Здесь мы представляем комбинацию эффективных методов рестрикции крыс и подключичной пункции вен, которые позволяют быстро, безопасно и многократно собирать кровь у крыс без анестезии.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Забор крови из подключичных вен у крыс в сознании
* These authors contributed equally
В этой статье
Уведомление об исправлении
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Краткое содержание
Аннотация
Существует несколько общепринятых методов получения повторных образцов крови крыс, наиболее часто используемыми методами являются забор боковых вен хвоста без анестезии и забор яремной вены с анестезией. Однако большинство из этих методов требуют помощи и анестезиологического оборудования, а иногда создают трудности с точки зрения забора крови или низкого качества образцов крови. Кроме того, эти способы забора крови отнимают значительное время и человеческие ресурсы, когда требуется повторный забор крови для большого количества крыс. В этом исследовании представлена методика повторного забора крови у крыс без анестезии одним опытным человеком. Высокоудовлетворительные образцы крови можно получить путем пункции подключичной вены. Метод продемонстрировал впечатляющий общий показатель успеха в 95%, при этом среднее время от фиксации крысы до завершения забора крови составило всего 2 минуты. Кроме того, последовательный забор крови в пределах установленного диапазона не причиняет крысам никакого вреда. Этот метод стоит продвигать для забора крови, особенно в крупномасштабных фармакокинетических исследованиях.
Введение
Крысы являются одними из самых распространенных экспериментальных животных, и существует множество способов получения образцов крови. Для экспериментов, предполагающих однократный забор крови на заключительном этапе, достаточное количество крови может быть получено путем пункции сердца или забора крови из брюшной аорты1. Тем не менее, некоторые исследования требуют повторного забора крови у крыс для рутинного анализа крови или биохимического анализа, особенно в фармакокинетических и токсикологических исследованиях, где повторный забор крови требуется для определения абсорбции, распределения и метаболизмалекарственных средств.
В настоящее время, несмотря на то, что забор крови из хвостовых вен является наиболее распространенным методом забора крови у крыс, несмотря на то, что он не требует анестезии, этот метод может быть сложным для повторных сборов, а объем собранной крови относительно невелик 3,4. Кроме того, хотя кровь может быть взята из подкожных вен и вен полового члена, количество получаемой крови ограничено, и требуется анестезия 1,5. Кроме того, образцы крови, взятые из подчелюстного венозного сплетения, а также из подъязычных, яремных и подключичных вен, обеспечивают более высокое качество образцов, но, как правило, требуют анестезии или помощи нескольких человек 1,6,7,8,9. Наконец, забор крови из ретроорбитальных синусов/каналов не только требует анестезии, но и потенциально может вызвать травмы и стресс у крыс9.
Качество образцов крови, обычно получаемых из магистральных вен, как правило, соответствует самым высокимстандартам1. В настоящее время некоторые исследования показали, что непрерывный микрозабор проб через яремную вену является очень подходящим методом для токсикологических исследований на крысах, хотя этот метод обычно требует катетеризации яремной вены 10,11,12. Поэтому стоит изучить, как получить высококачественные образцы крови в соответствии с принципом 3R исследований на животных без хирургического вмешательства. Целью данного исследования было представить способ эффективного извлечения крови из подключичной вены у крыс. Этот метод позволяет быстро собрать удовлетворительные образцы с помощью процедуры одного человека без необходимости анестезии.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Данное исследование проводилось в соответствии с руководящими принципами, изложенными в 8-м издании Руководства по уходу за лабораторными животными и их использованию13. Исследование получило одобрение Комитета по этике Второй больницы Ланьчжоуского университета и было задокументировано в соответствии с руководящими принципами ARRIVAL 2.014. Двенадцать здоровых крыс линии Вистар (шесть самцов весом 290-330 г и шесть самок весом 250-280 г) в возрасте 12-16 недель были помещены в лабораторию животных GLP Университета Ланьчжоу в течение 3 дней до фактического эксперимента. Использовались клетки для крыс типа R5 размером 545 мм x 395 мм x 200 мм и были оснащены автоклавной подстилкой. Всем крысам был предоставлен неограниченный доступ как к пище, так и к воде. В лаборатории поддерживалась средняя влажность 25%, средняя температура 24 °C, а световой цикл чередовался между днем и ночью (7:00/19:00). В конце исследования все животные были гуманно усыплены с помощью передозировки изофлурана. Для получения исчерпывающей информации о материалах и инструментах, использованных в этом исследовании, пожалуйста, обратитесь к таблице материалов.
1. Расчет объема выборки и отбор животных
- Выберите методуравнения ресурсов 15 , чтобы оценить размер выборки животного с помощью уравнения (1).
E = Общее количество животных − Общее количество групп (1)
Где E – степень свободы дисперсионного анализа (ANOVA) и колеблется от 10 до 20.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании 12 животных были разделены на две группы А и В (три самца и три самки в группе). - Определите первичный исход этого исследования как частоту успеха и время, затрачиваемое на повторный забор крови одним человеком.
- Определите вторичные критерии оценки исходов как изменения массы тела крысы, потребления пищи и воды, а также частоту нежелательных явлений (таких как переломы ключиц, подкожные гематомы, пневмоторакс и смертность).
- Определить успешный отбор крови как соответствующий следующим критериям: i) менее трех пункций для одного забора крови; ii) общее время (от удержания крысы до завершения забора крови) не более 5 мин; и iii) достижение целевого объема крови при получении прозрачной плазмы. Любое отклонение от этих критериев считается ошибкой выборки.
2. Удержание животных и забор крови
Образцы крови крыс групп А и В были собраны двумя опытными исследователями, каждый из которых взял не менее 100 образцов крови. Образцы крови были взяты у обеих групп крыс в общей сложности 96 раз в течение 4 дней. Этот метод забора крови не требует анестезии или дополнительных удерживающих устройств для крыс. Тем не менее, это требует искусных методов обращения.
- В 8:00 утра за день до забора крови (день 1) поместите каждую крысу в отдельную клетку, пока ее еда и вода будут взвешены. Затем попросите другого исследователя, слепого к измерениям, записывать вес крыс, потребление пищи и воды каждый день в 8:00 утра, начиная с первого дня.
- Чтобы следовать этому протоколу, сначала берите кровь в 10:00, а затем в 22:00 каждый день, собирая 0,15 мл крови поочередно из подключичных вен с обеих сторон.
ПРИМЕЧАНИЕ: Количество крови, которое должно было быть собрано, определялось максимальным объемом, который крыса с самым низким весом могла выдержать в течение недели. - Промыть шприц гепарином натрия (25 Ед/мл) и продезинфицировать место инъекции спиртом.
- Осторожно погладьте кожу спины крысы и несколько раз ущипните ее за шею, чтобы помочь крысе расслабиться (видео 1).
- Большим и указательным пальцами недоминантной руки крепко возьмитесь за кожу шеи крысы и приподнимите ее (рис. 1А и видео 1).
- Координируя действия доминирующей руки, используйте оставшиеся три пальца и ладонь недоминантной руки, чтобы закрепить кожу спины крысы и обездвижить ее передние конечности (рис. 1B, C и видео 2).
ПРИМЕЧАНИЕ: Если крыса сопротивляется или сопротивляется, эту процедуру можно повторить несколько раз, чтобы помочь крысе привыкнуть к обращению. Следующие шаги являются ключом к успешному сбору крови. - Указательным пальцем недоминантной руки осторожно надавите на кожу головы крысы, в то время как другие пальцы вместе с ладонью помогают вращать плечевой сустав наружу. Во время этого процесса используйте доминирующую руку, чтобы полностью разогнуть плечевой сустав крысы (рис. 1D-F и видео 2).
- Крепко возьмитесь за крысу недоминантной рукой, чтобы выровнять голову и тело крысы по прямой линии (рис. 1G, H). Затем доминирующей рукой определите положение ключицы и подтвердите место прокола (рис. 1I, видео 2 и видео 3).
ПРИМЕЧАНИЕ: Брить крысу не нужно. На рисунке 1 бритье проводилось только для того, чтобы лучше показать положение ключицы и прокола. При сдерживании крыс, особенно крыс >350 г, если крыса будет опираться ногами на твердую поверхность, это поможет поддерживать вес ее тела. Кроме того, ограничитель должен контролировать частоту дыхания каждой крысы во время забора крови, чтобы убедиться, что удерживающий механизм не слишком тугой, что может вызвать респираторный дистресс. - Держа шприц параллельно телу крысы в доминирующей руке, кончиком иглы вверх, а шкалой шприца к экспериментатору, сохраняйте угол примерно 15° со средней линией тела крысы. Введите иглу на 0,5 см ниже выемки ключицы (на стыке проксимальной трети ключицы и грудины), следя за тем, чтобы игла оставалась параллельной телу крысы (рисунок 1J и видео 3).
ПРИМЕЧАНИЕ: Особое внимание следует обратить на угол и глубину введения иглы, чтобы избежать прокалывания кровеносного сосуда или непреднамеренного повреждения соседних сосудов. - Осторожно слегка отдергивайте шприц, чтобы создать отрицательное давление, часто сопровождающееся ощущением прорыва при входе в кровеносный сосуд (особенно выраженным во время первоначального забора крови). Сохраняйте это положение и собирайте 0,1-1,0 мл крови с постоянной скоростью по мере необходимости (в соответствии с рекомендациями IACUC о примерно 4-5,3 мл/кг крови в неделю1) (Рисунок 1K и Видео 3).
- Если при проколе нет крови, попробуйте аккуратно отрегулировать угол и глубину иглы или аккуратно повернуть шприц (Видео 3). Если три последовательные попытки на одной и той же стороне не увенчались успехом, остановите все кровотечения, а затем переключитесь на противоположную сторону для прокола.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется быстрый прокол кожи, чтобы крыса не боролась из-за дискомфорта. - Приложите ватный тампон для гемостаза и верните крысу в клетку (Видео 4).
- Обработайте образцы крови в соответствии с требованиями эксперимента.
3. Обработка образцов крови
- Выбросьте иглу шприца в контейнер для острых предметов. Собранную кровь переложить в пробирку микроцентрифуги объемом 1,5 мл, предварительно промытую гепарином. Поместите пробирку в центрифугу, установив ее на 4 °C и 1 200 x g, и центрифугируйте в течение 10 минут для отделения плазмы. Перелейте сыворотку с помощью пипетки Пастера объемом 1,0 мл в чистую микроцентрифужную пробирку и храните ее при температуре -80 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы предотвратить гемолиз из-за давления, при необходимости удалите кончик иглы. Во время аспирации плазмы избегайте забора клеток крови со дна пробирки. Иногда на поверхности шприца может собираться крысиная шерсть; Следите за тем, чтобы шерсть не попала в трубку, так как это может привести к образованию тромбов.
4. Статистический анализ
- Представьте все данные в виде среднего ± стандартного отклонения и проверьте их на однородность дисперсии.
- Используйте точный критерий Фишера, чтобы сравнить показатели успешности между группами.
- Используйте двухвыборочный независимый t-критерий для сравнения общих средних значений между двумя группами.
- Используйте дисперсионный анализ (ANOVA) для непрерывных измерений, таких как время забора крови, масса тела, потребление пищи и воды. Считать P < 0,05 статистически значимым.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Высококачественные образцы плазмы имеют бледно-желтый оттенок, чистоту и прозрачность, лишенные какого-либо красного оттенка или сгущения, как показано на рисунке 2A. На рисунке 2В показан гемолиз (левая сторона) или коагуляция (правая сторона) в результате неправильных процедур соответственно. За 96 сеансов забора крови в течение 4 дней среднее время забора одной крови для групп А и В составило 119,87 ± 33,62 с и 123,28 ± 30,96...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Несмотря на то, что забор крови из хвостовой вены является наиболее распространенным методом повторного забора крови у крыс, на него могут влиять анестезирующие препараты, а из-за небольшого размера хвостовой вены количество крови, которое может быть собрано за один раз, ограничено, что приводит к увеличению продолжительности забора крови 4,5. Несмотря на то, что высокоэффективные системы жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и тандемной масс-спектрометрии (МС/МС) в со...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
У авторов нет соответствующих финансовых или нефинансовых интересов, которые они могли бы раскрыть.
Благодарности
Это исследование было поддержано проектом «План Цуйин» Второй больницы Университета Ланьчжоу (грант No 1). PR0121015) и Ключевая лаборатория исследований заболеваний мочевыделительной системы провинции Ганьсу (грант No 0412D2).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 0,75% физиологического раствора | Gansu Fuzheng Pharmaceutical Technology Co., Ltd. | — — | Приготовленный раствор гепарина натрия |
| 1 мл пипетки Пастера | Biosharp | BS-XG-01-NS | Сбор крови |
| 1 мл шприц (26 г, 0,45 мм x 12 мм) | Shinva Medical Instrument Co.,Ltd. | 0,45*12RWLB | Сбор крови |
| 1,5 мл пробирки Eppendorf | Biosharp | BS-15-M | Хранение и сбор крови |
| 75% медицинского спирта | Shandong Lircon Medical Technology Co., Ltd. | — — | Дезинфекция места забора крови крыс |
| Держатель пробирки центрифуги | Biosharp | BS-05/15-SM60 | — — |
| Электронные весы | Shanghai PUCHUN Measure Instrument Co., Ltd. | JE1002 | Взвешивание |
| гепарина натрия для инъекций | Hebei Changshan Biochemical Pharmaceutical Co., Ltd. | — — | Промойте шприц и пробирку EP; разбавьте обычным физиологическим раствором до 25 Ед/мл |
| Низкотемпературная центрифуга | HuNan Xiang Yi Centrifuge Instrument Co., Ltd. | H1750R | Отделение сыворотки |
Ссылки
- UCSF Office of Research Institutional Animal Care and Use Program. Blood collection: The rat IACUC Guideline. , https://iacuc.ucsf.edu/sites/g/files/tkssra751/f/wysiwyg/GUIDELINE%20-%20Blood%20Collection%20-%20Rat.pdf (2022).
- Hattori, N., Takumi, A., Saito, K., Saito, Y. Effects of serial cervical or tail blood sampling on toxicity and toxicokinetic evaluation in rats. The Journal of Toxicological Sciences. 45 (10), 599-609 (2020).
- Liu, X., et al. Modified blood collection from tail veins of non-anesthetized mice with a vacuum blood collection system and eyeglass magnifier. Journal of Visualized Experiments. (144), e65513(2019).
- Zou, W., et al. Repeated blood collection from tail vein of non-anesthetized rats with a vacuum blood collection system. Journal of Visualized Experiments. (130), e55852(2017).
- Charlès, L., et al. Modified tail vein and penile vein puncture for blood sampling in the rat model. Journal of Visualized Experiments. (196), e65513(2023).
- Wang, L., et al. Repetitive blood sampling from the subclavian vein of conscious rat. Journal of Visualized Experiments. (180), e63439(2022).
- Yang, H., et al. Subclavian vein puncture as an alternative method of blood sample collection in rats. Journal of Visualized Experiments. (141), e58499(2018).
- Tochitani, T., et al. Effects of microsampling on toxicity assessment of hematotoxic compounds in a general toxicity study in rats. The Journal of Toxicological Sciences. 47 (7), 269-276 (2022).
- Harikrishnan, V. S., Hansen, A. K., Abelson, K. S., Sørensen, D. B. A comparison of various methods of blood sampling in mice and rats: Effects on animal welfare. Laboratory Animals. 52 (3), 253-264 (2018).
- Yokoyama, H., et al. Lack of toxicological influences by microsampling (50 µL) from jugular vein of rats in a collaborative 28-day study. The Journal of Toxicological Sciences. 45 (6), 319-325 (2020).
- Korfmacher, W., et al. Utility of capillary microsampling for rat pharmacokinetic studies: Comparison of tail-vein bleed to jugular vein cannula sampling. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 76, 7-14 (2015).
- Lu, W., et al. Microsurgical skills of establishing permanent jugular vein cannulation in rats for serial blood sampling of orally administered drug. Journal of Visualized Experiments. (178), e63167(2021).
- National Research Council of the National Academies, Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , 8th edition, National Research Council, Washington D.C., USA. https://grants.nih.gov/grants/olaw/guide-for-the-care-and-use-of-laboratory-animals.pdf (2011).
- Perciedu Sert, N., et al. The ARRIVE guidelines 2.0: updated guidelines for reporting animal research. The Journal of Physiology. 598 (18), 3793-3801 (2020).
- Charan, J., Kantharia, N. D. How to calculate sample size in animal studies. Journal of Pharmacology & Pharmacotherapeutics. 4 (4), 303-306 (2013).
- Turner, P. V., Pang, D. S., Lofgren, J. L. A review of pain assessment methods in laboratory rodents. Comparative Medicine. 69 (6), 451-467 (2019).
- Kurata, M., Misawa, K., Noguchi, N., Kasuga, Y., Matsumoto, K. Effect of blood collection imitating toxicokinetic study on rat hematological parameters. The Journal of Toxicological Sciences. 22 (3), 231-238 (1997).
- Zeller, W., Weber, H., Panoussis, B., Bürge, T., Bergmann, R. Refinement of blood sampling from the sublingual vein of rats. Laboratory Animals. 32 (4), 369-376 (1998).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Исправление
Formal Correction: Erratum: Subclavian Vein Blood Sampling in Conscious Rats
Posted by JoVE Editors on 3/21/2024. Citeable Link.
This corrects the article 10.3791/66075
Теги
