Универсальная система стеклянных банок для полугидропонного профилирования корневого экссудата

В густонаселенных почвах ризосфера представляет собой богатую углеродом нишу. Он формируется корнями растений путем экссудации до 20% ассимилированного углерода и содержит микробные сообщества, которые отличаются от резидентного почвенного микробиома 1,2,3,4,5,6. По мере^{того, как} исследователи изучают полезные функции микробов, связанных с корнями, и связанный с ними потенциал устойчивого сельского хозяйства, это наблюдение, часто называемое эффектом ризосферы, находится в центре внимания растущих научных усилий. Однако до сих пор химический диалог между микроорганизмами и растениями, который, как предполагается, является движущей силой ризосферного эффекта, остается малоизученным, и, следовательно, механистическое понимание разработки надежных микробных растворов в сельском хозяйстве ограничено ^8,9,10.

Расшифровка корневых экссудатов в почвенной среде, где метаболиты легко поглощаются частицами почвы и быстро переносятся микробными сообществами, не является простой задачей, особенно для видов растений с тонкой корневой системой, таких как модельное растение Arabidopsis thaliana¹¹. Вот почему в большинстве исследований корневой экссудат отбирают из гидропонных систем. В этих микрокосмах надземные части растений удерживаются на месте с помощью специальных держателей для растений или более сдержанных материалов, таких как сетка, агар и стеклянные шарики. Используемые контейнеры варьируются от чашек Петри на многолуночных планшетах до различных нестандартных и коммерческих ящиков с аэрационными фильтрами или без них^{12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19}. В зависимости от системы условия произрастания растений будут сильно различаться и в большей или меньшей степени отражать природные условия.

Здесь мы представляем полугидропонную систему на основе стекла, которая поддается экспериментам и дает высоковоспроизводимые результаты. Он прост в сборке и использовании и основан на общедоступных материалах. Система основана на стеклянной банке, наполненной стеклянными шариками, используя преимущества многоразового использования и свойств стеклянной посуды с низким связыванием (рис. 1). Гранулы обеспечивают физическую поддержку растущего растения и имитируют механический импеданс, способствуя более почвенной архитектуре корней по сравнению с гидропонными установками 19,20,21. При инокуляции микробами стеклянные шарики представляют собой поверхности, к которым прикрепляются бактерии.

Стеклянную банку можно закрыть для поддержания стерильности, а система спроектирована таким образом, чтобы обеспечить достаточное свободное пространство и циркуляцию воздуха, избегая среды, насыщенной влажностью. Банки подходят для длительного роста различных видов растений и могут увеличиваться и уменьшаться с помощью банок разного размера. Здесь показано применение для шести видов растений, охватывающих травы С3 и С4, двудольные и бобовые. Среди них модельные виды A. thaliana (двудольные), Brachypodium distachyon (однодольные С3), Medicago truncatula (бобовые), а также такие виды сельскохозяйственных культур, как Solanum lycopersicum (томат, двудоль ), Triticum aestivum (пшеница, однодольный С3) и Sorghum bicolor (сорго, однодольное С4). Представленный протокол включает в себя экспериментальную настройку системы, стерилизацию и проращивание семян шести видов растений, пересадку рассады в банки, различные питательные среды, микробный посев, отбор проб корневого экссудата и обработку экссудата для аналитики.

1. Подготовка рассады: Поверхностная стерилизация семян

ПРИМЕЧАНИЕ: Поверхностная стерилизация семян и все последующие шаги должны выполняться в стерильных условиях, если не указано иное. Этапы 1.1–1.4 предназначены для поверхностной стерилизации семян A. thaliana . Другие виды растений имеют альтернативные вариации размера пробирки (в зависимости от количества семян и размера семян), времени нахождения в растворах и растворов для стерилизации (табл. 1).

1. Добавьте семена в пробирку микроцентрифуги (максимум 20 мг семян) и залейте семена 70% этиловым спиртом.
   ВНИМАНИЕ: Этанол легко воспламеняется. Не используйте вблизи открытого огня.
2. Переместите закрытые пробирки микроцентрифуги в шейкер на 15 минут и установите вращение таким образом, чтобы семена слегка перемешались.
3. Осторожно удалите пипеткой 70% этанола и замените его 100% этанолом. Повторите шаг 1.2.
4. Удалите 100% этанол и высушите семена, оставив крышки пробирок микроцентрифуг открытыми в потоке стерильного воздуха.
5. Как только семена высохнут, равномерно распределите их на среду 0,5x Murashige и Skoog (MS) с 0,7% фитоагаром, щелкнув трубкой или используя стерильные щипцы. Закройте агаровые пластины и заклейте их лентой с микропорами 1,25 см.
6. Поместите планшеты горизонтально на полку в камере для выращивания (16 ч светло/8 ч темно, 22 °C днем/18 °C ночью, 150-160 мкмоль ^{м-2 с-1}).

2. Подготовка рассады: Пересадка проросших семян на свежие тарелки

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги специфичны для A. thaliana и не требуются для других видов.

1. После прорастания пересадите 5-6 саженцев на новые пластины с 0,7% фитоагаром со средой 0,5x MS, разместив проростки линейно, примерно в 3 см от верха (см. положение розетки на рисунке 2D).
2. Запечатайте агаровые пластины лентой с микропорами 1,25 см и выращивайте вертикально в ростовой камере (рис. 2D) до тех пор, пока рассада не будет готова к пересадке в банки через 15-18 дней после появления всходов (табл. 2).

3. Подготовка гидропонной системы: установка банки

1. Добавьте 150 мл чистых стеклянных шариков диаметром 5 мм в каждую чистую банку и закройте крышкой (Рисунок 1A).
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе стеклянные бусины диаметром 5 мм подходят для большинства видов²², но размер шарика можно регулировать при желании.
2. Накройте закрытые банки достаточным количеством алюминиевой фольги, чтобы покрыть место соединения крышки с банкой, и автоклавируйте (121 °C в течение 20 минут) (Рисунок 1B).
3. Подготовленные банки держите накрытыми до тех пор, пока растения не будут готовы к пересадке (табл. 2).

4. Подготовка гидропонной системы: добавление рассады

1. Когда рассада будет готова к пересадке в банки (табл. 2), снимите алюминиевую фольгу и крышки с банок на стерильной скамье.
2. Если банки должны быть засеяны бактериями, выполните следующие шаги, прежде чем переходить к шагу 4.3; В противном случае пропустите шаг 4.2.
   1. Используя стерильную петлю посева, отбирают единичные колонии из чистых бактериальных культур на агаровых планшетах и суспендируют их в 750 мкл стерильного 10 мМ MgCl₂. Повторяйте до тех пор, пока раствор не помутнеет.
   2. Дополнительно: Промыть суспензию 3 раза 750 мкл стерильного 10 мМ MgCl₂ центрифугированием в течение 5 минут при 1 000 × г и комнатной температуре с последующим удалением надосадочной жидкости и повторной суспензией гранулы в 750 мкл 10 мМ MgCl₂.
   3. Необязательно: При инокуляции нескольких различных видов бактерий смешайте суспензии отдельных штаммов, приготовленные на этапах 4.2.1-4.2.2, в равных пропорциях, прежде чем продолжить.
   4. Отрегулируйте оптическую плотность на длине волны 600 нм (OD₆₀₀) до 0,2-0,4 в среде 0,5x MS (pH от 5,7 до 5,9, с поправкой на KOH) или другой питательной среде по выбору (см. шаг 4.3). Измерьте наружный диаметр₆₀₀ еще раз, чтобы проверить, правильно ли разбавлен раствор.
      ВНИМАНИЕ: KOH вызывает коррозию; Наденьте перчатки и лабораторный халат.
   5. Разбавляют суспензию до наружного диаметра₆₀₀ 0,002-0,004 в той же среде (разбавление 1:100).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательная плотность клеток будет зависеть от используемого бактериального штамма, но, по нашему опыту, этот посевной материал соответствует примерно 3-6 × 10⁵ клеток ^мл-1.
   6. Добавьте 35 мл окончательного разведения на банку. Добавьте 35 мл стерильной питательной среды в контрольные банки. Перемешайте бисер, чтобы равномерно покрыть 0,5-кратным слоем материала MS перед пересадкой растения, чтобы корни не высохли. Перейдите к шагу 4.4.
3. Добавьте 35 мл среды 0,5x MS в каждую банку (pH от 5,7 до 5,9, отрегулируйте с помощью KOH). Перемешайте бусины, чтобы равномерно покрыть 0,5-кратным слоем MS перед пересадкой растений, чтобы корни не пересохли.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Питательная среда может быть изменена, например, путем удаления питательных веществ, добавления осмолитов для индуцирования солевого стресса или использования различных значений pH или питательных сред. ВНИМАНИЕ: KOH вызывает коррозию; Наденьте перчатки и лабораторный халат.
4. Поместите 3-5 растений A. thaliana в банку, поместив корневую систему между стеклянными шариками.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Количество растений в банке отличается для других видов (Таблица 2).
5. Перемещайте бусины стерильными щипцами или ложками, чтобы покрыть корни и вытащить листья из среды (Рисунок 1C).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Осторожно перемещайте растения и бусины, чтобы не сломать корни и не подвергнуть растения стрессу.
6. Добавьте 2 полоски ленты с микропорами 1,25 см поперек верхней части банок и аккуратно накройте сверху крышкой (рисунок 1D-F).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не нажимайте на крышку, чтобы не препятствовать воздухообмену.
7. Закройте зазор между крышкой и банкой лентой с микропорами диаметром 2,5 см, чтобы сохранить стерильность и обеспечить воздухообмен, и поместите банки в камеру для выращивания (Рисунок 1G, H).
8. Установите 4-8 банок для каждого экспериментального условия, в зависимости от биологического вопроса и ожидаемой изменчивости.
9. Обязательно включите биологически негативный контроль (например, банки без растений), чтобы учесть метаболитный фон экспериментальной системы. Настройте такое же количество репликаций для отрицательного контроля, как и для экспериментальных методов лечения (например, четверных).
10. При длительном росте заменяйте питательную среду еженедельно: удалите оставшуюся питательную среду объемным пипеткой объемом 25 мл и добавьте 35 мл свежей среды.

5. Сбор корневого экссудата

1. Когда растения достигнут желаемого возраста, снимите 2,5-сантиметровую микропористую ленту и накройте крышкой стерильную скамью.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для A. thaliana в наших условиях произрастания 21 день после прорастания представляет собой зрелую вегетативную стадию перед началом цветения. Стадия вегетативного развития специфична для вида растения, а сроки вегетативного периода меняются в зависимости от вида растения; Это время может быть изменено в зависимости от исследовательского вопроса.
2. Для определения стерильности аликвотируют 20 мкл питательной среды и пипетируют на пластины с агаром LB.
   1. Для инокулированных банок — аликвота 100 мкл питательной среды для подсчета колониеобразующей единицы (КОЕ) (например, в серии^{разведения 23}).
      ПРИМЕЧАНИЕ: По нашему опыту, бактериальная плотность колеблется в пределах 10 ^{5-10 8} живых клеток ^мл-1 питательной среды.
3. Удалите как можно больше питательной среды объемным пипеткой объемом 25 мл, не повредив корни.
4. Добавьте 50 мл среды для сбора (например, 20 мМ ацетата аммония; рН 5,7-5,9 регулируется HCl) пипеткой вдоль стенок банки, чтобы избежать намокания листьев. Банки закрывают крышками и выдерживают их в стерильных условиях в течение нужного времени сбора экссудата. Для экспериментов, чувствительных ко времени, 2 часа — хорошее окно сбора.
   ВНИМАНИЕ: HCl вызывает коррозию; Наденьте перчатки и лабораторный халат. Для более длительного сбора корневого экссудата снова оберните крышки скотчем и переместите банки в камеру роста.
5. Через 2 ч удалите желаемое количество среды для сбора в пробирки (например, 50 мл для анализов или анализов с использованием концентрированного экссудата или 2 мл для прямого использования). Собранный корневой экссудат хранить при температуре -80 °C до дальнейшей обработки или анализа.
   1. При работе с посевными банками собранный экссудат центрифугируют в течение 10 мин при 5 000 × г и 4 °С и используют для анализа только надосадочную жидкость. В качестве альтернативы можно отфильтровать и стерилизовать экссудат с помощью фильтра 0,22 мкм или 0,45 мкм.
6. Если эксперимент является частью временного ряда, удалите всю оставшуюся среду для сбора из банок и добавьте 35 мл среды 0,5x MS. Перед возвращением банок в камеру роста установите крышку и ленту 2,5 см на место.
7. Измерьте свежий вес корня и побега всех растений в одной банке, чтобы в дальнейшем нормализовать корневые экссудаты по весу растения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При желании можно дополнительно взять пробы растительных тканей.

6. Обработка корневого экссудата для масс-спектрометрии

1. В зависимости от аналитического метода сублимационную сушку корневого экссудата для концентрирования и удаления сборной среды (-80 °C при 0,37 мбар до тех пор, пока жидкость не исчезнет). Хранить при температуре -80 °C до готовности к анализу.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Данные, представленные здесь, были получены с помощью анализа TOF-MS с впрыском потока на квадрупольном времяпролетном приборе с точной массой.
2. Перед введением в аналитический прибор восстановите лиофилизированный экссудат или разбавьте необработанный корневой экссудат сборной средой в соответствии со свежим весом корня.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Среда для сбора была выбрана таким образом, чтобы быть совместимой с масс-спектрометром. Однако, в зависимости от аналитического метода, перед закачкой могут потребоваться этапы обессоливания.

Экспериментальная система, представленная здесь, позволяет контролировать экспериментальные факторы и факторы окружающей среды, изменяющие профили корневой экссудации. Мы сравнили рост A. thaliana при различных условиях освещения, возрасте растений и плотности растений в двух разных лабораториях (рис. 3). Растения выглядели здоровыми в разных лабораториях (рис. 3A,B). Условия короткого дня (10 часов света против 16 часов света, рис. 3) привели к увеличению массы корней по сравнению с условиями длинного дня (рис. 3C, D). Точно так же общая корневая масса всех растений, выращенных в условиях длинного дня, была меньше, чем в условиях короткого дня (рис. 3В). В целом, вариабельность роста внутри и между банками была низкой в разных лабораториях.

Система стеклянных банок совместима с различными видами растений и стадиями развития. Конечная точка анализа корневого экссудата обычно составляет 21 день, так как в наших экспериментальных условиях многие виды растений находятся в зрелой вегетативной стадии, прежде чем перейти в репродуктивную стадию (рис. 4A-E). Растения легко удаляются из экспериментальной системы без видимых повреждений корневой системы. Таким образом, определение веса тканей или использование тканей для последующего анализа не вызывает затруднений. Наибольшая масса побегов была обнаружена у пшеницы, за ней следуют сорго и томат. Наибольшая масса корней была обнаружена у сорго, за ним следуют пшеница и M. truncatula. Соотношение корня и побега различается у разных видов. В целом, вес тканей варьировал от 100 мг до 800 мг.

Центральным аспектом экспериментальных систем, позволяющих собирать корневой экссудат, является контролируемая инокуляция микробами для изучения взаимодействия растений и микробов в определенной среде. Представленная экспериментальная система может оставаться стерильной даже при многократных манипуляциях (см. «контрольное» состояние на рисунке 5), а бактерии могут добавляться и поддерживаться в течение длительных периодов времени. Когда 33-дневные растения A. thaliana были инокулированы смесью комменсальных бактерий при OD600 0,004, бактерии сохранялись в течение 12 дней, что составляло полную продолжительность эксперимента (рис. 5). Колониеобразующие единицы даже увеличились в 100 раз в ростовой среде и также колонизировали корни (рис. 5В). Фенотипы инокулированных растений были неотличимы от таковых стерильных растений (рис. 5А, Б).

Представленная экспериментальная система позволяет собирать экссудат во многих экспериментальных условиях. Здесь мы представляем профили экссудации A. thaliana Col-0, собранные либо в ацетате аммония, либо в воде из одних и тех же растений последовательно (рис. 6A). Экссудат хранили при -80 °С до анализа, нормировали по массе корня и анализировали методом масс-спектрометрии. Образцы банок с растениями фильтровали по сравнению с экспериментальным контролем (банки без растений). Из 2 163 метаболитов 436 показали сигнал выше фона (20,16%) и были сохранены для анализа. Из них 416 или 95% соединений показали отчетливую распространенность между условиями эксперимента. Тем не менее, 26 метаболитов не могут быть отнесены к какому-либо соединению и, таким образом, не определены. Большинство метаболитов (406 или 98%) были более распространены в экссудате, собранном водой. Последовательный сбор экссудата сначала в ацетате аммония, а затем в воде может повлиять на профиль экссудации, поскольку метаболические сигналы могут со временем ослабевать. Тем не менее, почти исключительно более высокий сигнал экссудации в воде, собранной во второй временной точке, не подтверждает эту гипотезу: сбор экссудата в чистой воде, вероятно, создает осмотический шок для растений, который вызывает повышенное содержание метаболитов по сравнению с коллекционным растворителем, эквимолярным раствором для роста (20 мМ ацетата аммония равномолярно для среды 0,5x MS). Исследование химических классов идентифицированных соединений обоих условий произрастания показало, что большинство соединений составляют органические кислоты и их производные (28,6%), за ними следуют органические кислородные соединения (18%), органогетероциклические соединения (14,2%) и липиды (13,2%). Лишь небольшая подгруппа метаболитов относится к фенилпропаноидам и поликетидам (8,7%) и бензеноидам (6%). Органические соединения азота, нуклеозиды, сероорганические соединения, алкалоиды, лигнаны и родственные соединения составляют от 2% до 0,5% классифицированных соединений (рис. 6B). Распределение метаболитов, изображенное здесь, соответствует уже опубликованным данным с использованием других типов систем сбора корневых экссудатов24.

Рисунок 1: Настройка стеклянной банки. (А) Баночка со стеклянными бусинами. (B) Банка со стеклянными шариками, готовая к автоклавированию. (С) Рассада в банках (вид сверху). (D) Рассада в банке (вид сверху) с помощью ленты с микропорами 1,25 см. (E) Рассада в банках (вид сбоку) с помощью ленты с микропорами 1,25 см. (F) Рассада в банках (вид сбоку) с микропористой лентой 1,25 см и крышкой. (G) Полная установка банки с рассадой в банках (вид сбоку) с помощью ленты с микропорами 1,25 см, крышкой и лентой с микропорами 2,5 см. (H) Полная настройка банки (вид сверху). (I) Растения в возрасте 21 дня и готовы к сбору урожая (вид сверху). Размер банки: 147 мм, высота и диаметр 100 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Проростки, стерилизованные поверхностно, на 0,5-кратных средних агаровых пластинах Murashige и Skoog в ростовой камере. (A) Arabidopsis thaliana (6 дней), (B) Brachypodium distachyon (6 дней), (C) Medicago truncatula (6 дней), (D) A. thaliana (18 дней). Размер агаровой пластины 120 мм х 120 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Растения Arabidopsis thaliana Col-0, выращенные в банках в условиях короткого и длинного светового дня. (A) Банка с тремя 33-дневными растениями, выращенными в условиях короткого дня (10 ч светлый/14 ч темный, 220 мкмоль м-2 с-1 интенсивность света, 21 °C днем/18 °C ночью) и (B) банка с пятью 21-дневными растениями, выращенными в условиях длинного дня (16 ч светлый/8 ч темный, 150-160 мкмоль м-2 с-1 интенсивность света, 22 °C днем/18 °C ночью). Масса корней (C) всех растений одной банки и (D) одиночных растений. ** Представлены значения значимости t-критерия (p < 0,05). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Пять филогенетически различных видов на 21-й день в системе стерильных стеклянных банок. (A) модельный однодольный Brachypodium distachyon, (B) модельный бобовый Medicago truncatula, (C) двудольный Solanum lycopersicum (томат), (D) двудольное сорго двухцветное, (E) однодольное Triticum aestivum (пшеница). (F) Свежая масса корней и побегов вида, выращенного в стеклянных банках. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5: Arabidopsis thaliana Col-0 (33 дня), выращенный в условиях короткого дня. (А) в стерильной обстановке или (Б) инокулировать в течение 12 дней консорциумом комменсальных бактерий. (C) Колониеобразующие установки для стерильных (контроль) и инокулированных банок с ростовым субстратом (слева) и корнем (справа). N = 4 банки для стерильного контроля и n = 8 банок для привитого состояния. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 6: Различные профили корневого экссудата для 21-дневного A. thaliana Col-0. Экссудат собирали в течение 2 ч в стерильном 20 мМ ацетате аммония (рН 5,7) с последующим сбором в течение 2 ч в стерильной фильтрованной деионизированной воде. Метаболиты детектировали методом масс-спектрометрии с использованием прямого впрыска. (А) Анализ главных компонент 436 метаболитов, обнаруженных выше фонового уровня (сравнение банок с растениями с банками без растений). PC: главный компонент с объяснением величины дисперсии. Синий цвет: экссудаты, собранные водой, желтый: экссудаты, собранные ацетатом аммония. (B) Круговая диаграмма 416 метаболитов, значительно различающихся в условиях эксперимента (тест Тьюки), окрашенная в соответствии с суперклассом (https://cfb.fiehnlab.ucdavis.edu/). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1: Методы поверхностной стерилизации семян для различных видов. * Промывка 4-5 раз фильтрованной деионизированной водой между этанолом и отбеливателем и в конце; инкубациюв течение 3-6 ч после отбеливателя, заменяя фильтрованной деионизированной водой каждые 30 мин.

Таблица 2: Возраст рассады в днях для пересадки в банки и количество растений в банке для различных видов растений.

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.