Method Article

Высокоскоростной метод гомогенизации с помощью магнитной сепарации для крупномасштабного производства везикул, полученных из эндосом

DOI:

10.3791/66021

⸱

January 26th, 2024

 ,  , 
1Academy of Medical Engineering and Translational Medicine, Tianjin University, 2Hangzhou Institute of Medicine (HIM), Chinese Academy of Sciences, 3School of Materials Science and Engineering, Tianjin University, 4Zhejiang Cancer Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В данной работе мы описываем метод высокоскоростной гомогенизации с помощью магнитной сепарации для крупномасштабного производства нановезикул, полученных из эндосом, как нового типа имитаторов экзосом (ЭМ), которые имеют то же биологическое происхождение и сходную структуру, морфологию и белковый состав нативных внеклеточных везикул (ВВ).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Внеклеточные везикулы (ВВ) привлекли значительное внимание в физиологических и патологических исследованиях, диагностике и лечении заболеваний; Тем не менее, их клиническая трансляция была ограничена отсутствием подходов к масштабному производству. Таким образом, этот протокол обеспечивает высокоскоростной метод гомогенизации с помощью магнитной сепарации для крупномасштабного производства нановезикул, полученных из эндосом, в качестве нового типа имитаторов экзосом (ЭМ), полученных из эндосом, которые имеют примерно в 100 раз более высокий выход, чем традиционный метод ультрацентрифугирования. В этом методе магнитные наночастицы (MNP) интернализировались родительскими клетками посредством эндоцитоза и впоследствии накапливались в их эндосомах. Затем были собраны эндосомы с MNP, загруженные MNP, и очищены с помощью гипотонической обработки и магнитной сепарации. Высокоскоростной гомогенизатор был использован для разбиения эндосом, загруженных MNP, на монодисперсные нановезикулы. Полученные везикулы, полученные из эндосом, имеют одинаковое биологическое происхождение и структуру, характеризуются анализом отслеживания наночастиц, просвечивающим электронным микроскопом и вестерн-блоттингом. Их морфология и белковый состав аналогичны нативным ВВ, что указывает на то, что ЭМ потенциально могут служить недорогим и высокопродуктивным суррогатом нативных ВВ для клинических трансляций.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Внеклеточные везикулы (ВВ) представляют собой небольшие везикулы, секретируемые почти всеми клетками с диапазоном размеров 30-150 нм, содержащие большое количество биологически активных веществ. В зависимости от исходной клетки ВВ демонстрируют высокую гетерогенность, обладая несколькими компонентами, специфичными для родительских клеток1. ВВ высвобождаются в жидкости организма и транспортируются в отдаленные участки, где они поглощаются клетками-мишенями для действия2, которое может быть использовано для доставки широкого спектра биологически активных молекул и лекарств для восстановления тканей, диагностики и лечения опухолей, а также иммуномодуляции 3,4. Однако другие биологические наночастицы (например, липопротеины) и нановезикулы (например, ВВ, полученные из неэндосомальных путей) с аналогичными биофизическими свойствами в жидкостях организма неизбежно влияют на выделение и очистку ВВ. На сегодняшний день ультрацентрифугирование остается золотым стандартом для изоляции ВВ, ибыли разработаны другие методы изоляции, включая центрифугирование с градиентом плотности сахарозы, ультрафильтрацию, осаждение полиэтиленгликоля, хроматографию и иммуномагнитную изоляцию шариков. В настоящее время узким местом, ограничивающим клиническую трансляцию и коммерциализацию терапевтических средств для лечения ВВ, является острая нехватка методов выделения, которые позволяют обеспечить высокомасштабируемую и воспроизводимую изоляцию ВВ 6,7,8. Традиционные методы выделения ВВ (например, ультрацентрифугирование и эксклюзионная хроматография) страдают от низкого выхода (1 x 107-1 x 108/1 x 106 клеток), длительного производственного цикла (24-48 ч), плохой воспроизводимости качества продукции и требуют дорогостоящего и энергоемкого производственного оборудования, которое не может удовлетворить текущий клинический спрос на электромобили6.

Имитаторы экзосом (ЭМ), синтетические суррогаты нативных электромобилей, привлекли важное внимание из-за их очень похожей структуры, функций и масштабируемости в производстве. Основным источником ЭМ является прямая экструзия целых родительских клеток с непрерывным секционированием9,10, демонстрирующая мощные биологические функции нативных ВВ11,12. Например, ЭМ, полученные из мезенхимальных стволовых клеток пуповины человека (hUCMSCs), оказывают такое же ранозаживляющее действие, как и нативные ВВ, и более богаты белковым составом13. Несмотря на то, что ЭМ, полученные из цельных клеток, имеют биологическую сложность ВВ, их основным недостатком является гетерогенность продуктов, поскольку они неизбежно загрязняются различными клеточными органеллами и клеточным мусором. Анализ локализации белков также показал, что ЭМ, полученные в результате экструзии цельных клеток, содержат много неспецифичных для ВВ белков из митохондрий и эндоплазматического ретикулума13. Кроме того, большинство методов производства ЭМ по-прежнему требуют ультрацентрифугирования, что является очень трудоемким и энергоемкимпроцессом14. Принимая во внимание тот факт, что экзосомы происходят исключительно из клеточных эндосом, мы предположили, что биоинженерные нановезикулы, полученные из эндосом, могут лучше повторять биологическую гомологию между экзосомами и ЭМ по сравнению с хорошо зарекомендовавшими себя ЭМ, полученными из клеточных мембран, полученными методом экструзии цельных клеток14. Тем не менее, производство нановезикул, полученных из эндосом, затруднено из-за отсутствия жизнеспособных подходов.

Клинические исследования проводились с использованием ВВ в качестве суррогата бесклеточной терапии и наноразмерной системы доставки лекарств для лечения различных заболеваний. Например, ВВ, полученные из мезенхимальных стволовых клеток костного мозга, использовались для лечения тяжелой пневмонии, вызванной COVID-19, и достигли многообещающих результатов. Недавно генетически модифицированные электромобили, несущие белки CD24, также продемонстрировали мощные терапевтические преимущества для лечения пациентов с COVID-1915,16. Тем не менее, клинические требования к терапии ВВ все еще не могут быть удовлетворены традиционными методами изоляции из-за низкой производительности и стоимости. В этом исследовании сообщается о крупномасштабном производстве нановезикул, полученных из эндосом, с помощью высокоскоростной гомогенизации с помощью магнитной сепарации. Он использует эндоцитозный путь MNP для выделения эндосом, загруженных MNP, с помощью магнитной сепарации с последующей высокоскоростной гомогенизацией для формирования эндосом в монодисперсные нановезикулы. Поскольку типы эндосом, собранных в рамках этого протокола, разнообразны, все еще необходимы дальнейшие углубленные исследования для установления надлежащей производственной практики (GMP) в отрасли. Этот новый подход к ЭМ-подготовке является более эффективным по времени (5 минут высокоскоростной гомогенизации) для получения нановезикул, гомологичных нативным ВВ. Он производит экспоненциально больше везикул из тех же количеств клеток, чем ультрацентрифугирование, которое в целом может быть применено к различным типам клеток.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ПРИМЕЧАНИЕ: Схема метода показана на рисунке 1.

1. Подготовка и изоляция ЭМ

  1. Клеточная интернализация MNP
    1. Клеточная культура
      1. Суспендировать 1 × 106 мезенхимальных стволовых клеток костного мозга крысы (BMSC), 293Т-клеток или клеток эпителиального рака яичников мыши (ID8) в полной среде DMEM с 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) и 5% раствором пенициллина-стрептомицина (P/S) по 2 мл на шестилуночный планшет (см. таблицу материалов).
      2. Культивируйте клетки в течение ночи при 37 °C и 5% CO2.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Количество клеток после адгезии составляло примерно 1 × 106.
    2. Эндоцитоз МНП
      1. Уменьшите средний объем каждой шестилуночной чашки до 1 мл. Совместное культивирование клеток с 10 нм модифицированными полилизин-модифицированными наночастицами оксида железа (ИОНФ) (см. таблицу материалов) в концентрации 100 мкг/1 × 106 клеток и инкубируют при 37 °C в атмосфере, содержащей 5% СО2, в течение12 ч, чтобы позволить клеткам полностью эндоцитозировать ИОНы.
  2. Выделение и гомогенизация эндосом
    1. Лечение клеточной гипотоники
      1. Переваривают клетки, которые полностью интернализировали ИОНПы, с помощью 0,5 мл/луночный трипсин в течение 3 мин и прекращают пищеварение, добавляя 1 мл/лунку полную среду.
      2. Центрифугу при 1000 х г в течение 5 мин и выбросьте надосадочную жидкость. Ресуспендируйте клетки в фосфатном солевом растворе (PBS) и центрифуге, многократно дважды, чтобы вымыть остаточную среду и неабсорбированные ионы.
      3. Наконец, повторно суспендировать гранулу в 8 мл в заранее приготовленном гипотоническом растворе (71,4 мМ хлорида калия, 1,3 мМ цитрата натрия, рН 7,2-7,4) в течение 15 мин (см. таблицу материалов).
    2. Высвобождение органелл путем низкоскоростной гомогенизации
      1. Переложите клеточную суспензию в гипотоническом растворе в стеклянную пробирку и выпустите органеллы с помощью стеклянного гомогенизатора (см. таблицу материалов) 20 ударами при 1000 об/мин.
    3. Магнитная сепарация для получения эндосом
      1. Перелейте 1 мл гомогенизированного клеточного раствора в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл и поместите в магнитный сепаратор на 1 ч, чтобы полностью отделить эндосомы, загруженные IONP, от других органелл (таких как ядро и митохондрии) и клеточного мусора.
      2. Соберите коричневые гранулы на контактной поверхности пробирок микроцентрифуги рядом с магнитной рамкой (см. Таблицу материалов), т.е. эндосомами, загруженными IONP. Выбросьте жидкость в пробирки микроцентрифуги и добавьте 3 мл PBS для ресуспендирования эндосом.
  3. Высокоскоростная гомогенизация
    1. Перелейте раствор, содержащий эндосомы, в центрифужную пробирку объемом 15 мл с объемом жидкости от 3 до 10 мл.
    2. Выдвиньте зонд высокоскоростного гомогенизатора диаметром 10 мм (см. Таблицу материалов) на дно пробирки центрифуги, не касаясь дна. Отрегулируйте кнопку « Скорость » под экраном, установите скорость на 140 x g и отрегулируйте кнопку «Время », чтобы установить время 5 минут, затем нажмите кнопку OK .
    3. Нажмите кнопку «Пуск », чтобы выполнить гомогенизацию после помещения ящика со льдом под образец.
  4. Магнитная сортировка для ЭМ
    1. Раствор, содержащий нановезикулы, полученные в результате высокоскоростной гомогенизации, переносят в пробирку микроцентрифуги объемом 1,5 мл и помещают в магнитный сепаратор на 1 ч.
    2. Соберите жидкость, содержащую необходимые ЭМ. Будьте осторожны, чтобы не прикасаться к поверхности трубок рядом с магнитной рамкой, которая адсорбирует свободные ИОНы и ЭМ, загруженные ИОНП.

2. Определение характеристик ЭМ (Рисунок 2 и Рисунок 3)

  1. Анализ динамического рассеяния света (DLS)
    1. Введите 1 мл образца ЭМ (20 мкг/мл) вдоль стенки в кювету и поместите его в слот для образца инструмента DLS (см. таблицу материалов).
    2. Откройте программное обеспечение DLS, выберите Particle Size Test (Тест размера частиц) и начните тестирование.
    3. Измерьте концентрацию белка с помощью набора для анализа белка BCA (см. Таблицу материалов).
  2. Анализ отслеживания наночастиц (NTA)
    1. Разбавляют ЭМ с ПБС до раствора со скоростью 1 × 107-1 × 108 частиц/мл и вводят их в камеру прибора НТА (см. таблицу материалов) с помощью шприца объемом 1 мл со скоростью потока 500-1000 мкл/мин.
    2. Откройте 488 лазерных каналов и убедитесь, что количество электромагнитных излучений в программном интерфейсе находится в пределах 100-300 и находится в броуновском движении.
    3. В соответствии с протоколом производителя выберите соответствующую СОП (EV-488), чтобы убедиться, что чувствительность прибора подходит для обнаружения электромагнитных излучений.
  3. Просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ)
    1. Фиксируйте ЭМ (1 мг/мл) с равным объемом 5% глутарового альдегида в течение 30 мин и количественно определяйте концентрацию ЭМ как 1 мг/мл с помощью набора для анализа белка BCA.
    2. Поместите каплю 10 мкл ЭМ на углеродную сторону медной сетки и удалите лишнюю жидкость со стороны фильтровальной бумаги через 10 минут. Добавьте 10 мкл PBS и сразу же промокните фильтровальной бумагой. Повторите дважды, чтобы удалить излишки глутарового альдегида.
    3. Капните 5 мкл контрастного вещества уранилацетата и окрашивайте в негативном виде в течение 1 минуты, затем удалите излишки контрастного вещества. Трижды промыть деионизированной водой и высушить при комнатной температуре (RT).
    4. Запись изображения с помощью ПЭМ при разгонном напряжении 100 кВ.
  4. Вестерн-блоттинг
    1. Добавьте к образцам 100 мкл буфера для лизиса клеток и 5 мкл коктейля из 50-кратных ингибиторов протеазы (см. таблицу материалов). Аккуратно перемешайте с помощью пистолета-пипетки и положите на лед на 30 минут.
    2. Центрифугируют раствор при 1000 x g в течение 10 мин при 4 °C, количественно определяют концентрацию белка надосадочной жидкости с помощью набора для анализа белка BCA и собирают его.
    3. Смешайте 100 мкл надосадочной жидкости с 25 мкл 5-кратного буфера для загрузки белка и нагревайте при 95 °C в течение 10 минут.
    4. Готовят гели в соответствии с инструкцией предварительно сформированных гелей. Загружают 15 мкг белка на лунку и проводят гель-электрофорезом при 80 В. Дождавшись, пока образец попадет в разделительный гель, измените на 100 В, а затем перенесите белок на нитроцеллюлозную мембрану при 100 В, 60 мин на ледяной бане.
    5. Определение неспецифичных для ВВ маркеров (Calnexin) и биомаркеров ВВ (Annexin и CD63) методом вестерн-блоттинга (см. таблицу материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Антитела разбавляются в соответствии с рекомендациями производителя.

3. Определение функции ЭМ in vitro

  1. Маркировка ЭМ
    1. Смешайте 1 мкл PKH26 с 250 мкл разбавителя C (1:250), чтобы получить 2-кратный раствор для окрашивания (4 × 10-6 M) (см. Таблицу материалов).
    2. Смешайте 250 мкл ЭМ (1 мг/мл) с 250 мкл 2-кратного раствора для окрашивания и быстро продуйте пистолетом для пипетирования.
    3. Инкубируйте при RT в течение 2-5 минут, осторожно переворачивая центрифужную пробирку.
    4. Добавьте равный объем сыворотки или 1% бычьего сывороточного белка и инкубируйте в течение 1 минуты, чтобы прекратить пищеварение.
    5. Удалите излишки PKH26 путем ультрафильтрации с помощью ультрафильтрационных трубок 1000 KD при 3000 x g в течение 30 мин и повторите три раза, добавив PBS. Ресуспендируйте оставшуюся жидкость до 500 мкл с помощью PBS и профильтруйте через фильтр 0,22 мкм.
  2. Анализ поглощения клеток
    1. Клеточная инокуляция: Высевают 1 × 106 клеток в конфокальные чашки диаметром 35 мм с 1 мл DMEM, содержащего 10% FBS и 5% P/S, и инкубируют при 37 °C и 5%CO2 в течение ночи.
    2. Отфильтруйте ЭМ стерильными шприцевыми фильтрами 0,22 мкм, чтобы удалить потенциальное загрязнение.
    3. Обрабатывайте клетки мечеными PKH26 ЭМ (10-9 частиц/мл) в течение 8 ч.
    4. Промыть три раза PBS, добавить DAPI (10 нг/мл) и инкубировать в течение 10 мин при RT.
    5. Получение флуоресцентных изображений в конфокальной лазерной сканирующей флуоресцентной микроскопии с использованием лазерных каналов 405 нм и 561 нм (см. таблицу материалов).

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Рабочий процесс получения ЭМ методом высокоскоростной гомогенизации с помощью магнитной сепарации показан на рисунке 1. Клетки интернализируют 10-нм полилизин-модифицированные ионы, которые специфически накапливаются в эндосомах посредством эндоцитоза (рис. 3А). После обработки гипотоническим буфером и гомогенизации эндосомы, загруженные IONP, высвобождаются из клеток и впоследствии собираются методом магнитной сепарации. Изолированные эндосомы далее восстанавливаются в монодисперсные нановезикулы, также известные как ЭМ, путем высокоскоростной гомогенизации. Мы исследовали несколько ключевых параметров (например, скорость и время гомогенизации) для определения оптимальных условий подготовки ЭМ (рис. 2). Наконец, в качестве оптимального условия была выбрана скорость гомогенизации 140 x g в течение 5 мин с учетом размера частиц и выхода полученных ЭМ. Свободные ИОНы и ЭМ, загруженные ИОНФ, в конечном итоге удаляются из конечного продукта путем второго раунда магнитной сепарации для получения ЭМ без ИОНП. Этот метод позволяет получить высокооднородные и монодисперсные нановезикулы из эндосом родительских клеток, имеющие то же биологическое происхождение, что и нативные ВВ.

Для сравнения ВВ, полученных методом ультрацентрифугирования, с ЭМ, полученными этим методом, для ВВ и ЭМ были подготовлены BMSC и 293T. Диаметр и морфологию ЭМ анализировали методами NTA и TEM. Морфология BMSC-EMs имеет типичную чашеобразную везикулообразную структуру и ограничена липидным бислоем (рис. 3А). Согласно анализу NTA, как BMSC-EM, так и 293T-EM имеют гидродинамический диаметр, аналогичный нативным электромобилям (BMSC-EV и 293T-EV) (рис. 3B). Выход BMSC-EMs при высокоскоростной гомогенизации составил 8,16 × 10 8-1,42 × 109/1 × 10 6 ячеек, а выход нативных ВВ, полученных ультрацентрифугированием, составил всего 7,2 × 10 7-1,12 × 108/1 × 106ячеек. Аналогичным образом, выход 293T-EMs при высокоскоростной гомогенизации составил 3,71 × 10 8-7,58 × 108/1 × 10 6 клеток, что примерно в 100 раз выше, чем у нативных 293T-EV, приготовленных обычным методом ультрацентрифуги (≈5,5 × 10 6/1 × 10 6клеток) (рис. 4A).

Более того, результаты вестерн-блоттинга показали, что BMSC-EM содержат те же белковые биомаркеры, что и EV (CD63 и Annexin). Как ЭМ, так и ВВ отрицательны для экспрессии кальнексина, что позволяет предположить, что ЭМ, полученные этим методом, почти не имели загрязнения плазматической мембраны (рис. 3C). Существенной разницы в концентрации белка между ЭМ и ВВ нет, BMSC-EM и BMSC-EV показали одинаковые концентрации общего белка, 11,15 мкг/1 × 10 9 частиц и 14,71 мкг/1 × 109 частиц с помощью набора для анализа белка BCA. Кроме того, 293T-EM и 293T-EV показали концентрацию общего белка приблизительно 31,8 мкг/1 × 10 9 частиц и 9,95 мкг/1 × 109 частиц соответственно (рис. 4B). Эти результаты указывают на то, что ЭМ имеют такой же белковый состав, как и нативные ВВ. Чтобы определить, могут ли ЭМ быть эндоцитозированы, ЭМ и ВВ, меченные PKH26, инкубировали совместно с BMSC и ID8 в концентрации 1 × 109 частиц/мл в течение 8 ч, и клетки наблюдали под помощью конфокальной флуоресцентной микроскопии, чтобы подтвердить, что ЭМ могут быть легко поглощены клетками для действия, а также ВВ (рис. 5).

figure-results-1
Рисунок 1: Принципиальная схема метода высокоскоростной гомогенизации с магнитным сопровождением. Шаг 1: Клетки интернализируют ионы в эндосомы посредством эндоцитоза. Шаг 2: Соберите органеллы, включая эндосомы с ИОНП-нагрузкой, после гипотонического лечения и гомогенизации. Шаг 3: Очистите эндосомы, загруженные IONP, с помощью магнитной сепарации. Шаг 4: Эндосомы гомогенизируются и восстанавливаются в монодисперсные нановезикулы. Шаг 5: Удалите свободные IONP и ЭМ, загруженные IONP, с помощью магнитной сепарации, чтобы собрать ЭМ без IONP. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-2
Рисунок 2: Оптимизация условий приготовления ЭМ . (A) Диаметр и ПДН BMSC-EM в ответ на изменение скорости гомогенизации при установленном времени 5 мин были проанализированы с помощью DLS. (B) Диаметр и PDI BMSC-EM в ответ на изменение времени гомогенизации при установке скорости гомогенизации на 140 x g были проанализированы с помощью DLS. (C) Диаметр и ПДН BMSC-EM в различных точках времени хранения были проанализированы с помощью DLS. (D) Диаметр и концентрация BMSC-EM в ответ на изменение скорости гомогенизации при установлении времени на 5 мин были проанализированы с помощью NTA. (E) Диаметр и концентрация BMSC-EM в ответ на изменение времени гомогенизации при установке скорости гомогенизации на 140 x g были проанализированы NTA. (F) Диаметр и выход BMSC-EM в ответ на совместную инкубацию клеток BMSC с IONP различных концентраций были проанализированы NTA. p < 0,0001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-3
Рисунок 3: Характеристика ЭМ. (А) ПЭМ-характеристика морфологии родительских клеток с эндоцитозированными ИОНами, эндосомами и ЭМ. Масштабные линейки обозначают 500 нм. (B) Гидродинамические диаметры BMSC-EM, BMSC-EV, 293T-EM и 293T-EV характеризуются NTA. (C) Результаты вестерн-блоттинг-анализа лизатов клеток BMSC-EM, BMSC-EV и BMSC. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-4
Рисунок 4: Выход ЭМ выше, чем у ВВ. (А) Выход ЭМ и ВВ, приготовленных из BMSC и 293T, был проанализирован NTA. (B) Выход белка из ЭМ и ВВ, приготовленных из BMSC и 293T. **p < 0,01. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-5
Рисунок 5: Репрезентативные изображения флуоресцентного микроскопа ВВ и ЭМ, меченных PKH26, интернализированных BMSC и ID8. Масштабные линейки представляют собой 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Являясь суррогатом бесклеточной терапии и наноразмерной системы доставки лекарств, ВВ еще не оправдали своих клинических ожиданий, и основным препятствием является отсутствие масштабируемых и воспроизводимыхметодов производства и очистки. Поэтому в качестве аналогов ВВ со сходной биологической сложностью были разработаны различные типы ЭМ14. На сегодняшний день наиболее часто используемым примером ЭМ являются нановезикулы, полученные из плазматической мембраны клеток. Получение таких нановезикул является относительно простым и понятным путем прямой экструзии целых родительских клеток17. Однако нановезикулы, полученные из клеточной плазматической мембраны, не могут повторить нативные ВВ из-за двух недостатков: во-первых, биологическое происхождение этих нановезикул связано с клеточной плазматической мембраной, которая содержит другой липидный и белковый состав по сравнению с нативными ВВ; Во-вторых, загрязнения, включая белки, нуклеиновые кислоты и липиды из органелл, не относящихся к ВВ, и клеточный мусор, вызывающие неизбежную гетерогенность ЭМ. В этом методе мы инкубировали клетки с ИОНФами и собирали эндосомы с ИОНФ-нагрузкой с помощью магнитной сепарации, затем генерировали монодисперсные нановезикулы с помощью высокоскоростной гомогенизации, в конечном итоге получая ЭМ без ИОНФ путем второго раунда магнитной сепарации. Кроме того, мы оптимизировали условия приготовления ЭМ, изучив влияние различных параметров, таких как скорость и время гомогенизации, на размер и выход ЭМ. Этот протокол использует интересный биологический феномен: MNP (например, 10 нм IONP) могут эффективно интернализироваться почти всеми клетками посредством эндоцитоза и накапливаться исключительно в эндосомах, а не в других органеллах. Этот уникальный биологический процесс позволил изолировать эндосомы с MNP-нагруженными без загрязнения, не связанного с EV, с помощью магнитной сепарации. В свою очередь, нановезикулы, подготовленные этими очищенными клеточными эндосомами, могли бы более точно повторять биологическую сложность нативных ВВ.

Кроме того, золотым стандартом метода выделения ЭВ является ультрацентрифугирование, которое требует больших сред для клеточных культур и длительного времени обработки более 5 часов и производит только 1 × 107-1 × 108 частиц из 1 x 10 6 клеток6. Традиционные методы экструзии цельных родительских клеток включают несколько этапов, включающих экструзию мембраны сверхвысокого давления и ультрацентрифугирование, которые имеют относительно более высокую производительность, но требуют дорогостоящего оборудования17. Тем не менее, производительность, эффективность, затраты и трудовые ресурсы EM значительно улучшаются за счет использования нашего протокола. Высокоскоростной гомогенизатор является распространенным и недорогим оборудованием для короткого времени обработки 5 мин в этом протоколе, и этот метод может производить до 100 раз больше ЭМ от 1 × 106 ячеек по сравнению с нативными электромобилями. Однако этот метод имеет некоторые ограничения, такие как потеря эндосомальных белков при высокоскоростной гомогенизации, и было показано, что MNP, эндоцитозированные клетками, могут быть перенесены в лизосомы, что может быть потенциальным загрязнением.

В перспективе ЭМ могут быть спроектированы таким образом, чтобы они выполняли важные биологические функции, как и их нативные аналоги, что может служить новым и перспективным типом биологической терапии. Биологически активные вещества (например, белки и нуклеиновые кислоты) могут быть интегрированы в ЭМ путем отбора специфических родительских клеток (например, стволовых клеток19) или генетической модификации (например, слияния белков20). Например, нановезикулы, полученные из клеток, путем экструдирования живых эмбриональных стволовых клеток оказывают положительное влияние на процесс восстановления или заживления ран19. Генетическая модификация является альтернативным подходом к получению ЭМ со специфическими биологическими функциями. Например, когда клетки трансфицировали векторами нанотел рецептора антиэпидермального фактора роста (EGFR), сплавленных с пептидами якорного сигнала гликозилфосфатидилинозитола (GPI), нанотела EGFR могут быть закреплены на поверхности ВВ для нацеливания на EGFR-экспрессирующие опухолевые клетки20. В многочисленных доклинических исследованиях ЭМ хорошо зарекомендовали себя в качестве суррогата бесклеточной терапии и наноразмерной системы доставки лекарств14, но отсутствует всестороннее механистическое понимание ЭМ или терапии на основе ВВ с опасениями по поводу гетерогенности и воспроизводимости ВВ и ЭМ в клинических исследованиях. Взятые вместе, биологические функции ЭМ и их клинические последствия требуют дальнейших исследований.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Д.В. и.Г. являются соавторами патентной заявки, поданной Институтом фундаментальной медицины и рака (IBMC) Китайской академии наук. Другой автор заявляет об отсутствии конфликта интересов.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы признают использование приборов в Центре совместного использования контрольно-измерительных приборов в Институте фундаментальной медицины и рака (IBMC) Китайской академии наук. Это исследование было поддержано Национальным фондом естественных наук Китая (NSFC; 82172598), Фондом естественных наук провинции Чжэцзян, Китай (LZ22H310001), Проектом 551 по подготовке кадров в области здравоохранения Комиссии по здравоохранению провинции Чжэцзян, Китай, Исследовательским проектом по сельскохозяйственному и социальному развитию Муниципального научно-технического бюро Ханчжоу (2022ZDSJ0474) и Междисциплинарным исследовательским грантом Цяньтан.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Антитело к аннексинуABclonalA11235Western blotting
BCA Набор для анализаBeyotimeP0012Анализ концентрации белка
CalnexinGeneTexHL1598Western blotting
CD63 антителоABclonalA19023Western blotting
Буфер для лизиса клеток для Western и IPBeyotimeP0013Western Центрифуга для блоттинга
BeckmanAllegra X-30RКлеточная центрифуга
CO2 инкубаторThermoCell Culture
Конфокальная лазерная сканирующая флуоресцентная микроскопияNIKONA1 HD25Фото флуоресцентной картины
DMEM basic (1x)GIBCOC11995500BTКлеточная
культура Динамическое рассеяние света (DLS)MalvernZetasizer Nano ZS ZEN3600Анализ диаметра
Электрический гомогенизатор стеклаSCIENTZ(Нинбо, Китай)DY89-IIНизкоскоростная гомогенизация
Экзосомно-обедненная система FBSБионаукаEXO-FBS-50A-1
Высокоскоростной гомогенизаторклеточных культур SCIENTZ(Нинбо, Китай)XHF-DYВысокоскоростная гомогенизация
Магнитная решеткаTuohe Electromechanical Technology (Шанхай, Китай)NAМагнитная сепарация
PKH26 Красный флуоресцентный клеточный линкер Набор для общего мечения клеточных мембранSigma-AldrichPKH26GL-1KTНабор содержит клеточный линкер PKH26 в этаноле и разбавитель C
полилизин-модифицированные наночастицы оксида железа (IONP)Zhongke Leiming Technology (Пекин, Китай)Mag1100-10Клеточная культура
калия хлоридАладдин7447-40-7Клеточная гипотоническая терапия
Коктейль ингибитора протеазыBeyotimeP1030Ингибитор протеиназы
Цитрат натрияАладдин7447-40-7Клеточная гипотоническая терапия
Просвечивающая электронная микроскопия (ТЭМ)JEOLJEEM -2100plusМорфологическое изображение
УльтрацентрифугаBeckmanOptima XPN-100Экзосомная центрифуга
ZetaView nanoparticle  анализаторы слеженияParticle MetrixPMX120Анализ слежения за наночастицами

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kalluri, R., LeBleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 367 (6478), eaau6977(2020).
  2. Hyenne, V., et al. RAL-1 controls multivesicular body biogenesis and exosome secretion. J Cell Biol. 211 (1), 27-37 (2015).
  3. Farooqi, A. A., et al. Exosome biogenesis, bioactivities and functions as new delivery systems of natural compounds. Biotechnol Adv. 36 (1), 328-334 (2018).
  4. Gatti, S., et al. Microvesicles derived from human adult mesenchymal stem cells protect against ischaemia-reperfusion-induced acute and chronic kidney injury. Nephrol Dial Transplant. 26 (5), 1474-1483 (2011).
  5. Zhang, Y., et al. Exosome: A review of its classification, isolation techniques, storage, diagnostic and targeted therapy applications. Int J Nanomedicine. 15, 6917-6934 (2020).
  6. Yang, D., et al. Progress, opportunity, and perspective on exosome isolation - efforts for efficient exosome-based theranostics. Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).
  7. Castilletti, C., et al. Coordinate induction of IFN-alpha and -gamma by SARS-CoV also in the absence of virus replication. Virology. 341 (1), 163-169 (2005).
  8. Guo, P., Huang, J., Moses, M. A. Cancer nanomedicines in an evolving oncology landscape. Trends Pharmacol Sci. 41 (10), 730-742 (2020).
  9. Jo, W., et al. Large-scale generation of cell-derived nanovesicles. Nanoscale. 6 (20), 12056-12064 (2014).
  10. Yoon, J., et al. Generation of nanovesicles with sliced cellular membrane fragments for exogenous material delivery. Biomaterials. 59, 12-20 (2015).
  11. Li, M., et al. Exosome mimetics derived from bone marrow mesenchymal stem cells ablate neuroblastoma tumor in vitro and in vivo. Biomater Adv. 142, 213161(2022).
  12. Wang, J., et al. Exosome mimetics derived from bone marrow mesenchymal stem cells deliver doxorubicin to osteosarcoma in vitro and in vivo. Drug Deliv. 29 (1), 3291-3303 (2022).
  13. Zhang, Z., et al. Comprehensive proteomic analysis of exosome mimetic vesicles and exosomes derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 312(2022).
  14. Li, Y. J., et al. Artificial exosomes for translational nanomedicine. J Nanobiotechnology. 19 (1), 242(2021).
  15. Yang, W., et al. Clinical characteristics of 310 SARS-CoV-2 Omicron variant patients and comparison with Delta and Beta variant patients in China. Virol Sin. 37 (5), 12(2022).
  16. Shapira, S., et al. A novel platform for attenuating immune hyperactivity using EXO-CD24 in COVID-19 and beyond. EMBO Mol Med. 14 (9), 15997(2022).
  17. Jang, S. C., et al. Bioinspired exosome-mimetic nanovesicles for targeted delivery of chemotherapeutics to malignant tumors. ACS Nano. 7 (9), 7698-7710 (2013).
  18. Le, T. S., et al. Quick and mild isolation of intact lysosomes using magnetic-plasmonic hybrid nanoparticles. ACS Nano. 16 (1), 885-896 (2022).
  19. Jeong, D., et al. Nanovesicles engineered from ES cells for enhanced cell proliferation. Biomaterials. 35 (34), 9302-9310 (2014).
  20. Kooijmans, S. A., et al. Display of GPI-anchored anti-EGFR nanobodies on extracellular vesicles promotes tumour cell targeting. J Extracell Vesicles. 5, 31053(2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Magnetic SeparationHigh Speed HomogenizationEndosome Derived VesiclesExosome MimicsExtracellular VesiclesNanoparticle TrackingTransmission Electron MicroscopeWestern BlottingHypotonic TreatmentMagnetic Nanoparticles

Related Articles