Приведенный здесь протокол демонстрирует быстрый и стандартизированный рабочий процесс микробиологической экспресс-оценки на месте (M-ROSE), включающий три этапа: изготовление предметного стекла, окрашивание и интерпретация. Этот протокол поможет врачам быстро принимать клинические решения.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Микробиологическая экспресс-оценка легочных инфекционных заболеваний на месте
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Своевременное начало эмпирической противоинфекционной терапии имеет решающее значение у пациентов с необъяснимой легочной инфекцией. Несмотря на то, что получение визуальных изображений в клинической практике является относительно простым процессом, его недостаточная специфичность часто требует проведения дополнительных трудоемких тестов, таких как бактериологическое исследование мокроты, культура бронхоальвеолярной жидкости или генетическое секвенирование для точного определения основной этиологии заболевания. Кроме того, ограниченная эффективность эмпирического противоинфекционного лечения может способствовать неправильному использованию антибиотиков. Последние достижения в интерпретации микробного фона на предметных стеклах с помощью экспресс-оценки на месте (ROSE) позволили клиницистам быстро получать образцы с помощью бронхоскопии (например, альвеолярного лаважа, чистки слизистой оболочки, зажима тканей), облегчая окрашивание у постели больного и интерпретацию, которая предоставляет важную информацию о микробиологическом фоне. Таким образом, это создает основу для разработки таргетного противоинфекционного лечения и индивидуальных планов лекарственной терапии. Благодаря лучшему пониманию того, какие патогены вызывают инфекции в режиме реального времени, врачи могут избежать ненужных антибиотиков широкого спектра действия, способствующих устойчивости к антибиотикам. Создание быстрого и стандартизированного рабочего процесса M-ROSE в отделениях респираторной медицины или отделениях интенсивной терапии значительно поможет врачам в формулировании точных стратегий лечения пациентов, что имеет значительные клинические последствия.
Введение
Метод экспресс-оценки на месте (ROSE) является высокоэффективным методом, используемым в области лечения легочных заболеваний. Он позволяет проводить отбор проб и диагностическое вмешательство в режиме реального времени, облегчая немедленный цитологический анализ1. Этот инновационный подход заключается в нанесении части образца ткани на предметное стекло с сохранением его целостности. Одно из ключевых преимуществ ROSE заключается в его способности способствовать оперативной интерпретации клинической информации с помощью специализированных методов микроскопии. Это включает в себя анализ морфологии клеток, классификацию, количественную оценку, определение соотношений компонентов, оценку расположения, корреляционный анализ, оценку фона и идентификацию инородных объектов. Интегрируя все эти данные с клинической информацией пациента, ROSE играет ключевую роль в оценке адекватности выборки и руководстве интервенционными процедурами и методами в режиме реального времени2.
Являясь дочерней компанией технологии ROSE, технология M-ROSE в первую очередь фокусируется на получении микробиологического фона поражений-мишеней, а не на различении доброкачественных и злокачественных клеток 3,4. С одной стороны, M-ROSE позволяет микроскопически идентифицировать патогены, такие как Aspergillus, Cryptococcus, Pneumocystis и Candida5. С другой стороны, он имеет существенное руководящее значение для оценки качества респираторных образцов, проведения различия между инфекционными и неинфекционными заболеваниями, проведения различия между инфекцией и загрязнением, а также оценки тяжести инфекции и прогноза 6,7. Например, в респираторном образце сосуществование бактерий, демонстрирующих идентичную морфологию, наряду с инфильтрирующими воспалительными клетками, указывает на инфекцию; И наоборот, присутствие множественных морфологически разнообразных бактерий, сопровождающихся эпителиальными клетками, предполагает заражение. Способность всесторонне анализировать клиническую информацию и прогнозировать исходы делает M-ROSE бесценным инструментом в лечении легочных заболеваний.
В заключение следует отметить, что РОЗА является важнейшим цитологическим носителем, который значительно повышает эффективность и точность диагностики заболеваний легких. Его многогранные возможности способствуют улучшению результатов лечения пациентов, обеспечивая своевременное вмешательство и облегчая точную диагностику с помощью методов отбора проб в режиме реального времени и диагностического вмешательства. Однако важно отметить, что эти достижения зависят от получения квалифицированных образцов. В данной работе мы представляем стандартизированный протокол M-ROSE, охватывающий подготовку предметного стекла, методы окрашивания и рекомендации по интерпретации. Этот протокол служит бесценным справочным материалом для врачей при составлении точных планов оценки и лечения, а также облегчает принятие решений относительно последующей работы с целевыми образцами.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Клиническое исследование было одобрено Комитетом по утверждению Чунцинской больницы традиционной китайской медицины (No 2022-ky-31). В типичном случае речь шла о пациенте с диагнозом пневмоцистная пневмония, и от пациента было получено информированное согласие.
1. Требования к оборудованию и материалам для ROSE
- Оборудование: Обратитесь к файлу Table of Materials для сведения об оборудовании, используемом в этом протоколе.
ПРИМЕЧАНИЕ: Использование специализированного цитологического микроскопа и системы графической визуализации является обязательным условием (Рисунок 1A). - Подготовка материала (см. Таблицу материалов).
- Приготовьте стерильные предметные стекла для клеточных культур (с сильной клеточной адгезией), абсорбирующую бумагу, неопудренные латексные перчатки, одноразовые иглы для шприцев объемом 2,5-5 мл и поместите полный набор растворов для окрашивания Diff Quik (DQ) в стеклянные банки для окрашивания с герметичными крышками для удобства работы (рис. 1).
2. Рабочий процесс M-ROSE
- Подготовка цитологических стекол
ПРИМЕЧАНИЕ: Существует множество способов подготовки слайдов, и ниже приведены несколько наиболее часто используемых методов подготовки.- Роликовые горки
ПРИМЕЧАНИЕ: Обеспечьте минимальную потерю образца ткани во время этого процесса.- Извлеките частички ткани с помощью одноразовой иглы для шприца емкостью 2,5-5 мл (рисунок 2А).
- Распределите круглую область, приблизительно 1 см в диаметре и умеренной толщины, от внутреннего до внешнего участка в одну треть окрашенного конца (конец с сильным прикреплением клеток) на стерильном цитологическом предметном стекле.
- Слайды для кистей
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод применим к образцам, полученным с использованием обычных клеточных щеток, клеточных щеток для защиты от загрязнения или ультратонких клеточных щеток, а также к полужидким образцам, таким как мокрота и вязкие жидкости организма.- Выдвиньте головку кисти и нанесите ее на дистальную треть стерильного цитологического предметного стекла (предметное стекло обладает сильными свойствами клеточной адгезии) для получения прямоугольной области размером около 2 см х 1 см с умеренной толщиной.
- Горки для распыления
- Расположите пункционную иглу на одной трети окрашенного конца стерильного цитологического предметного стекла с надежной клеточной адгезией.
- Надавите воздухом на кончик иглы для пирсинга и введите его с внутренней стороны наружу, образуя круглую область средней толщины диаметром примерно 1 см.
- Роликовые горки
- Окрашивание цитологическим стеклом
ПРИМЕЧАНИЕ: Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) рекомендует быстрое окрашивание цитологического стекла ROSE с использованием красителя Diff5. Дифференциальный краситель можно использовать повторно, но не повторять много раз. Если есть осадок, его следует процедить после использования. Слишком глубокое окрашивание может быть должным образом обесцвечено метанолом или спиртом, желательно уже не окрашенным. Если крашение слишком глубокое или слишком мелкое, время окрашивания или концентрацию рабочей жидкости следует отрегулировать; значение pH оказывает определенное влияние на окрашивание, а предметное стекло должно быть чистым и не загрязненным кислотами и щелочами. Оба раствора Diff A и Diff B являются летучими и должны быть запечатаны и храниться после использования.- Погрузите предметное стекло в раствор Diff A на 10-30 с (Рисунок 2B), затем промойте его в ванне с красителем PBS, чтобы удалить излишки раствора Diff A, и аккуратно стряхните остатки буфера (Рисунок 2C).
- Далее погрузите предметное стекло в раствор Diff B на 20-40 с (рисунок 2E).
- Наконец, очистите предметное стекло в резервуаре для окрашивания водой (Рисунок 2F), промокните и протрите остатки жидкости предметного стекла впитывающей бумагой (Рисунок 2D) и завершите окрашивание.
Примечание: M-ROSE обеспечивает прямую визуализацию патогенных микроорганизмов и облегчает оценку качества образца из дыхательных путей, позволяя различать инфекцию и неинфекцию, а также инфекцию и заражение, что имеет решающее значение для оценки тяжести инфекции и прогноза. Этот аспект будет рассмотрен в разделе обсуждения, так как он не включает в себя никаких экспериментальных процедур.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
В типичном случае 63-летний мужчина обратился в больницу с кашлем, лихорадкой и болью в груди. Ранее у пациента был диагностирован нефротический синдром, характеризующийся протеинурией и отеком, и в течение длительного времени он получал лечение преднизолоном и такролимусом. Первоначальные лабораторные данные показали количество лейкоцитов 10,49 x 109/л, количество нейтрофилов 8,87 x 109/л, концентрации С-реактивного белка в цельной крови и (1-3)-β-D-глюкана 155,81 мг/л и 249,7 пг/мл. Компьютерная т...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Интервенционная пульмонология является ценным направлением современных респираторных заболеваний; В частности, он нашел широкое применение в диагностике заболеваний легких 8,9. В последние годы диагностическая интервенционная пульмонология процветает в связи с увеличением распространенности злокачественных опухолей легких, увеличением числа лекарственно-устойчивых патогенных инфекций, возникающих в нижних дыхательных путях, и запросами на диагностику сложных и кр...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не сообщают о конфликте интересов.
Благодарности
Мы благодарны Чунцинскому научно-исследовательскому институту за финансовую поддержку в рамках проекта по стимулированию и ориентации результатов деятельности (jxyn-2021-1-15 и jxyn-2021-2-6).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Цитологический микроскоп | Olympus Corporation | CX43 | |
| Diff Quik (DQ) окрашивающие растворы | Besso Biotechnology Co. LTD | G1541 | |
| Одноразовые иглы для шприцев 2,5-5 мл | Shandong Zhu Pharmaceutical Group | 20183150304 | |
| Неопудренные латексные перчатки | Henan Yadu Industrial Co., LTD | 20182140728 | |
| Sterile cell культура горки | Jinan Preret промышленность и торговля Co., LTD | 7101 |
Ссылки
- Zhang, S., et al. Diagnostic value of endoscopic ultrasound-guided fine needle aspiration with rapid on-site evaluation performed by endoscopists in solid pancreatic lesions: A prospective, randomized controlled trial. J Gastroenterol Hepatol. 37 (10), 1975-1982 (2022).
- Bruno, P., et al. Efficacy and cost effectiveness of rapid on site examination (ROSE) in management of patients with mediastinal lymphadenopathies. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 17 (11), 1517-1522 (2013).
- Li, T., et al. Microbiology rapid on-site evaluation: a better method for Mucoid Pseudomonas Aeruginosa diagnosis in bronchiectasic patients. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 26 (5), 1738-1742 (2022).
- Tao, Y., et al. Application of microbiological rapid on-site evaluation in respiratory intensive care units: a retrospective study. Ann Transl Med. 10 (1), 7(2022).
- Yan, P., et al. The value of microbiology rapid on-site evaluation of sepsis caused by pulmonary infection. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 27 (12), 5862-5868 (2023).
- Muri, R., Trippel, M., Borner, U., Weidner, S., Trepp, R. The impact of rapid on-site evaluation on the quality and diagnostic value of thyroid nodule fine-needle aspirations. Thyroid. 32 (6), 667-674 (2022).
- Wang, Z., Shi, Y. Application of rapid on-site evaluation in contemporary pediatric interventional respiratory diseases. Chinese Journal of Practical Pediatrics. 12, 470-475 (2019).
- Shah, P. L., Herth, F. J. F. Progress in interventional pulmonology. Respiration. 95 (5), 287-288 (2018).
- Hsia, D., Musani, A. I. Interventional pulmonology. Med Clin North Am. 95 (6), 1095-1114 (2011).
- Moore, A. J., Mercer, R. M., Musani, A. I. Advances in interventional pulmonology. Clin Chest Med. 39 (1), 271-280 (2018).
- Majid, A., Fernandez-Bussy, S., Folch, E. Interventional pulmonology and solitary pulmonary nodule. Arch Bronconeumol. 54 (10), 497-498 (2018).
- Ali, M. S., Sorathia, L. Palliative care and interventional pulmonology. Clin Chest Med. 39 (1), 57-64 (2018).
- Czarnecka, K., Yasufuku, K. Interventional pulmonology: focus on pulmonary diagnostics. Respirology. 18 (1), 47-60 (2013).
- Schacht, M. J., et al. Endobronchial ultrasound-guided transbronchial needle aspiration: performance of biomedical scientists on rapid on-site evaluation and preliminary diagnosis. Cytopathology. 27 (5), 344-350 (2016).
- Pearson, L., et al. Rapid on-site evaluation of fine-needle aspiration by non-cytopathologists: A systematic review and meta-analysis of diagnostic accuracy studies for adequacy assessment. Acta Cytol. 62 (4), 244-252 (2018).
- Arimura, K., et al. Cryobiopsy with endobronchial ultrasonography using a guide sheath for peripheral pulmonary lesions and DNA analysis by next generation sequencing and rapid on-site evaluation. Respir Investig. 57 (2), 150-156 (2019).
- Gianella, P., et al. Utility of rapid on-site cytologic evaluation during endobronchial ultrasound-guided transbronchial needle aspiration in malignant and nonmalignant disease. Acta Cytol. 62 (5-6), 380-385 (2018).
- Natella, V., Cozzolino, I., Sosa Fernandez, L. V., Vigliar, E. Lymph nodes fine needle cytology in the diagnosis of infectious diseases: clinical settings. Infez Med. 20, 12-15 (2012).
- Baughman, R. P., Spencer, R. E., Kleykamp, B. O., Rashkin, M. C., Douthit, M. M. Ventilator associated pneumonia: quality of nonbronchoscopic bronchoalveolar lavage sample affects diagnostic yield. Eur Respir J. 16 (6), 1152-1157 (2000).
- Petrone, M. C., et al. Does cytotechnician training influence the accuracy of EUS-guided fine-needle aspiration of pancreatic masses. Dig Liver Dis. 44 (4), 311-314 (2012).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
