Использование анализа расщепления под мишенями и тегирования (CUT&Tag) в исследовании миобластов мышей

Краткое содержание

Исследователи, не знакомые с эпигенетической областью, обнаружат, что CUT&Tag является значительно более простой альтернативой анализам ChIP. Система CUT&Tag оказала огромную пользу эпигенетическим исследованиям редких и первичных клеточных популяций, получив высококачественные данные из очень небольшого числа клеток. Этот протокол описывает проведение анализов H3K4me1 CUT&Tag на мышиных миобластах, выделенных из мышц задних конечностей мыши.

Аннотация

Этот документ по протоколу направлен на то, чтобы предоставить новым исследователям полную информацию об использовании технологии Cleavage Under Targets and Tagmentation (CUT&Tag) для профилирования геномных мест связывающих хроматин-связывающих факторов, меток гистонов и вариантов гистонов. Протоколы CUT&Tag очень хорошо работают с мышиными миобластами и свежевыделенными мышечными стволовыми клетками (MuSC). Они могут быть легко применены ко многим другим типам клеток, при условии, что клетки могут быть иммобилизованы шариками Конканавалина-А. По сравнению с CUT&Tag, иммунопреципитация хроматина (ChIP) является трудоемким экспериментом. Анализы ChIP требуют предварительной обработки хроматина перед тем, как хроматический материал можно будет использовать для иммунопреципитации. При сшивании ChIP (X-ChIP) предварительная обработка хроматина включает в себя сшивку и ультразвук для фрагментации хроматина. В случае нативного ChIP (N-ChIP) фрагментированные хроматины обычно достигаются путем расщепления микрококковой нуклеазы (MNase). Как ультразвуковая терапия, так и переваривание MNазы вносят некоторую предвзятость в эксперименты с ChIP. Анализы CUT&Tag могут быть завершены за меньшее количество этапов и требуют гораздо меньшего количества клеток по сравнению с ChIP, но обеспечивают более объективную информацию о факторах транскрипции или метках гистонов в различных геномных местах. CUT&Tag может работать всего с 5 000 ячеек. Благодаря более высокой чувствительности и более низкому фоновому сигналу по сравнению с ChIP, исследователи могут рассчитывать на получение надежных пиковых данных всего за несколько миллионов прочтений после секвенирования.

Введение

Тест CUT&Tag был изобретен для компенсации некоторых явных недостатков ChIPs¹. Двумя основными недостатками ChIPs являются: 1) смещение, возникающее при фрагментации хроматина, и 2) неспособность работать с малым числом клеток. Анализы X-ChIP основаны либо на ультразвуковом расщеплении, либо на расщеплении MNазы для получения фрагментов хроматина, в то время как N-ChIP в основном использует расщепление MNазы для получения нуклеосом. Ультразвуковая обработка показывает смещение в сторону ослабленных мест расположения хроматина, таких как промоторные области², и, по-видимому, переваривание МНазы также более эффективно работает на расслабленных волокнах хроматина. Более того, некоторые сообщили, что расщепление MNазы также показывает смещение, зависящее от последовательности ДНК³. Таким образом, на этапе подготовки входных данных анализов ChIP невозможно получить фрагменты хроматина из всех видов геномных участков совершенно случайным образом. Кроме того, анализы ChIP обычно генерируют более высокие фоновые сигналы по сравнению с CUT&Tag и требуют более чем в 10 раз больше прочтений, чем CUT&Tag, чтобы подчеркнуть, где находятся пики ^1,4,5. Это объясняет, почему эксперименты с ChIP должны начинаться с гораздо большим количеством клеток, чем в CUT&Tag. Это не является проблемой при изучении клеточных линий, поскольку они могут многократно проходить для достижения очень высокого числа клеток. Тем не менее, анализ ChIP определенно не является сильным эпигенетическим инструментом для изучения редких или ценных популяций первичных клеток, хотя первичные клетки, очевидно, имеют более практическое и медицинское значение.

В то время как длительная и сложная процедура ChIP отпугивает некоторых исследователей от изучения или использования этого метода, люди более комфортно чувствуют себя с более простыми анализами, такими как иммуноцитохимия (ICC) или иммунофлуоресценция (IF). Анализ CUT&Tag по сути напоминает процесс экспериментов ICC и IF, но проводится только в пробирке. CUT&Tag не нуждается в фрагментированном хроматине, а вместо этого геном должен быть интактным для связывания антител¹. В первый день эксперимента ChIP исследователи обычно тратят до 4 часов на подготовку фрагментированных хроматинов из ядер с помощью ультразвука или МНазы, прежде чем короткие кусочки хроматина могут быть смешаны с антителами-гранулами ^4,5. В отличие от этого, рабочая нагрузка первого дня процедуры CUT&Tag заключается в том, чтобы просто обездвижить клетки до гранул Конканавалина-А, а затем добавить первичное антитело к клеточным гранулам. Для этого требуется всего ~40 мин¹.

Стоит отметить, что расщепление под мишенями и высвобождение с использованием нуклеазы (CUT&RUN) является важной альтернативой CUT&TAG. CUT&RUN был создан на основе того же рабочего механизма, что и CUT&TAG. В CUT&TAG антитела направляют транспоназу pA/G-Tn5 во все места, где каждый фермент вырезает кусок хроматина и тем временем помечает его адаптерами для создания библиотек, в то время как в CUT&RUN роль pA/G-Tn5 играет pA/G-MNase, которая выполняет только режущую часть работы⁶. Таким образом, по сравнению с CUT&Tag, CUT&RUN требует дополнительного этапа, который заключается в приклеивании адаптеров, создающих библиотеку, к фрагментированным фрагментам ДНК pA/G-MNase ^7,8. Благодаря большому сходству между CUT&Tag и CUT&RUN, исследователи, знакомые с CUT&TAG, легко адаптируются к профессиональному выполнению CUT&RUN. Тем не менее, следует отметить, что между CUT&Tag и CUT&RUN существуют некоторые незначительные различия. В протоколах CUT&RUN обычно используется физическая концентрация соли (~150 мМ) на этапах промывки, в то время как в CUT&TAG буфер для промывки 300-Dig имеет высокое содержание соли. Таким образом, CUT&Tag хорошо контролирует фон при профилировании гистоновых меток/вариантов или факторов транскрипции, поскольку эти белки напрямую и прочно связываются с ДНК¹. CUT&Tag может столкнуться с проблемами при профилировании хроматин-ассоциированных факторов, которые не связываются напрямую с ДНК и демонстрируют слабое сродство к хроматину. Этапы промывки с высоким содержанием соли в CUT&Tag могут удалять факторы, связанные с хроматином, и не вызывать никаких сигналов на выходе. Несмотря на то, что существуют успешные случаи, когда CUT&Tag может быть использован для профилирования некоторых белков, не содержащих гистон и нетранскрипционный фактор⁹, мы все же рекомендуем использовать CUT&RUN вместо CUT&Tag для профилирования слабо связанных хроматин-ассоциированных белков.

После того, как млекопитающие достигают взрослого возраста, их скелетные мышечные ткани все еще содержат мышечные стволовые клетки. Во время мышечной травмы эти стволовые клетки могут быть активированы и подвергнуться увеличению и дифференцировке клеток для^{регенерации} поврежденных мышечных волокон. Эти стволовые клетки известны как мышечные стволовые/сателлитные клетки (MuSCs). После того, как MuSC выделены у животных или активированы при мышечной травме, они начинают пролиферировать и становятся миобластами.

Для получения MuSC из переваривания скелетных мышц мышей поверхностные маркеры MuSC, такие как Vcam1 (Cd106), Cd34 и α7-интегрин (Itga7), часто используются по отдельности или в комбинациях для обогащения MuSC во время флуоресцентно-активируемой сортировки клеток (FACS)¹¹. Было показано, что Cd31^-/Cd45^-/Sca1^-/Vcam1⁺ является, вероятно, лучшей комбинацией маркеров для получения >95% чистых MuSCs¹². FACS может выделять чистые MuSC сразу после переваривания свежих мышц. Однако, если в экспериментальном дизайне не требуются чистые MuSC непосредственно при их выделении, предварительное покрытие является более экономически эффективным, чем FACS, для получения >90% чистых миобластов (потомство MuSC).

MuSC, только что выделенные от мышей, не пролиферируют эффективно в среде F10 Хама, дополненной фетальной бычьей сывороткой (FBS). Чтобы лучше увеличить количество клеток MuSCs и получить достаточное количество миобластов, вместо FBS следует использовать сыворотку роста крупного рогатого скота (BGS). Однако, если BGS недоступна, полную среду F10 Ham (содержащую около 20% FBS) можно смешивать с равным объемом Т-клеточной условной среды для значительного увеличения миобласта¹³. Таким образом, в данном протоколе будет также описано получение Т-клеточных сред, кондиционированных MuSC.

Самое главное, что этот протокол представляет собой полный пример проведения анализов H3K4me1 CUT&Tag на мышиных миобластах, выделенных из мышц задних конечностей мыши. Обратите внимание, что этот протокол также применяется к другим типам клеток, гистоновым меткам и вариантам гистонов, и читателям необходимо оптимизировать только количество клеток или антител для своих случаев на основе обогащения конкретных гистоновых меток или вариантов, которые они изучают.

Для использования в CUT&Tag или CUT&RUN Tn5 или MNaза должна быть слита с белком A или белком G для получения pA-Tn5, pG-Tn5, pA-MNase или pG-MNase. По-видимому, и белок А, и белок G могут быть слиты с этими ферментами одновременно для получения pA/G-Tn5 или pA/G-MNase. Белок А и белок G демонстрируют дифференциальное сродство к IgG разных видов. Таким образом, слияние белка А и белка G с ферментом может решить эту проблему и сделать фермент совместимым с антителами нескольких видов.

Протокол

Все методы, представленные в этой рукописи, одобрены Комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию лаборатории в Гуанчжоу. Мыши, использованные для получения репрезентативных результатов этой рукописи, содержались и содержались в соответствии с руководящими принципами Комитета по уходу за животными и их использованию лаборатории в Гуанчжоу.

1. Выделение миобласта из мышц задних конечностей мыши (Пример использования 1 мыши)

1. Разведите ледяную уксусную кислоту с ddH₂O до 0,02 М и автоклавируйте ее.
2. Разбавьте коллаген (из крысиного хвоста) до 0,1 мг/мл 0,02 М уксусной кислотой.
3. Добавьте этот раствор коллагена в чашки для культивирования, чтобы покрыть дно чашки в клеточном инкубаторе с температурой 37 °C на ночь.
4. Перед применением удалите раствор коллагена и дважды вымойте посуду с 1x PBS. Раствор коллагена можно использовать повторно в течение 8-10 раз.
5. Принесите в жертву мышь в возрасте 8-12 недель. (У старых мышей низкий выход MuSCs и миобластов.)
6. Изолируйте и поместите все мышцы задних конечностей мыши в 10-сантиметровую посуду.
7. Используйте 1x PBS (с пенициллином/стрептомицином) для полоскания мышц 4 раза. После каждого полоскания всегда перекладывайте мышцы в новую тарелку.
8. После окончательного полоскания удалите PBS и измельчите мышцы ножницами.
9. Добавьте 6 мл 1x PBS, содержащей диспазу II (1,1 Ед/мл) и коллагеназу II (830 Ед/мл) для переваривания измельченных мышц, и переваривание должно длиться ~1,5 часа.
10. Чтобы выполнить пищеварение, переложите измельченные мышцы в трубку на водяной бане при температуре 37 °C или сразу оставьте измельченные мышцы внутри чашки и поместите ее в инкубатор с_CO2 при температуре 37 °C.
11. Если для переваривания используется клеточный инкубатор, покачивайте чашку каждые 15-30 минут, чтобы хорошо перемешать пищеварение.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Диспаза II должна быть сначала изготовлена в виде 11 Ед/мл в виде 11 Ед/мл в среде DMEM (без сыворотки), а коллагеназа II должна быть изготовлена в виде 10 000 Ед/мл в 1x PBS.
12. Когда пищеварение будет завершено, используйте пластиковую пипетку объемом 10 мл, чтобы несколько раз промыть переваренные ткани вверх и вниз, чтобы полностью гомогенизировать смесь для сбраживания.
13. Добавьте 10 мл питательной среды MuSC/Myoblast для замедления пищеварения. Подробную информацию о приготовлении питательных сред MuSC/Myoblast можно найти в разделе 2.
14. Пропустите смесь через ситечко толщиной 70 мкм. Используйте 1x PBS для промывки пищеварительной пластины и пропустите этот PBS через ситечко, чтобы собрать все клетки в пищеварительной пластине.
15. Центрифугируйте при давлении 350 x g в течение 10 минут и выбросьте надосадочную жидкость с помощью вакуума.
16. Повторно суспендируйте клеточную гранулу 20 мл 1x PBS и пропустите клетки через сетчатое фильтр 40 мкм.
17. Центрифугируйте при 350 x g в течение 5 минут и удалите надосадочную жидкость с помощью вакуума.
18. Используйте 20 мл питательной среды MuSC/Myoblast для ресуспендирования клеток и засейте клетки в 10-сантиметровую обычную пластиковую пластину. В течение этого времени MuSC не могут прикрепляться к дну пластины и остаются плавающими в основном в среде.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это первое предварительное покрытие пластиковых пластин.
19. Через 1,5 ч ненадолго покачайте тарелку и перелейте жидкость в две покрытые коллагеном 10-сантиметровые чашки, каждая чашка содержит 10 мл культуры. Теперь MuSC будут прикрепляться и расти на пластинах, покрытых коллагеном. Смените носитель через 2 дня. Пластины, покрытые коллагеновой оболочкой, подготавливаются в соответствии с пунктами 1-4 настоящего раздела.
20. Через следующий день проведите клетки: удалите среду, промойте клетки один раз 1x PBS и трипсинизируйте клетки.
21. Используйте питательную среду MuSC/Myoblast, чтобы смыть клетки с планшетов, переместите клетки на новую пластиковую пластину и инкубируйте в клеточном инкубаторе в течение 40 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это второе предварительное покрытие пластиковых пластин.
22. Пересыпьте культуру в новую пластиковую пластину и выдержите в клеточном инкубаторе еще 20 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это уже третье предварительное покрытие пластиковых пластин.
23. Затем разделите надосадочную жидкость в тарелке на 8 покрытых коллагеном 10-сантиметровых чашек для субкультивирования клеток. Соотношение проходимости здесь составляет 2:8 (1:4). После трехкратного предварительного покрытия, описанного выше, чистота миобластов может достигать более 90%. Таким образом, после этого момента нет необходимости в предварительном планшетировании при дальнейшем прохождении миобластов.

2. Приготовление питательных сред MuSC/Myoblast (Пример приготовления от 5 мышей)

1. Принесите в жертву 5 молодых и здоровых мышей дикого типа, изолируйте селезенку и промойте селезенку один раз 1x PBS (с пенициллином/стрептомицином).
2. С помощью ножниц удалите темные части/пятна на селезенке, если таковые имеются. Выбросьте селезенку, если большая ее часть почернела.
3. Поместите все 5 селезенок в ситечко размером 40 мкм в верхней части пробирки объемом 50 мл.
4. Откройте стерильную упаковку шприца объемом 1 мл, вытащите поршень и выбросьте бочку.
5. В ситечке 40 мкм держите резиновую пробку и используйте упор для большого пальца поршня, чтобы измельчить и диссоциировать ткани селезенки на отдельные клетки. Будьте осторожны, чтобы не прикоснуться к упору большого пальца поршня и не загрязнить его при вскрытии упаковки шприца.
6. Измельчая селезенку, время от времени используйте 1x PBS, чтобы смыть диссоциированные клетки селезенки в трубку объемом 50 мл под ситечком.
7. После того, как все клетки селезенки были промыты в пробирку объемом 50 мл через ситечко, центрифугируйте пробирку при давлении 500 x g в течение 10 минут.
8. Используйте 1 мл 1x буфера для лизиса эритроцитов для ресуспендирования гранулы. Лизируйте эритроциты в течение ~1 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: 10x Буфер для лизиса эритроцитов содержит 155 мМ NH₄Cl, 10 мМ NaHCO₃ и 1 мМ ЭДТА динатриевой соли в ddH₂O. Отфильтруйте для стерилизации и не автоклавируйте. Разбавьте ddH_{от 2}до 1x перед использованием.
9. Заполните пробирку объемом 50 мл 1x PBS, чтобы остановить процесс лизирования эритроцитов.
10. Снова процедите клеточную суспензию с помощью ситечка с температурой 40 мкм, а затем центрифугируйте при давлении 500 x g в течение 10 минут.
11. Ресуспендирование клеток 2 мл полной среды RPMI-1640 (среда RPMI-1640 с 10% FBS и пенициллином/стрептомицином) с помощью очень щадящего пипетирования.
12. Добавьте в пробирку еще немного фильтрующего материала RPMI-1640 и хорошо перемешайте. Распределите клеточную суспензию по десяти колбам для культур Т75. Конечный объем культуры в каждой колбе для культур T75 должен составлять 20 мл.
13. Добавьте 10 мкл бульона Конканавалина-А в каждую колбу для культур T75 и хорошо перемешайте. Конканавалин-А активирует пролиферацию Т-клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Конканавалина-А содержит 4 мг/мл и получен путем растворения конканавалина-А в 1x PBS. Здесь используется сам Concanavalin-A, и не путайте его с бусинами Concanavalin-A, используемыми в анализах CUT&Tag позже.
14. Через 48 часов добавьте в каждую колбу T75 еще 20 мл полной среды RPMI-1640, чтобы общий объем составил 40 мл.
15. Через 24 часа соберите всю культуру в каждую колбу T75 и центрифугируйте при 600 x g в течение 3 минут.
16. Надосадочная жидкость представляет собой условную среду с Т-клетками и может храниться при температуре от -20 °C до -80 °C до 2 месяцев. Выбросьте гранулы клеток селезенки. Перед применением следует разморозить условный фильтрующий материал для Т-клеток и дополнительно простерилизовать фильтр с помощью фильтра 0,22 мкм.
17. Чтобы сделать Ham's F10 полноценной средой, добавьте 100 мл FBS, 300 мкл bFGF и 6 мл пенициллина/стрептомицина в 500 мл среды Ham's F10.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Исходный запас bFGF составляет 5 г/мл и получен путем растворения bFGF в среде F10 Хама.
18. Смешайте полную среду F10 от Ham's с отфильтрованной Т-клеточной условной средой, описанной выше, в соотношении 1:1 для получения питательной среды MuSC/Myoblast.

3. CUT&Tag с миобластами (Пример 3 реакций CUT&Tag)

1. Приготовление ключевых реагентов
   1. Очистите транспозазу pA/G-Tn5 в домашних условиях из бактериальной культуры с использованием опубликованного метода¹⁴. Этот фермент достигает своей функциональной формы только до тех пор, пока на него не будут установлены ДНК-адаптеры, создающие библиотеки. Самое главное, что pA/G-Tn5 коммерчески доступен из многих источников.
   2. Олигопласты для изготовления адаптеров показаны в таблице 1. В частности, отжиг Oligo-Rev с Oligo-A и Oligo-B соответственно, чтобы получить двухцепочечные Adaptor-A и Adaptor-B соответственно. Детали отжига для изготовления адаптеров можно найти в другом месте¹⁴.
   3. Инкубируйте Адаптер-А и Адаптер-В с транспозазой pA/G-Tn5 при комнатной температуре (ОТ) в течение 2 ч. Затем этот транспозаза примет свою функциональную форму. В следующих разделах данной рукописи функциональная форма pA/G-Tn5 будет называться pA/G-Tn5a.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если pA/G-Tn5 приобретен, а не изготовлен на собственном производстве, обязательно уточните, является ли купленный товар pA/G-Tn5 смонтированным с адаптерами (другими словами, готовым к использованию) или это просто сам фермент pA/G-Tn5. Если речь идет только о ферменте, подготовьте два адаптера, описанные выше, и установите их на pA/G-Tn5, прежде чем окончательно использовать этот фермент для CUT&Tag.
   4. Рецепты буфера для связывания, буфера для промывки, буфера для выкапывания-промывки, буфера 300-Dig и буфера для маркировки читатели также могут обратиться к Kaya-Okur et ^al.1.
   5. Приготовьте связывающий буфер, который содержит 20 мМ HEPES pH 7,5, 10 мМ KCl, 1 мМ CaCl₂ и 1 мМ MnCl₂.
   6. Приготовьте буфер для промывки, который содержит 20 мМ HEPES pH 7,5, 150 мМ NaCl, 0,5 мМ спермидина и 1x коктейль ингибиторов протеазы.
   7. Получите дигитонин в виде концентрированного запаса в ДМСО, а затем приготовьте буфер Dig-Wash, добавив дигитонин в буфер Wash до концентрации 0,5 мг/мл.
   8. Приготовьте буфер антител путем добавления ЭДТА в концентрации 2 мМ и БСА в концентрации 0,1%, в буфер Dig-wash.
   9. Приготовьте буфер 300-Dig, содержащий 20 мМ HEPES pH 7,5, 300 мМ NaCl, 0,5 мМ спермидина, 1x коктейль ингибиторов протеазы и 0,1-0,5 мг/мл дигитонина.
   10. Подготовьте буфер для маркировки, дополнив буфер 300-Dig 10 мМ MgCl₂. MgCl₂ может активировать ферментативную активность pA/G-Tn5a.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Информация по другим материалам представлена в файле Table of Materials .
2. Активация шариков Concanavalin-A
   1. Смешайте 30 мкл гранул конканавалина-А (10 мкл на каждую реакцию) с 300 мкл связывающего буфера в центрифужной пробирке объемом 1,5 мл. Переверните несколько раз, чтобы хорошо перемешать. Поместите трубку на магнитную решетку. После того, как жидкость станет прозрачной, удалите надосадочную жидкость.
   2. Извлеките пробирку из магнитного штатива, добавьте в пробирку 300 мкл связующего буфера, хорошо перемешайте и равномерно разделите на 3 пробирки полосой по 8 ПЦР. Обозначьте каждую пробирку с помощью одной реакции CUT&Tag.
   3. Поместите полоску для пробирки 8-PCR на магнитный штатив и подождите, пока жидкость не станет прозрачной.
   4. Отсадите надосадочную жидкость и извлеките трубки из магнитной стойки. Добавьте 10 μL связующего буфера в каждую пробирку и хорошо перемешайте. Поместите подготовленные бусины на лед или при температуре 4 °C, пока ячейки не будут готовы к работе.
3. Связывание клеток с шариками Конканавалина-А
   1. Трипсинизируйте культивируемые мышиные миобласты с планшетов, промойте клетки один раз с помощью RT 1x PBS и в конечном итоге повторно суспендируйте клетки в буфере для промывки при RT. Избегайте чрезмерной трипсинизации, так как это может нарушить сродство клеточной мембраны к гранулам конканавалина-А.
   2. Отрегулируйте плотность клеток примерно до 7 x 10⁵ клеток/мл в буфере Wash таким образом, чтобы 100 мкл клеточной суспензии содержали примерно 70 000 клеток, что достаточно для одной реакции CUT&Tag.
   3. Пипет 100 мкл клеточной суспензии в каждую пробирку с 8-ПЦР пробиркой, в которой уже содержится 10 мкл приготовленных шариков Конканавалина-А. Хорошо перемешайте и выдержите в шейкере «качели движения» в течение 10 минут при RT.
   4. Положите полоску из пробирки 8-PCR на магнитный штатив. Подождите, пока он очистится, и удалите надосадочную жидкость.
   5. Чтобы оценить, эффективно ли гранулы конканавалина-А изолировали клетки, проверьте надосадочную жидкость под микроскопом, чтобы увидеть, сколько клеток осталось в надосадочной жидкости. После этапа связывания бусин Конканавалина-А в надосадочной жидкости должно наблюдаться очень мало клеток или их отсутствие.
4. Инкубация клеток с первичным антителом
   1. Для каждого образца разведите 1 мкл антитела H3K4me1 в 50 мкл буфера для антител и добавьте разведенное антитело в каждую пробирку с образцом. Хорошо перемешайте шарики с разведенным антителом, несколько раз перевернув пробирки. Поместите образцы на шейкер «качели с движением» для инкубации при температуре 4 °C в течение ночи.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как упоминал д-р Стивен Хеникофф¹, не было необходимости использовать отрицательный контроль IgG во всех анализах CUT&Tag. По сравнению с ChIP, анализы CUT&Tag имеют гораздо более низкий фоновый сигнал или вообще не имеют его. Таким образом, использование IgG для проведения анализа CUT&Tag с «отрицательным контролем» не дает никакой полезной информации. Напротив, использование антител, валидированных CUT&Tag, для проведения положительного контроля важно для оценки того, сработал ли анализ CUT&Tag.
5. Инкубация клеток с вторичным антителом
   1. На следующий день утром поместите образцы на магнитную стойку и подождите, пока образцы не исчезнут.
   2. Удалите надосадочную жидкость, которая является первичным антителом. Нет необходимости мыть бусины; Непосредственно добавьте 50 мкл разбавленного (1:100) вторичного антитела в каждую пробирку с образцом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вторичное антитело разбавляют буфером Dig-wash в соотношении 1:100. Чтобы обеспечить более эффективное распознавание pA/G-Tn5a, вторичные антитела не следует конъюгировать с какими-либо молекулами или группами, такими как HRP, биотин или флуорофоры.
   3. Хорошо перемешайте и выдержите в шейкере «качели движения» при температуре RT в течение 1 часа.
   4. Поместите образцы обратно на магнитный штатив, подождите, пока образцы очистятся, и выбросьте надосадочную жидкость.
   5. Добавьте 200 μL буфера Dig-wash в каждую пробирку и переверните несколько раз, чтобы смыть излишки антител.
   6. Положите его обратно на магнитную стойку, подождите, пока он очистится, и удалите надосадочную жидкость. Повторите это промывание еще дважды, чтобы полностью удалить излишки несвязанных антител.
6. Инкубация клеток с pA/G-Tn5a
   1. После последней промывки поместите образцы на магнитную стойку, подождите, пока образцы очистятся, и удалите всю жидкость из пробирки. Для каждой пробирки с образцом добавьте 100 μL буфера 300-Dig, содержащего pA/G-Tn5a в концентрации 0,04 μM. Хорошо перемешайте и инкубируйте на качателе в течение 1 ч при RT.
   2. Положите на магнитную решетку. Подождите, пока образцы очистятся, и удалите надосадочную жидкость.
   3. Добавьте 200 μL буфера 300-Dig в каждый образец, хорошо перемешайте и поместите в шейкер для промывки образца на 3 минуты при RT.
   4. Положите на магнитную решетку. Подождите, пока образцы очистятся, и удалите надосадочную жидкость. Повторите эту стирку еще дважды, чтобы удалить излишки pA/G-Tn5a и опустить фон.
7. Расщепление и маркировка геномов
   1. После последней промывки поместите образцы на магнитный штатив и тщательно отпижите жидкость из пробирки. Для каждого образца добавьте 50 μL буфера Tagmentation. Хорошо перемешать и инкубировать в ПЦР-аппарате при 37 °C в течение 1 ч. Не используйте функцию нагрева крышки ПЦР-машины.
      ПРИМЕЧАНИЕ: По желанию, из-за износа материала во время следующей стадии очистки геномной ДНК, некоторые ДНК с шипами могут быть добавлены в буфер для тегирования, чтобы всплеск проявился в окончательных результатах секвенирования и мог быть использован для нормализации данных. Способ получения и использования спайковой ДНК можно найти в другом месте¹⁴.
8. Полная очистка геномной ДНК
   1. После мечения добавьте еще 150 мкл буфера Tagmentation для каждого образца. Общий объем теперь составляет 200 μл.
   2. Затем для каждого образца добавьте 10 мкл 0,5 М ЭДТА, 3 мкл 10% SDS и 2,5 мкл 20 мг/мл протеиназы K. Vortex, чтобы хорошо перемешать и инкубировать при 55 ^°C в течение 2 ч.
   3. Каждый образец нанесите в 200 мкл фенола/хлороформа в центрифужную пробирку объемом 1,5 мл и переведите в вихрь в течение 10 с. Центрифугируйте при давлении 18 000 x g в течение 5 минут. Переложите верхний слой в новую центрифужную пробирку объемом 1,5 мл.
   4. Добавьте по 200 μл хлороформа в каждую пробирку и сделайте вихрь в течение 10 с. Центрифугируйте при давлении 18 000 x g в течение 5 минут.
   5. Аспирируйте верхний слой в новую центрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Затем для каждого образца добавьте 550 мкл 100% этанола, чтобы осаждать ДНК при -80 °C в течение 1 ч. Чтобы лучше визуализировать гранулу ДНК, добавьте 1 мкл 20 мг/мл гликогена.
   6. Центрифугируйте на максимальной скорости (>18 000 x g) в течение 15 минут, чтобы гранулировать ДНК.
   7. Осторожно слейте надосадочную жидкость, промойте гранулу гликогена/ДНК с 75% этанолом один раз и снова центрифугируйте на максимальной скорости в течение 5 минут.
   8. Удалите 75% этанола и повторно суспендируйте гранулу гликогена/ДНК с 21 мкл ddH₂O.
9. Подготовка библиотеки и секвенирование
   1. Настройте ПЦР-подготовку библиотеки. Чтобы проиндексировать образцы, которые необходимо секвенировать, используйте отдельный праймер N7XX Illumina для каждого образца и универсальный праймер N5XX Illumina. Если индексируется более 12 образцов, то потребуются и разные праймеры N5XX Illumina. Illumina предлагает двенадцать грунтовок N7XX и восемь грунтовок N5XX, таким образом, общее количество комбинаций N7XX с N5XX составляет 12 x 8 = 96. Настройка реакции ПЦР приведена в таблице 2.
   2. Ориентировочно определите номер цикла ПЦР в библиотечно-подготовительной ПЦР по номеру ячейки, используемой в анализе CUT&Tag. Как правило, для анализа CUT&Tag с использованием 50 000-100 000 клеток вполне достаточно 9-12 циклов, а для количества клеток от 10 000 до 50 000 может потребоваться до 14 циклов. Программа ПЦР представлена в таблице 3.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для большинства анализов CUT&Tag, если антитело функционирует правильно, то номер цикла ПЦР от 9 до 14 всегда должен генерировать полезную библиотеку для секвенирования. Хорошая библиотека обычно имеет концентрацию 10-50 нг/мкл (определяется с помощью анализа кубитов) и 20-30 мкл по объему. И наоборот, если антитело не работало эффективно и специфично, то простое увеличение числа циклов не может спасти эксперименты. Чрезмерное количество циклов никак не влияет на результаты, а вместо этого приводит к увеличению количества дубликатов ПЦР, что впоследствии усложнит анализ данных.
   3. Используйте некоторые коммерчески доступные шарики для очистки/выбора размера ДНК для очистки библиотечной ДНК и выбора ДНК желаемых размеров.
   4. Разбавьте небольшую аликвоту очищенной библиотеки водой и используйте ее для количественной ПЦР с локус-специфичными праймерами для проверки обогащения, как в экспериментах ChIP-qPCR. Прежде чем выполнять секвенирование библиотеки, это может помочь определить, работает ли CUT&Tag.
   5. Выполняйте секвенирование и анализ данных в соответствии с инструкциями производителя.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Наборы CUT&Tag коммерчески доступны в нескольких компаниях, и один из примеров можно найти в файле Table of Materials .

Результаты

Прежде чем связывать клетки с шариками Конканавалина-А, проверьте клеточную суспензию под микроскопом. Соответственно, после инкубации клеток с шариками Конканавалина-А пробирки с образцами помещают на магнитный штатив, а надосадочную жидкость следует снова наблюдать с помощью микроскопа. Это необходимо для того, чтобы оценить, насколько эффективно клетки были захвачены шариками Конканавалина-А. Промывочный буфер, содержащий 7 x 10⁵ клеток/мл, должен выглядеть под микроскопом, как показано на рисунке 1А . В отличие от этого, на рисунке 1B показан надосадочная жидкость после связывания бусин Конканавалина-А, где шарики забрали все клетки. Нет смысла переходить к следующим шагам CUT&Tag, если бусины Concanavalin-A даже не захватывают ячеек эффективно. Промывочный буфер не должен содержать сыворотки или ЭДТА/ЭГТА, так как они могут отменить связывание клеточной мембраны с гранулами Конканавалина-А. Бычий сывороточный альбумин, однако, не препятствует связыванию конканавалина-А с клетками.

После создания библиотек CUT&Tag методом ПЦР небольшую аликвоту библиотеки (3-4 мкл) можно электрофорировать на 1,2-1,5% агарозном геле, чтобы проверить, является ли библиотека хорошей. На рисунке 2 показан пример успешно созданных нами библиотек H3K4me1 CUT&Tag. В гистоновой марке или варианте гистона CUT&Tag большинство расщепленных единиц, по-видимому, являются мононуклеосомами, хотя две нуклеосомы также могут быть вырезаны вместе. Три нуклеосомы, разрезанные и помеченные вместе, были бы очень редкими. Следовательно, в электрофорезе библиотек CUT&Tag с гистоновыми марками следует наблюдать массив нуклеосом, содержащий мононуклеосомы, динуклеосомы и очень небольшое количество тринуклеосом. Нуклеосомы содержат 147.о. ДНК, но с учетом адаптеров секвенирования, добавленных с помощью транспозазы Tn5 и библиотечной ПЦР, общий размер мононуклеосомы CUT&Tagged должен составлять 300.о., как показано на рисунке 2.

Прежде чем тратить деньги на высокопроизводительное секвенирование библиотек CUT&Tag, еще одним методом контроля качества является проведение количественной ПЦР с локус-специфичными праймерами. Это эквивалентно проведению ChIP-qPCR. Кроме того, локус-специфичные праймеры в CUT&Tag qPCR разработаны на основе тех же принципов, что и праймеры ChIP-qPCR. На рисунке 3 показана кПЦР-амплификация различных локализаторов в локусе гена Myod1. Myod1 кодирует мастер-фактор транскрипции, MyoD, который определяет линию скелетных мышц во время миогенеза¹⁵. Как показано на рисунке 3, H3K4me1 обладает высокой степенью обогащения в энхансере ядра (CER) и дистальной регуляторной области (DRR) локуса Myod1. CER и DRR являются очень хорошо известными энхансерными областями для Myod1¹⁶. Это согласуется с хорошо задокументированным фенотипом, согласно которому H3K4me1 специфически маркирует введенные в эксплуатацию усилители¹⁷. Кроме того, на рисунке 3 показано, что уровень H3K4me1 очень низок в проксимальной регуляторной области (PRR), поскольку нуклеосомы в проксимальной области активных промоторов обычно модифицируются H3K4me3¹⁸ вместо H3K4me1. Все пары праймеров для этих оцениваемых локусов ранее были опубликованы^19,20, а последовательности можно найти в таблице 4. Как правило, после контроля качества с помощью библиотечного электрофореза ДНК и количественной ПЦР на конкретных локусах исследователи могут с уверенностью приступить к секвенированию.

Рисунок 1: Ресуспендирование Myoblasts в буфере Wash. Микроскопические снимки сделаны (А) до и (В) после связывания бусин Конканавалина-А. На панели B показано, что после инкубации гранул конканавалина-А в суспензии почти не осталось клеток, что указывает на то, что клетки были эффективно захвачены шариками. Мелкие частицы на панели В, вероятно, являются избыточным содержанием гранул конканавалина-А. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Электрофорез библиотек CUT&Tag. Были проведены три независимых анализа H3K4me1 CUT&Tag, и каждый из них был преобразован в библиотеку секвенирования с использованием праймеров Illumina и ПЦР. В каждом H3K4me1 CUT&Tag использовалось 70 000 мышиных миобластов. Библиотеки в основном содержат меченые мононуклеосомы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Амплификация количественной ПЦР различных локализаций в локусе гена Myod1 . КПЦР показала, что в мышиных миобластах метка H3K4me1 сильно обогащена в энхансерных областях гена Myod1 , что согласуется с опубликованными выводами. CER и DRR являются опубликованными энхансерами Myod1 , которые расположены выше промотора Myod1 . Обратите внимание, что в ПРР отсутствует накопление H3K4me1, и это также согласуется с тем, что активные промоторы в основном маркируются H3K4me3. Обогащения рассчитывали путем нормализации к обогащению H3K4me1 на «генной пустыне» образца «Повтор 1». Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Имя	Последовательности (5'-3'):
Олиго-Рев	фос-CTGTCTCTTATACACATCT
Олиго-А	TCGTCGGCAGCGTCAGATGTATAAGACAG
Олиго-Б	GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTTATATAAGACAG

Таблица 1: Олигопоследовательности для создания адаптеров-А и Адаптеров-В, устанавливаемых на транспозазу pA/G-Tn5.

Дробь	Том
Очищенная геномная ДНК после реакции CUT&Tag	21 μл
Грунтовка N5XX (10 мкМ)	2 мкл
Грунтовка N7XX (10 μM)	2 мкл
NEBNext High-Fidelity 2× PCR Master Mix	25 мкл
	Всего 50 мкл

Таблица 2: Настройка ПЦР для подготовки библиотеки CUT&Tag с использованием индексирующих праймеров Illumina. Если вы используете коммерческий набор CUT&Tag, содержащий библиотечные реагенты для ПЦР, такие как смесь ДНК-полимеразы, следуйте конкретному руководству этого набора, чтобы настроить библиотечную ПЦР.

Шаг	Температура	Время	Номер цикла
1	72 °С	3 мин	1
2	95 °С	3 мин	1
3	98 °С	10 с	С 9 до 14 лет
4	60 °С	5 с, затем переходим к шагу 3
5	72 °С	1 мин	1
6	4 °С	держать	Н/Д

Таблица 3: Программа ПЦР для подготовки библиотеки CUT&Tag с использованием индексирующих праймеров Illumina.

Местоположение	Последовательности праймеров (5'-3')
ЦЖД	Для: GGG CAT TTA TGG GTC TTC CT
	Rev: CTC ATG CCT GGT GTT TAG GG
-15,000	Для: TGC CCA GAG CCT AGA ATC AT
	Rev: TCA TGC ATC CTT GCT GGA TA
-7,000	Для: GGC ATG GGA GGT TTA TAG CA
	Rev: ATG CCA CTA TGC AAT CCA CA
СРБ	Для: TCA GGA CCA GGA CCA TGT CT
	Rev: CTG GAC CTG TGG CCT CTT AC
ПРР	Для: GAG TAG ACA CTG GAG AGG CTT GG
	Rev: GAA AGC AGT CGT GTC CTG GG
СДС1	Для: CAT CTG ACA CTG GAG TCG CTT TG
	Rev: CAA GCA ACA CTC CTT GTC ATC AC
СДС2	Для: GTG AGC CTT GCA CAC CTA AGC C
	Rev: GTT GCA CTA CAC AGC ATG CCT G
Усилитель IgH	Для: ACC CTG GGA AGA CCA TAC TTA ATC T
	Rev: CCA TCC ACA CTC GTG CCT TA
Генная пустыня	Для: TCC TCC CCA TCT GTG TCA TC
	Rev: GGA TCC ATC ACC ATC AAT AAC C

Таблица 4: Локус-специфичные праймеры для тестирования обогащения H3K4me1 в различных локализациях гена Myod1 .

Обсуждение

Конкретное количество клеток, необходимое для определенной реакции CUT&Tag, полностью зависит от обогащения гистоновыми метками/вариантами или хроматин-связывающими белками, которые должны быть исследованы. Обычно для сильно обогащенных гистоновых меток, таких как H3K4me1, H3K4me3, H3K27ac и т.д., 25 000-50 000 миобластов вполне достаточно для одной реакции CUT&Tag. Тем не менее, для некоторых редких хроматин-связывающих белков может потребоваться до 250 000 клеток. Номер клетки, используемый в анализах CUT&Tag, имеет решающее значение, что при неправильном обращении обычно приводит к неудачному анализу. Использование чрезмерного количества клеток в реакции CUT&Tag вредно, особенно при тестировании очень обогащенных гистоновых меток. Если начать со слишком большого количества клеток, это означает, что для каждой клетки выделяется недостаточно антител. CUT&Tag работает не только с очень малым количеством ячеек, но и может быть применен на уровне¹ одной ячейки.

Прежде всего, использование надежных и валидированных антител с высокой аффинностью и специфичностью всегда является ключом к успешному анализу CUT&Tag. Так же, как и анализы ChIP, иммунопреципитация (IP) и IF, CUT&Tag также требует типа антител, которые могут распознавать естественно свернутые антигены¹. Напротив, антитела, которые распознают только ослабленные пептиды при вестерн-блоттинге, следует строго избегать в CUT&Tag.

Если оптимизация количества клеток или использование иммунофлуоресцентно валидированного или хорошо цитируемого антитела все еще не может решить проблему плохого сигнала в анализе CUT&Tag, то рассмотрите, является ли интересующий нас белок хроматин-ассоциированным белком, который слабо связывается или даже не связывается с ДНК напрямую. В этом случае, как упоминалось ранее, переключитесь на использование CUT&RUN вместо CUT&Tag. В качестве альтернативы, небольшой фиксации, такой как 5 минут в 0,5% параформальдегида (с последующим 10-минутным гашением в 0,1 М глицина), может быть методом, заслуживающим тестирования. Однако, поскольку мы никогда не практиковали фиксацию в каких-либо анализах CUT&Tag, и мы даже не сталкивались с необходимостью фиксации клеток перед выполнением CUT&Tag, мы не можем дать никаких дальнейших комментариев относительно кросслинкинга.

Мы понимаем, что некоторые версии протоколов CUT&Tag могут утверждать, что как RT (2 ч), так и 4 °C (в течение ночи) для стадии первичной инкубации антител могут дать достойные результаты^. Тем не менее, мы настоятельно рекомендуем использовать 4 °C (на ночь), а не RT в течение 2 часов. С другой стороны, продлевать время инкубации дольше чем на одну ночь также не рекомендуется.

С точки зрения чувствительности, контроля фона и степени сложности для исследователей, CUT&Tag превосходит анализы ChIP. Если у CUT&Tag есть некоторые недостатки по сравнению с ChIP, то единственный из них заключается в том, что протоколы CUT&Tag не включают метод внутренней нормализации, такой как использование «Input» в анализе ChIP¹. Таким образом, при сравнении пиковых высот между образцами с помощью CUT&Tag исследователи должны для начала выровнять количество клеток среди образцов. Кроме того, очень важно включить технические реплики.

Этот протокол представляет полную информацию о выполнении CUT&Tag в мышиных миобластах, предоставляя успешный пример H3K4me1 CUT&Tag в этом типе клеток. Описанный здесь метод может быть непосредственно применен к свежевыделенным MuSC без каких-либо модификаций. Кроме того, в соответствии с этим протоколом также можно проводить эксперименты CUT&Tag с гистоновыми метками, вариантами гистонов или факторами транскрипции в других типах клеток. Для миотрубок или миоволокон ядра могут быть сначала выделены, а затем CUT&Tag может быть проведена на мионудрах. При этом можно обрабатывать ядра так же, как обрабатываются клетки в этом протоколе CUT&Tag. Миотрубки и миоволокна являются многоядерными клетками, и мы не проверяли, могут ли миотрубки или миоволокна быть непосредственно связаны с гранулами конканавалина-А, хотя это может быть возможно.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
bFGF	R& D Systems	233-FB-025
Коллаген	Корнинг	354236
коллагеназа II	Worthington	LS004177
Конканавалин-А	Сигма-Олдрич	C5275
Конканавалин-А бусины	Bangs Laboratories	BP531
Дигитонин	Сигма-Олдрич	300410
Диспаза II	Thermo Fisher Scientific	17105041
Сыворотка плода крупного рогатого скота	Hyclone	SH30396,03
антитела к H3K4me1	abcam	ab8895
Ham's F10 media Thermo	Fisher Scientific	11550043
Hyperactive Universal CUT& Набор для анализа меток для Illumina	Vazyme	TD903	Этот набор был протестирован нами на хорошую работу
Магнитный штатив для пробирок EP объемом 1,5 мл	Qualityard	QYM06
Магнитный штатив для полос пробирок 8 мл	Anosun Magnetic	CLJ16/21-021
NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix	NEB	M0541L	Для создания библиотеки реакции ПЦР
pA-Tn5	Vazyme	S603-01	Необходимо установить адаптеры перед использованием
коктейля ингибиторов	протеазы Sigma-Aldrich	5056489001
Proteinase K	Beyotime	ST535-100mg
RPMI-1640 media Thermo	Fisher Scientific	C11875500BT
Вторичное антитело (Морская свинка против кролика IgG)	Антитела-онлайн	ABIN101961
Спермидин	Sigma-Aldrich	S2626
TruePrep Index Kit V2 для Illumina	Vazyme	TD202	Этот набор включает в себя грунтовки Illumina N7XX и N5XX
VAHTS DNA Чистые бусины	Vazyme	N411	Может заменить бусины Ampure XP. Может очищать CUT&; Помечайте библиотеки и выбирайте фрагменты ДНК по размеру