suppl 1), 14-36 (2022).
- Huang, X. F., Zhao, Y. B., Zhang, F. M., Han, P. Y. Comparative study of gene expression during tooth eruption and orthodontic tooth movement in mice. Oral Dis. 15 (8), 573-579 (2009).
- Kwon, S. J., et al. Thermal irritation of teeth during dental treatment procedures. Restor Dent Endod. 38 (3), 105-112 (2013).
- He, Y., et al. Pulpal tissue inflammatory reactions after experimental pulpal exposure in mice. J Endod. 43 (1), 90-95 (2017).
- Karrar, R. N., et al. Molecular biomarkers for objective assessment of symptomatic pulpitis: A systematic review and meta-analysis. Int Endod J. 56 (10), 1160-1177 (2023).
- Goldman, E., Reich, E., Abramovitz, I., Klutstein, M. Inducing apical periodontitis in mice. J Vis Exp. (150), e59521(2019).
- Duncan, H. F. Present status and future directions-Vital pulp treatment and pulp preservation strategies. Int Endod J. 55 (Suppl 3), 497-511 (2022).
- Shi, X., Li, Z., He, Y., Jiang, Q., Yang, X. Effect of different dental burs for experimental induction of pulpitis in mice. Arch Oral Biol. 83, 252-257 (2017).
- Du, W., et al. Indigenous microbiota protects development of medication-related osteonecrosis induced by periapical disease in mice. Int J Oral Sci. 14 (1), 16(2022).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
