Визуализация всего крепления для визуализации и количественной оценки структуры периферического хрусталика, морфологии и организации клеток

Summary

В представленных протоколах описаны новые методы визуализации с помощью всей монтировки для визуализации периферических структур в окулярном хрусталике с методами количественной оценки изображения. Эти протоколы могут быть использованы в исследованиях, чтобы лучше понять взаимосвязь между микромасштабными структурами хрусталика и развитием/функцией хрусталика.

Abstract

Окулярная линза представляет собой прозрачную гибкую ткань, которая изменяет свою форму, чтобы фокусировать свет с разных расстояний на сетчатке. За исключением базальной мембраны, окружающей орган, называемой капсулой, хрусталик полностью клеточный, состоящий из монослоя эпителиальных клеток в переднем полушарии и объемной массы клеток волокон хрусталика. На протяжении всей жизни эпителиальные клетки пролиферируют в зародышевой зоне на экваторе хрусталика, а экваториальные эпителиальные клетки мигрируют, удлиняются и дифференцируются во вновь образованные волоконные клетки. Экваториальные эпителиальные клетки существенно изменяют морфологию от хаотично упакованных булыжных клеток к выровненным шестиугольным клеткам, образующим меридиональные ряды. Вновь сформированные клетки волокон хрусталика сохраняют гексагональную клеточную форму и удлиняются к переднему и заднему полюсам, образуя новую оболочку клеток, которые накладываются на предыдущие поколения волокон. Мало что известно о механизмах, которые управляют замечательным морфогенезом эпителиальных клеток хрусталика в волоконные клетки. Для лучшего понимания структуры, развития и функционирования хрусталика были разработаны новые протоколы визуализации периферических структур с использованием целых креплений окулярных линз. Здесь показаны методы количественной оценки толщины капсулы, площади эпителиальных клеток, площади и формы ядра клетки, меридионального порядка и упаковки клеток, а также ширины клеток волокна. Эти измерения необходимы для выяснения клеточных изменений, которые происходят во время роста хрусталика на протяжении всей жизни, и понимания изменений, которые происходят с возрастом или патологией.

Introduction

Окулярная линза представляет собой гибкую, прозрачную ткань, расположенную в передней части глаза, которая функционирует для точной фокусировки света на сетчатке. Способность объектива функционировать можно объяснить, в частности, его сложной архитектурой и организацией 1,2,3,4,5,6. Ткань хрусталика окружает капсула, базальная мембрана, необходимая для поддержания структуры хрусталика и биомеханических свойств ^7,8,9. Сам хрусталик полностью клеточный, состоящий из двух типов клеток: эпителиальных и волоконных. Эпителиальный слой состоит из монослоя кубовидных клеток, покрывающих переднюю полусферу хрусталика¹⁰. На протяжении всей жизни эпителиальные клетки размножаются и мигрируют вдоль капсулы хрусталика к экватору хрусталика. Клетки переднего эпителия находятся в состоянии покоя и имеют булыжный разрез в поперечном сечении, а вблизи хрусталика эпителиальные клетки пролиферируют и начинают процесс дифференцировки в новые волоконные клетки^11,12. Клетки экваториального эпителия превращаются из хаотично упакованных клеток в организованные меридиональные ряды с клетками шестиугольной формы. Гексагональная форма клеток сохраняется на базальной стороне этих дифференцирующих клеток, в то время как апикальная сторона сужается и закрепляется на точке опоры хрусталика или модиоле 4,13,14,15. По мере того, как экваториальные эпителиальные клетки начинают удлиняться во вновь образованные волоконные клетки, апикальные кончики клеток мигрируют вдоль апикальной поверхности передних эпителиальных клеток к переднему полюсу, в то время как базальные кончики перемещаются вдоль капсулы хрусталика к заднему полюсу. Новые поколения волоконных клеток накладываются на предыдущие, создавая сферические оболочки волокон. В процессе удлинения и созревания клеток волокна существенно изменяют свою морфологию 11,12,16. Эти волокнистые клетки составляют основную массу хрусталика 11,12,16,17,18.

Молекулярные механизмы, способствующие установлению сложных микроструктур хрусталика, морфологии клеток и уникальной клеточной организации, до конца не изучены. Кроме того, вклад капсулы хрусталика и клеточной структуры в общую функцию хрусталика (прозрачность, изменение формы хрусталика) неясен. Тем не менее, эти взаимосвязи выясняются с помощью новой методологии визуализации и количественной оценки структурных и клеточных особенностей хрусталика 2,4,19,20,21,22. Были разработаны новые протоколы визуализации целых хрусталиков, которые позволяют визуализировать капсулу хрусталика, эпителиальные клетки и клетки периферических волокон с высоким пространственным разрешением. Это включает в себя методологию количественного определения толщины капсулы, размера клеток, размера и округлости ядра клетки, меридионального порядка ряда, упаковки клеток волокна и ширины ячеек волокна. Эти методы визуализации и количественной оценки изображений позволяют проводить углубленное морфометрическое исследование и имеют преимущества перед другими методами визуализации (визуализация плоских креплений или срезов тканей) за счет сохранения общей 3D-структуры ткани. Эти методы позволили проверить новые гипотезы и позволят продолжить прогресс в понимании развития и функционирования клеток хрусталика.

Для следующих экспериментов мы использовали мышей дикого типа и мышей Rosa26-tdTomato в тандеме димер-томат (B6.129(Cg)-Gt(ROSA) (tdTomato)²³ (Jackson Laboratories) на фоне C57BL/6J в возрасте от 6 до 10 недель обоего пола. Мыши tdTomato позволяют визуализировать клеточные плазматические мембраны в живых хрусталиках через экспрессию белка tdTomato, слитого с N-концевыми аминокислотами 8 мутировавшего белка MARKS, который нацелен на плазматическую мембрану через N-концевую миристилизацию и внутренние сайты цистеин-пальмитоилирования²³. Мы также используем мышей^{NMIIA E1841K/E1841K 24} , полученных от доктора Роберта Адельштейна (Национальный институт сердца, легких и крови, Национальный институт здоровья, Бетесда, штат Мэриленд). Как описано^ранее, мышей NMIIA^{E1841K/E1841K} на фоне FvBN/129SvEv/C57Bl6, у которых отсутствует белок промежуточной нити CP49 (поддерживает морфологию зрелых волоконных клеток и биомеханику всего хрусталика), скрещивают с мышами дикого типа C57BL6/J. Мы провели скрининг потомства на наличие аллеля CP49 дикого типа.

Конфокальную визуализацию проводили на лазерном сканирующем конфокальном флуоресцентном микроскопе с увеличением 20x (NA = 0,8, рабочее расстояние = 0,55 мм, 1x увеличение), 40x (NA = 1,3 масляный объектив, рабочее расстояние = 0,2 мм, 1x увеличение) или 63x (NA = 1,4 масляный объектив, рабочее расстояние = 0,19 мм, 1x увеличение). Все изображения были получены с использованием размера точечного отверстия, который является определяющим толщину оптического сечения, с точностью до 1 единицы Эйри (результирующие оптические толщины указаны в подписях на рисунках). Изображения были обработаны на Zen Software. Изображения были экспортированы в формат .tif, а затем импортированы в программное обеспечение FIJI ImageJ (imageJ.net).

Protocol

Мыши содержатся в помещении для животных Университета штата Делавэр, где содержатся в среде, свободной от патогенов. Все процедуры для животных, включая эвтаназию путем ингаляции_CO2 , проводились в соответствии с протоколами, утвержденными Комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Университета штата Делавэр.

1. Подготовка всего байонета объектива и визуализация

1. Фиксация линз для съемки всего байонета
   1. После эвтаназии энуклейте глаза и препарируйте линзы, как описано ранее²⁵. После вскрытия линзы немедленно переносят в свежий 1x фосфатно-солевой буфер (PBS; 1,1 мМ KH₂PO₄, 155 мМ, NaCl, 3,0 мМ Na₂HPO_{4-7H 2}O; pH 7,4) при комнатной температуре.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Морфология клеток может быть изменена, если линзы хранятся в PBS в течение длительного периода времени, поэтому рекомендуется немедленно исправить их в течение ~10 минут после вскрытия.
   2. Для получения полной визуализации передней части хрусталика зафиксируйте целые линзы, погрузив 0,5 мл свежеприготовленного 4% параформальдегида (PFA) в 1x PBS в микроцентрифужной пробирке при комнатной температуре. Через 30 минут вымойте линзы 3 раза (5 минут на стирку) 1 PBS. Перейдите к шагу 1.2 или храните в 1x PBS при температуре 4 °C. Несъемные линзы могут храниться до 5 дней.
   3. Для получения изображений экваториальной области хрусталика целиком фиксируйте линзы, погружая их в 0,5 мл свежеприготовленного 4% PFA в 1x PBS в пробирке микроцентрифуги при комнатной температуре. Через 1 ч промыть линзы 3 раза (5 минут на стирку) с помощью 1x PBS. Перейдите к шагу 1.3 или храните в 1x PBS при температуре 4 °C. Несъемные линзы могут храниться до 5 дней.
2. Полная фиксация передней области хрусталика (фиксированная или живая)
   1. Для получения изображений с фиксированным креплением объективов перейдите к шагу 1.2.3.
   2. Для визуализации живых линз с полным креплением перенесите линзы в лунку 48-луночного планшета, содержащего 1 мл Medium 199 (без фенолового красного), содержащего 1% антибиотика/антимикотика. Инкубируйте линзы при 37 °C и 5%_CO2 до получения изображения. Перед визуализацией инкубируйте линзы в растворе, содержащем меченый флуоресцентными лампами агглютинин зародышей пшеницы (WGA-640, 1:500) и Hoechst 33342 (1:500) в среде 199 в течение не менее 10 минут. Перейдите к шагу 1.5.
   3. Для окрашивания капсулы хрусталика, F-актина и ядер фиксированных линз помещают линзы в раствор объемом 500 мкл, содержащий WGA-640 (1:500), родамин-фаллоидин (1:50) и Hoechst 33342 (1:500) в буфере пермеабилизации/блокировки (1x PBS, содержащий 0,3% тритона, 0,3% бычьего сывороточного альбумина (фракция V) и 3% козьей сыворотки) в микроцентрифужной пробирке. Окрашивайте линзы при температуре 4 °C на ночь.
   4. После ночной инкубации промыть линзы 3 раза (5 минут на стирку) 1 мл 1x PBS. Переходим к объективам для визуализации.
   5. Чтобы стабилизировать неподвижный хрусталик для конфокальной визуализации, создайте иммобилизационные отверстия хрусталика в агарозе на чашке для визуализации,^{как описано} ранее (рис. 1).
      1. Нагрейте и осторожно перемешайте 2% агарозу с PBS с помощью микроволновой печи до тех пор, пока раствор не станет жидким. Пипетку 250 мкл сжиженной 2% агарозы насыпают в чашку со стеклянным дном (Рисунок 1А) и расплющивают агарозу поперек чашки с помощью гибкого пластикового покровного стекла (Рисунок 1Б). После того, как агароза остынет и полностью затвердеет, удалите покровное стекло с помощью щипцов с тонким наконечником (Рисунок 1C) и используйте 3-миллиметровый биопсийный пуансон, чтобы создать отверстие в агарозе в центре чашки (Рисунок 1D).
      2. Удалите излишки агарозы с помощью деликатной салфетки (Рисунок 1E). Храните агарозную плесень гидратированным с помощью 1x PBS и выдерживайте при температуре 4 °C до использования. Агарозные формы успешно хранятся до 1 недели.
   6. Используя щипцы для эмбрионов, осторожно перенесите живую или неподвижную линзу в углубление в агарозе (Рисунок 1F), содержащее ~2 мл 1x PBS (фиксированная линза) или Medium 199 без фенола красного цвета 199 (живая линза), а затем поместите чашку на инвертированный столик микроскопа. Чтобы убедиться в том, что хрусталик расположен передней областью, обращенной к объекту, визуализируйте окрашивание ядер. Если ядра не наблюдаются, задняя область может быть обращена к цели.
   7. Чтобы перевернуть хрусталик, используйте изогнутые щипцы и осторожно поверните линзу на ~180° так, чтобы передняя область была обращена к объективу. Получение изображений с помощью конфокального микроскопа.
   8. Для визуализации капсул хрусталика используйте объектив с 40-кратным увеличением и шагом 0,3 мкм. Получают первое изображение до поверхности капсулы хрусталика (на что указывает окрашивание WGA), а последнее изображение — после апикальной поверхности эпителиальных клеток. Чтобы визуализировать эпителиальные клетки, получите изображения z-стека с помощью 63-кратного объектива с шагом 0,3 мкм для визуализации эпителиальных клеток хрусталика.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти параметры микроскопа позволяют адекватно реконструировать трехмерные (3D) изображения, что необходимо для количественной оценки толщины капсулы или площади эпителиальных клеток. Кроме того, можно визуализировать швы в хрусталиках tdTomato с живым хрусталиком путем визуализации за пределами монослоя эпителиальных клеток, как описано ранее⁴.
3. Окрашивание экваториального эпителия и клеток хрусталика
   1. Поместите неподвижные линзы в 0,5 мл раствора родамина-фаллоидина (1:300), WGA-640 (1:250) и Hoechst 33342 (1:500) в раствор для пермеабилизации/блокировки (3% БСА, 3% козьей сыворотки и 0,3% тритона) в микроцентрифужной пробирке. Выдерживать при температуре 4 °C в течение ночи.
   2. После ночной инкубации промыть линзы 3 раза по 1 мл 1 раз PBS (5 минут на стирку).
   3. Создают иммобилизацию линз агарозными клиньями, как описано ранее ^4,10.
      1. Вкратце, создайте дольки агарозы в чашках со стеклянным дном (FD35-100, WPI), влив в чашки ~5-6 мл расплавленной 2%-ной агарозы в 1x PBS (Рисунок 2A). Как только агароза затвердеет (рис. 2B), создайте треугольную выемку с острым лезвием (рис. 2C). Выньте дольку агарозы и поместите 1 мл 1x PBS в чашку с агарозой (Рисунок 2D).
      2. Аспирируйте все остатки агарозы, которые могут остаться после разрезания агарозы. Для каждой чашки можно создать несколько клиньев для линз разных размеров (не показаны). Для хранения агарозной формы поместите 1 мл 1x PBS на форму для агарозы и храните при температуре 4 °C. Клинья могут храниться до 1 недели.
   4. С помощью изогнутого пинцета поместите линзу в агарозный клин, содержащий 1 мл 1x PBS, и отрегулируйте так, чтобы экваториальная область линзы была обращена вниз на стекло микроскопа над конфокальным объективом (рис. 2E-F). Чтобы убедиться в том, что экваториальная область находится в фокусе, визуализируйте ядра и убедитесь, что ядра выровнены по рядам на экваторе. Экваториальные эпителиальные клетки также могут быть идентифицированы по их неправильной упаковке и форме. Кроме того, клетки меридионального ряда точно выровнены и имеют шестиугольную форму, на что указывает окрашивание F-актином на клеточных мембранах.
   5. Если ядра в поле зрения расположены хаотично, то передняя сторона хрусталика обращена к объективу. Если ядра не наблюдаются, то, скорее всего, задняя сторона хрусталика обращена к объекту. Если хрусталик не находится на экваторе, переориентируйте линзу и используйте изогнутый пинцет для вращения хрусталика до тех пор, пока не будут наблюдаться точно выровненные ядра на экваторе хрусталика.
   6. Визуализируйте клетки экваториального эпителия и волокон хрусталика с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа (объектив 20x, NA = 0,8, размер шага 0,5 мкм и/или 40-кратный масляный объектив, NA = 1,3, размер шага 0,4 мкм). Поверните изображения перед сбором z-стека, в котором экваториальные эпителиальные клетки находятся сверху, а затем меридиональный ряд и волоконные клетки прямо внизу.

2. Методология анализа изображений

1. Измерение толщины капсулы объектива
   1. Используя изображения z-stack, полученные с помощью 40-кратного объектива (с шагом 0,3 мкм) из живых линз tdTomato, помеченных WGA, или фиксированных линз, помеченных WGA и ро-фаллоидином, получить оптическую 2D-проекцию в XZ-виде 3D-реконструкции и сохранить в .tif формате. Обработка изображений с помощью программного обеспечения Zen.
   2. Откройте изображения фрагментов XZ (.tif) в программном обеспечении FIJI ImageJ.
   3. Для измерения толщины капсулы объектива используйте функцию прямой линии (изображена на рисунке 3A, B). Установите ширину линии равной 50 пикселям, выбрав «Редактировать > параметры» > «Ширина линии». Опытным путем было установлено, что эта ширина линии обеспечивает высокое отношение сигнал/шум с настройками микроскопа. Оптимальная ширина линии может отличаться на других микроскопах/настройках микроскопа или при использовании линз других видов. Затем проведите линию от верхней поверхности капсулы до базальной области эпителиальных клеток.
   4. Сохраните строку в качестве области интереса, нажав Ctrl + T.
   5. Разделите каналы на вкладки для изображений, цветов и разделенных каналов.
   6. Измерьте интенсивность вдоль линии для канала капсулы, нажав Ctrl+K.
   7. В электронной таблице постройте график значений интенсивности в зависимости от расстояния и определите пики интенсивности для капсулы и F-актина, которые представляют собой поверхность капсулы и базальную область эпителиальных клеток соответственно. По оси x — расстояние до линии.
   8. Затем рассчитайте толщину капсулы, определив расстояние между пиками интенсивности флуоресценции капсулы и эпителия (рис. 3C, D).
2. Анализ площади ячеек
   1. Используя изображения z-стека, полученные с помощью объектива с 63-кратным увеличением (NA = 1,4; размер шага 0,3 мкм) на живых линзах tdTomato или фиксированных линзах, помеченных фаллоидином, проанализируйте срез вида XY из конфокального изображения z-стека, соответствующий тому, где средняя (латеральная) область эпителиальных клеток находится в фокусе. Обратите внимание, что боковые мембраны видны с помощью красителя tdTomato или с помощью визуализации фаллоидина, который присутствует на боковых клеточных мембранах.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за кривизны объектива (как видно в виде XZ; 4A-C), не все эпителиальные клетки будут в фокусе на изображении. Средняя область эпителия соответствует области, где в фокусе находятся как боковые мембраны клеток (рис. 4D-E), так и ядра (рис. 4G-I).
   2. Экспортируйте изображение в виде .tif и откройте его в FIJI ImageJ.
   3. Чтобы задать масштаб в FIJI ImageJ для анализа, используйте инструмент «Линия», чтобы создать линию длиной масштабной линейки из конфокального изображения.
   4. Запишите длину линии в пикселях и длину масштабной линейки. Перейдите в раздел Анализ в меню панели инструментов и выберите Задать масштаб. Введите количество пикселей, равное длине линии в поле Расстояние в пикселях, а в поле Известное расстояние введите известную длину масштабной линейки.
   5. Используя окрашивание tdTomato или родамин-фаллоидин в качестве индикации границ клеток, вручную обведите популяцию клеток, которые находятся в фокусе на изображении, с помощью многоугольного инструмента. Отслеживайте только те клетки, где видны боковые мембраны (рис. 4E), и избегайте трассировки частично видимых клеток (т. е. по краям изображений). Сохраните ROI, нажав Ctrl+T. Перейдите в раздел Редактировать в меню панели инструментов и выберите Очистить снаружи. Теперь измерьте общую площадь ячейки (ROI), нажав Ctrl + M в FIJI ImageJ.
   6. Рассчитайте среднюю площадь ячейки, разделив площадь ROI на общее количество ячеек. Простой способ определить количество клеток – подсчитать количество ядер. Перейдите в канал ядер (синий). В меню ROI выберите сохраненную структуру ROI ячеек (рис. 4G). Очистите за пределами ROI, перейдя в Edit и щелкнув Clear outside (Очистить снаружи ) (рисунок 4H). С помощью инструмента «Многоточечный» подсчитайте ядра, щелкнув по отдельным ядрам.
3. Анализ площади и формы ядра клетки
   1. Для анализа площади и формы ядер проанализируйте оптический срез в плоскости XY по конфокальному изображению z-стека, соответствующему тому, где средняя (латеральная) область эпителиальных клеток tdTomato находится в фокусе. Проанализируйте срез z-стека по конфокальному изображению, где ядерная область является наибольшей (рис. 5A); Он представляет собой среднюю часть ядер.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обратите внимание, что из-за кривизны хрусталика не все ядра будут в фокусе, как это видно на изображении XZ (Рисунок 4G и Рисунок 5A).
   2. Выберите субпопуляцию ядер, которые находятся в фокусе, и сохраните ROI.
   3. Используйте функцию «Очистить снаружи ». В пределах ROI с помощью инструмента «Произвольное выделение» (четвертая кнопка меню слева) аккуратно обведите границы ядер (рис. 5B). Сохраните каждую ядерную трассу в окне ROI, нажав Ctrl+T. Намечайте ядра только там, где видны целые ядра, и ядра не соприкасаются друг с другом.
   4. После того, как все ядра будут очертаны, измерьте площадь и форму ядра отдельных клеток (т.е. круглость), нажав Ctrl+M.
   5. Скопируйте и вставьте данные в электронную таблицу и рассчитайте среднюю площадь ядра и циркулярность (рис. 5C).
4. Меридиональное рядное эпителиальное уплотнение
   1. Чтобы измерить меридиональное расстройство ряда, получите изображения с помощью объектива с 20-кратным увеличением (шаг 0,5 мкм).
   2. Определите точку опоры хрусталика/модиол на изображениях. Точка опоры - это область, где апикальные кончики удлиненных эпителиальных клеток сужаются, образуя точку опоры во время начальной дифференцировки и удлинения волоконных клеток на экваторе. Определите точку опоры на основе яркой интенсивности F-актина (обозначена стрелкой на изображении XZ на рисунке 6A; обозначена красной пунктирной линией на рисунке 6B) и изменении клеточной организации в одном оптическом сечении на снимке XY.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Кроме того, F-актиновое окрашивание базальной и апикальной областей эпителиальных клеток видно выше точки опоры, в то время как только базальная область удлиняющихся клеток видна ниже точки опоры (Рисунок 6А). Эпителиальные клетки над линией опоры упакованы неравномерно и имеют тенденцию образовывать розетки, в то время как волокнистые клетки ниже точки опоры расположены параллельными рядами, на что указывает яркое окрашивание F-актином на мембране (рис. 6B).
   3. После того, как точка опоры идентифицирована у 2-месячных мышей, выберите один оптический участок ~4,5-5 мкм, периферический по отношению к точке опоры (по направлению к капсуле хрусталика) в плоскости XY. Это расстояние выбрано на основе наблюдения, что все ядра клеток меридионального ряда у 2-месячных мышей находятся в фокусе, когда они находятся на периферии ~5 мкм от точки опоры. Сохраните одну оптическую секцию (.tif). Откройте изображение на FIJI.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот анализ проводился только на 2-месячных мышах, поэтому нельзя сделать вывод, меняется ли это расстояние с возрастом.
   4. Перед выполнением анализа изображений установите масштаб в мкм в ImageJ, выполнив шаг 2.2.2.
   5. Вручную очертите всю меридиональную область ряда с помощью инструмента произвольной линии (область интереса/ROI), определив ядерное выравнивание, как показано на рисунке 7A. Сохраните ROI, нажав Ctrl+T. Перейдите в раздел Редактировать в меню панели инструментов и выберите Очистить снаружи. Измерьте общую площадь ячейки (ROI), нажав Ctrl + M в FIJI ImageJ.
   6. Определите все области беспорядка, на которые указывает окрашивание F-актином, обведя контуром с помощью инструмента «Линия от руки» в FIJI ImageJ. Критерии неупорядоченных областей включают ветвление рядов, неравномерную укладку и смещение рядов (рис. 7B), как показано ранее²⁰.
   7. Измерьте очерченную неупорядоченную область, нажав Ctrl + M в FIJI ImageJ. Просуммируйте общую неупорядоченную площадь в электронной таблице.
   8. Разделите общую неупорядоченную площадь на площадь ROI, затем умножьте на 100, чтобы получить процент неупорядоченной области. Если нарушения не наблюдается, установите значение 0% для неупорядоченной области.
5. Меридиональное количество строк соседних ячеек
   1. Для измерения количества соседних клеток используйте изображения, окрашенные F-актином, полученные с помощью 40-кратного масляного объектива (шаг 0,4 мкм).
   2. Определите оптический срез (плоскость XY) в базальной области клеток меридионального ряда внутрь от капсулы хрусталика, где F-актин обогащен по всему периметру клеток меридионального ряда, все клетки меридионального ряда находятся в фокусе и находятся в одной плоскости.
   3. Подсчитайте количество смежных ячеек в каждой меридиональной ячейке ряда (рис. 8). Измерьте средний процент ячеек с шестью смежными ячейками в электронной таблице.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Определите количество соседних ячеек с помощью 20-кратной цели. Тем не менее, наблюдать шестиугольную форму значительно проще с 40-кратным объективом.
6. Анализ изображений ячеек экваториальных волокон
   1. Сделайте конфокальные изображения линз, окрашенных родамином и фаллоидином, с помощью объектива 20x (шаг 0,5 мкм).
   2. Определите точку опоры, как указано в шаге 2.4.2. После того, как точка опоры определена, выберите один оптический участок. В целях стандартизации и сравнения линз количественно определите ширину ячейки волокна ~10 мкм внутрь от точки опоры в плоскости XY (рис. 9A).
   3. Экспорт необработанных изображений в FIJI ImageJ. В FIJI ImageJ нарисуйте линию (обычно длиной ~300-400 мкм) через несколько соседних ячеек волокна, чтобы измерить расстояние между пиками, окрашенными F-актином (анализ линейного сканирования; Рисунок 9А; розовая линия).
   4. Получите интенсивность флуоресценции на расстоянии линейной развертки в FIJI, нажав Ctrl+K. Затем экспортируйте данные в электронную таблицу для вычисления межпикового расстояния (пример показан на рисунке 9A-B). Это соответствует ширине ячеек волокна.

Results

Передняя капсула хрусталика, область эпителиальных клеток и ядерная область
Чтобы проанализировать толщину капсулы хрусталика, мы окрашивали капсулы хрусталика в живые или фиксированные линзы с помощью WGA. Мы идентифицировали эпителиальные клетки хрусталика путем маркировки мембран tdTomato в живых хрусталиках (рис. 2A) или с помощью окрашивания родамина-фаллоидина на F-актин на клеточных мембранах в фиксированных хрусталиках (рис. 2B). В ортогональной (XZ) проекции окрашивание на WGA и tdTomato/родамин-фаллоидин позволяет проводить анализ интенсивности флуоресценции от пика до пика. Основной пик в канале WGA указывает на капсулярную поверхность, тогда как основной пик в канале tdTomato/родамин-фаллоидин указывает на базальную область эпителиальных клеток. Вычислив расстояние между этими пиками, мы можем получить толщину капсулы. Анализ линейного сканирования показывает, что капсулы из 9-недельного живого хрусталика мышей имели толщину 11,2 мкм, а капсулы из 9-недельного объектива мышей с фиксированным хрусталиком имели толщину 12,5 мкм. Эти наблюдаемые толщины капсул являются репрезентативными для предыдущих данных ^2,4.

Полная визуализация меченых tdTomato трансгенных мышиных линз (или линз, окрашенных родамином-фаллоидином; не показана) позволяет визуализировать морфологию эпителиальных клеток в режиме реального времени. Ортогональная проекция (XZ) обеспечивает вид эпителиальной клетки хрусталика сбоку, в то время как плоская проекция (XY) в латеральных областях позволяет визуализировать эпителиальную полигональную форму. В здоровых хрусталиках мы не наблюдаем никаких промежутков между клетками. Мы можем вычислить среднюю площадь ячейки, отследив популяцию ячеек на изображении и разделив площадь на количество ячеек в ROI. Количество клеток определяется путем подсчета количества ядер, окрашенных по методу Хёхста, в заданном ROI. Анализ показал, что средняя площадь клеток составляет 260^мкм2, что соответствует предыдущим исследованиям ^2,4.

Окрашивание ядер по Гехсту также позволяет исследовать ядерную морфометрию эпителиальных клеток хрусталика в эпителиальных клетках. Ортогональные проекции (XZ) позволяют видеть ядра сбоку. Плоский (XY) вид демонстрирует круглую/эллипсоидную форму ядер. Трассировка ядер позволяет рассчитать ядерную площадь отдельных клеток и другие параметры формы, такие как круговерность. Анализ демонстрирует среднюю площадь ядра 64^мкм2 со средней циркулярностью 0,8. Значения округлости, близкие к 1, указывают на идеальную окружность, тогда как значения, приближающиеся к 0, указывают на более вытянутую морфологию.

Экваториальная эпителиальная упаковка клеток, гексагональная упаковка волоконных клеток и ширина волоконных клеток
Плоское (XY) изображение экваториальной области хрусталика демонстрирует шестиугольные и правильно упакованные эпителиальные клетки хрусталика, которые сходятся в точке опоры. Точка опоры – это место, где верхушечные концы удлиненных эпителиальных клеток сужаются, образуя опорную точку во время начальной дифференцировки и удлинения волоконных клеток на экваторе 4,13,14,15 (рис. 6B, обозначены красной пунктирной линией). Точка опоры может быть локализована на основе усиленного окрашивания F-актина, образующего непрерывную линию, разделяющую экваториальные эпителиальные клетки и клетки волокон (рис. 6B, красная пунктирная линия). Окрашивание F-актином на клеточных мембранах также демонстрирует изменения в форме клеток, при которых клетки ниже точки опоры точно выровнены и расположены параллельными рядами (рис. 6). Клеточные ядра также выровнены под точкой опоры.

Для визуализации эпителиальных клеток меридионального ряда хрусталика и волоконных клеток выбирают, как описано ранее^20, изображение 4,5-5 мкм периферии точки опоры (по направлению к капсуле хрусталика) в плоскости XY, где находится базальная область клеток меридионального ряда. Для измерения меридионального расстройства ряда выделяется область интереса (ROI) (рис. 7A; желтый прямоугольник). Площадь ROI на изображении объектива wildtype составляет 15 833^мкм2. Так как видимого беспорядка нет, то процент беспорядочности равен 0. Ранее^{была описана} критическая роль, которую играет немышечный миозин IIA (NMIIA) в гексагональной упаковке клеток у мышей с мутацией NMIIA-E1841K. На рисунке 7A показано репрезентативное экваториальное изображение линзы NMIIA^{E1841K/E1841K,} демонстрирующее нарушение меридиональных клеток ряда. ROI меридионального ряда составил 20 757 мкм2. Далее прослеживалась общая площадь неупорядоченных участков. Общая площадь нарушения составила 3 185^мкм2. Расчетный процент беспорядка составил 15,3% (площадь беспорядка x 100/общий ROI; Рисунок 7Б). Этот процент неупорядоченной области находится в пределах диапазона в предыдущем исследовании²⁰.

Далее было продемонстрировано исследование гексагональной упаковки в меридиональных рядных клетках дикого типа²⁰. Поскольку F-актин обогащен по всему периметру клеток меридионального ряда и во всех шести вершинах базальных областей клеточных мембран в линзах дикого типа (т.е. NMIIA^+/+), для оценки формы клеток и организации упаковки использовали окрашивание F-актином. На репрезентативном рисунке 1 ячейки были помечены и подсчитано количество соседних ячеек вокруг каждой ячейки. На рисунке 1 все десять ячеек имеют шесть смежных ячеек, что говорит о том, что эти ячейки расположены в сотовой организации (рис. 8). Напротив, 8 из 10 клеток (80% клеток) имеют шесть смежных ячеек на рисунке 2, что указывает на то, что клетки упакованы неравномерно (рис. 8).

Наконец, для измерения ширины волоконных ячеек были исследованы периферические волоконные клетки, расположенные на расстоянии ~10 мкм внутрь от точки опоры в фиксированных линзах дикого типа, меченных родамином-фаллоидином (рис. 9А)^2,4. Следует отметить, что также можно измерить ширину волоконных клеток с помощью живых мышей tdTomato, однако сигнал от линз, гетерозиготных для tdTomato, как правило, слаб в экваториальных областях. Поэтому рекомендуется использовать мышей, которые гомозиготны по tdTomato, так как было обнаружено, что они имеют более сильную флуоресценцию (не показано). Расстояние между границами клеток, окрашенных F-актином, с помощью линейного анализа измеряли, как описано выше, чтобы указать ширину ячейки волокна ^2,4 (рис. 9B). Этот анализ показал, что среднее межпиковое расстояние в линзах дикого типа составляет 11,45 ± 2,11 мкм (N=117 волоконных клеток из 4 различных изображений хрусталика мыши, рис. 9B).

Рисунок 1: Этапы создания агарозного диво для иммобилизации хрусталика во время визуализации. (А) Используя чашку со стеклянным дном, пипетку разжижают 2% агарозой. (B) Расплющите гибким накладкой и (C) когда остынет, удалите с помощью щипцов с тонким наконечником. (D) Для выемки создайте отверстие с помощью 3-миллиметрового биопсийного пуансона. (E) Аспирировать остаточные агаросы, промыть PBS, протереть поверхность безворсовой салфеткой. (F) Осторожно установите весь объектив в углублении. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Этапы создания агарозного дивота для визуализации клеток экваториального эпителия и волокон хрусталика. (A) Влейте 2% расплавленную агарозу в чашку для культуры тканей. (B) Охладите агарозу при комнатной температуре до полного затвердевания. (В) Острым лезвием создайте треугольный дивот. (D) Поместите 1 мл 1x PBS в чашку для культивирования тканей. (E) Поместите рассеченную линзу в клин так, чтобы ( F) линза подпиралась на экваторе между стенками агарозы (красная стрелка). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Определение толщины капсулы хрусталика. Сагиттальные (вид в плоскости X, Z) оптические срезы по реконструкциям конфокальных z-стеков (A) живых и (B) фиксированных капсул хрусталика. Интенсивность флуоресцентной развертки (C) живой и (D) фиксированной линз демонстрирует один пик WGA (зеленый), который соответствует верхней поверхности капсулы и базальной области эпителиальных клеток (красная), прилегающей к капсуле. Расстояние между двумя пиками измеряется для количественной оценки толщины капсулы. Изображения, полученные с помощью 40-кратного масляного объектива с точечным отверстием в 1 единицу Эйри, в результате чего получаются оптические сечения 1,0 мкм и 1,2 мкм в каналах tdTomato/Rhodamine-Phalloidin и WGA соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Количественная оценка площади эпителиальных клеток. (A) X, Z вид эпителиальных клеток хрусталика с пометкой (B) tdTomato для клеточных мембран и (C) Hoechst для ядер. (D) Вид в плоскости X, Y средней области эпителиальных клеток хрусталика. (E) Сигнал tdTomato используется в качестве ориентира для определения области интереса, соответствующей группе клеток, находящихся в фокусе. (F) Определена площадь определенной области. (G) Окрашивание ядер по методу Хёхста используется для определения количества клеток в определенной области. (H) Количество ядер подсчитывается с помощью (I) многоточечного инструмента FIJI ImageJ. Чтобы вычислить среднюю площадь ячейки, разделите общую площадь определенной интересующей области на общее количество ячеек. Изображения, полученные с помощью 63-кратного масляного объектива с точечным отверстием в 1 единицу Эйри, в результате чего получаются оптические сечения 0,7 мкм и 1,0 мкм в каналах Hoechst и tdTomato соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5: Определение площади и формы ядра. (A) Вид средней области ядер в плоскости XY. (В) Определена область интереса, в которой ядра находятся в фокусе. Очерчены ядра в рамках ROI. (C) Площадь и округлость ядер отдельных клеток были сведены в таблицу и рассчитаны средние значения площади и циркулярности. Изображения, полученные с помощью 63-кратного масляного объектива с точечным отверстием в 1 единицу Эйри, в результате чего оптическое сечение 0,7 мкм в канале Хёхста. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 6: Идентификация точки опоры хрусталика. F-актин и ядра могут быть использованы для идентификации точек опоры и меридиональных рядов. (A) На снимке XZ показано обогащенное окрашивание фаллоидином для F-актина, который соответствует точке опоры. (B) Один оптический секция обзора плоскости XY с точкой опоры объектива в фокусе. Окрашивание ядер по Хёхсту показывает, что ядра над точкой опоры упакованы неравномерно, в то время как ядра под точкой опоры точно выровнены (вверху справа). Окрашивание фаллоидином на F-актин показывает, что клетки над точкой опоры имеют неправильную форму, в то время как клетки ниже точки опоры упакованы в параллельные ряды (внизу слева). Красной пунктирной линией показано расположение точки опоры. Изображения, полученные с помощью 20-кратного объектива с точечным отверстием в 1 единицу Эйри, в результате чего получаются оптические сечения 1,5 мкм, 2,0 мкм и 2,2 мкм в каналах Hoechst, Rhodamine-Phalloidin, WGA-640 соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 7: Определение меридионального расстройства ряда. (A) Оптический срез одиночного XY-вида в плоскости дикого типа и меридиональных ячеек NMIIA^{E1841K/E1841K} на расстоянии ~5 мкм от точки опоры (по направлению к капсуле хрусталика). Весь меридиональный ряд ячеек обведен синим цветом в соответствии с ядерным выравниванием. Окрашивание F-актином (красным) в хрусталике дикого типа показывает, что клетки меридионального ряда точно выровнены без каких-либо признаков нарушения (0%). Репрезентативная упорядоченная область в диком типе обведена оранжевым цветом. В хрусталиках с неупорядоченными клетками мы очерчиваем неупорядоченные области (желтый). (Б) Большое увеличение упорядоченной области от дикого типа (оранжевый прямоугольник в А). (C) Большое увеличение неупорядоченных участков, демонстрирующих различные типы нарушений, включая (I) ветвление рядов, (II) неправильную форму ячеек и потерю сотовой упаковки, и (III) смещение рядов. Изображения, полученные с помощью объектива NMIIA^{E1841K/E1841K,} показывают 15,3% нарушений клеток меридионального ряда. Изображения, полученные с помощью 20-кратного объектива с точечным отверстием в 1 единицу Эйри, в результате чего оптические сечения составляют 1,5 мкм и 2,0 мкм в каналах Хёхста и родамина-фаллоидина, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 8: Анализ сотовой упаковки меридионального ряда линзы. (A) Одиночные оптические XY-срезы меридиональных ячеек ряда, окрашенные родамином-фаллоидином для F-актина. Изображения с малым увеличением (верхняя панель) показывают оцениваемые ячейки (пронумерованы розовым цветом). Область, выделенная желтым цветом, увеличена (Нижняя панель). Желтые римские цифры обозначают количество соседних клеток. На рисунке 1 показаны ячейки шестиугольной формы, каждая из которых имеет 6 смежных ячеек. На рисунке 2 имеются неровности: ячейки с номерами 1 и 5 имеют 5 и 7 смежных ячеек соответственно. (B) Данные записываются и сводятся в таблицу с вычисленным процентным соотношением гексагональных ячеек. Изображения, полученные с помощью 40-кратного объектива с точечным отверстием в 1 единицу Эйри, в результате чего оптическое сечение составляет 1,0 мкм в канале родамин-фаллоидин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 9: Анализ ширины ячеек волокна. (A) Одиночный оптический вид XY волоконных ячеек линзы на расстоянии ~10 мкм от точки опоры. Клетки окрашивали родамином-фаллоидином для визуализации F-актина на клеточных мембранах. Линия (розовая; пунктир) рисуется над несколькими ячейками волокна. (B) Репрезентативное линейное сканирование интенсивностей F-актина в зависимости от расстояния. Межпиковое расстояние представляет собой ширину ячейки волокна. Изображения, полученные с помощью 40-кратного объектива с точечным отверстием в 1 единицу Эйри, в результате чего оптическое сечение составляет 1,0 мкм в родамино-фаллоидиновых каналах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Discussion

Описанные протоколы позволяют визуализировать периферические структуры и клетки хрусталика в передней и экваториальной областях хрусталика с высоким пространственным разрешением. В данном исследовании были показаны методы визуализации периферических структур линз с использованием интактных (живых или фиксированных) линз, в которых сохраняется общая 3D архитектура объектива. Кроме того, были предоставлены простые методы морфометрического количественного анализа с использованием общедоступного программного обеспечения FIJI ImageJ. Методы визуализации и количественной оценки всей монтировки использовались в предыдущих исследованиях. Эти методы позволили понять реакцию передней капсулы и клеток на изменение формы хрусталика или старение ^2,4. Эти методы также использовались для изучения расширения клеток экваториального волокна из-за изменения формы хрусталика или старения ^2,4 и для определения роли NMIIA в установлении точных гексагональных форм и организации клеток периферических волокон²⁰.

Визуализация всего крепления позволяет получать изображения структуры хрусталика с высоким пространственным разрешением. В передней области хрусталика визуализация с полным креплением имеет преимущество перед визуализацией с плоским креплением, предотвращая повреждение, которое может изменить целостность структуры капсулы и/или морфологию эпителиальных клеток. Кроме того, сохраняется граница раздела между эпителиальными и волокнистыми клетками. Этот метод имеет преимущества по сравнению с визуализацией срезов хрусталика, так как визуализация лица обеспечивает большее пространственное разрешение и позволяет анализировать площадь эпителиальных клеток и ядерную область/форму выбранной области (т.е. средней латеральной, как показано здесь) или других областей клеток. Кроме того, методы визуализации позволяют количественно оценить морфологические особенности в определенных точках вдоль экваториальных областей хрусталика, что позволяет визуализировать шестиугольные формы, меридиональную упаковку ячеек ряда, точку опоры и ширину ячеек волокна, что было бы нелегко достижимо с помощью окрашенных срезов хрусталика из-за отсутствия пространственного разрешения и искажения тканей, которые могут возникнуть во время секционирования.

Описанные протоколы также позволяют получать изображения живых линз для отслеживания определенных структур и клеток хрусталика с течением времени. Протокол визуализации хрусталика в реальном времени сыграл важную роль в предыдущем исследовании, в котором были проведены повторные измерения анализа толщины капсулы и площади эпителиальных клеток из субпопуляции клеток одного и того же хрусталика до и после компрессии хрусталика для индуцирования сплющивания^{хрусталика}. Установлено, что компрессия хрусталика индуцирует уменьшение толщины капсулы и увеличение площади эпителиальных клеток. Из-за существенных различий в толщине капсулы и площади эпителиальных клеток между отдельными линзами, а также величины влияния на эти параметры, вызванного компрессией хрусталика, было бы трудно обнаружить различия, если бы использовался независимый дизайн измерения (т.е. сравнение отдельных несжатых линз с отдельными сжатыми линзами). Используя методы визуализации в реальном времени, была проведена полная визуализация на хрусталиках живых мышей, которые эндогенно экспрессируют LifeACT-GFP²⁶ , для визуализации F-актина в эпителиальных клетках²², что позволяет отслеживать реорганизацию F-актина в живых эпителиальных клетках.

В то время как описанные протоколы были разработаны для визуализации хрусталиков мышей и могут быть адаптированы для визуализации структур хрусталика у других видов, протоколы окрашивания для визуализации передних и экваториальных периферических структур хрусталика у других грызунов (крыс, морских свинок), а также у других хрусталиков млекопитающих (коровы, макаки и человека; данные не показаны). Визуализация структур в больших линзах требует более длительной фиксации (4% PFA, на льду, 4 ч), блокировки (1 ч) и окрашивания (в течение ночи, 4 °C). Следует отметить, что визуализация у разных видов проводилась только на неподвижных линзах. Визуализация линз других видов в реальном времени может быть сложной задачей, поскольку протокол визуализации в реальном времени использует линзы трансгенных мышей, которые экспрессируют флуорогенные белки. Таким образом, эта визуализация может препятствовать визуализации линз других видов, где генетические модификации не являются обычным явлением. Тем не менее, мы смогли провести визуализацию эпителиальных клеточных мембран хрусталика или F-актина в режиме реального времени, предварительно окрашивая хрусталики мышей липофильным зондом FM4-64 или F-актиновым связывающим зондом SiR-Jasplakinolide (SiR-актином) соответственно (не показан). Возможно, такие зонды можно будет использовать для получения изображений живых линз других видов. Тем не менее, следует соблюдать осторожность при использовании таких зондов, чтобы избежать нецелевых эффектов; например, SiR-Jasplakinolide может приводить к изменению динамики F-актина²⁷. Еще одним ограничением методов окрашивания, как на живых, так и на фиксированных линзах, является то, что такие зонды имеют ограниченное проникновение. Таким образом, визуализация ограничивается периферическими областями. Можно визуализировать внутренние области (т.е. клетки глубоких волокон) с помощью линз трансгенных мышей tdTomato⁴, которые также полагаются на трансгенную экспрессию флуорогенных белков. Экспрессия также должна быть достаточно высокой для ярких сигналов в клетках глубоких волокон.

Тем не менее, описанные протоколы позволили провести эффективное морфологическое количественное определение признаков периферического хрусталика ^2,4,20. Методики количественной оценки эффективны и используют общедоступное программное обеспечение FIJI ImageJ с открытым исходным кодом. Несмотря на то, что для определения областей интереса использовались инструменты трассировки вручную, можно автоматизировать идентификацию областей интереса. Автоматизация может быть такой же простой, как применение флуоресцентного порога для повышения контраста для идентификации определенных структур (например, границ ядер) на основе FIJI ImageJ или более сложных алгоритмов машинного обучения для обнаружения различий в форме клеток (например, неправильной формы эпителиальных или волоконных клеток). Для более сложного анализа могут потребоваться либо специализированные плагины, либо программное обеспечение для работы с изображениями. Специализированные плагины или программное обеспечение также могут позволить получать 3D объемные морфологические измерения из полученных z-стеков. В целом, несмотря на то, что описанные методы количественной оценки легко доступны, экономически эффективны и подходят для многих полезных критериев оценки исходов ^2,4,20, платформа протоколов визуализации в сочетании со сложным программным анализом может обеспечить множество дополнительных морфологических измерений для будущих исследований.

Хрусталик представляет собой сложную биологическую ткань со специализированными функциями, которые зависят от местоположения и геометрии клеток и связанных с ними структур в зависимости от глубины. Использование протоколов визуализации и методов количественной оценки, продемонстрированных здесь, позволит лучше понять, как формируются структуры хрусталика и сложная организация хрусталика. Кроме того, протоколы визуализации и методы количественной оценки помогут очертить взаимосвязи между структурой и функциями хрусталика.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
3 мм Biopsy Punch	Acuderm Inc	NC9084780
Agarose	Apex BioResearch Products	20-102GP
Антимикотический/антибиотик	Цитива	SV30079.01
Бычья сыворотка Альбумин (фракция V)	Prometheus	25-529
Деликатные салфетки	для задач Kimwipe
Стеклянная посуда с дном ( Fluorodish)	World Precision International	FD35-100
Hoescht 33342	Biotium	40046
Лазерный сканирующий конфокальный микроскоп 880	Zeiss
MatTek Imaging Dish	MatTek Life Sciences	P35G-1.5-14
Параформальдегид	Электронная микроскопия наук	100503-917
PBS	GenClone	25-507B
Фенол безкрасная среда 199	Gibco	11043023
Родамин-фаллоидин	Thermo Fisher	00027
Triton X100	Sigma-Aldrich	11332481001
WGA-640	Biotium	CF 640R