Генерация клеточной линии RIP1 Knockout U937 с использованием системы CRISPR-Cas9

Matthew A. Deragon; H. John Sharifi; Timothy J. LaRocca

doi:10.3791/66077

Методическая статья

Генерация клеточной линии RIP1 Knockout U937 с использованием системы CRISPR-Cas9

DOI:

10.3791/66077

⸱

11 апреля 2025 г.

Matthew A. Deragon¹ , H. John Sharifi² , Timothy J. LaRocca¹

¹Department of Life Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences, ²Department of Biological and Environmental Sciences, Le Moyne College

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

По мере того, как протоколы, связанные с CRISPR, становятся все более полезными и доступными, при определенных экспериментальных условиях все еще могут возникать осложнения и препятствия. В этом протоколе описывается создание рецептор-взаимодействующей линии серин/треонин-протеинкиназа 1 (RIPK1/RIP1) с нокаутной линией клеток человека с использованием CRISPR/Cas9 и освещаются потенциальные проблемы, возникающие в ходе этого процесса.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом протоколе описана процедура нокаутирования гена RIP1 с помощью CRISPR/Cas9 в клеточной линии U937 моноцита человека. В методе используются назначенные направляющие РНК-плазмиды и лентивирусные упаковочные плазмиды для достижения нокаута гена RIP1. Протокол решает проблемы и совершенствует традиционные методы CRISPR, позволяя воспроизводить его для будущих исследований клеточной смерти. Полученные мутантные клетки могут быть использованы для исследования механистических изменений в клеточной смерти, где в противном случае функциональные белки RIP1 играли бы роль. Анализы жизнеспособности показали значительное снижение гибели клеток в нокаутных клетках после индукции некроптоза. Флуоресцентная микроскопия выявила заметное снижение митохондриальных активных форм кислорода (АФК) в нокаутных клетках при тех же условиях. В совокупности эти функциональные анализы подтверждают потерю белка RIP1. Оптимизированная для использования с человеческими моноцитами U937, эта процедура также может быть адаптирована для нацеливания на другие ключевые регуляторы клеточной смерти, получая функциональные, нелетальные мутанты. Потенциальные подводные камни рассматриваются на всех этапах, чтобы дать представление о проблемах, которые могут возникнуть во время генерации мутантов.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Использование технологии редактирования генов CRISPR/Cas9 стремительно развивалось с момента ее открытия ^1,2,3. Способность нокаутировать или нокаутировать гены в клеточных линиях или бактериях неоценима для дальнейших исследований и понимания внутриклеточных механизмов 1,2,3,4,5,6. Система CRISPR-Cas9 улучшает предыдущие методы редактирования ген....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Схематическое изображение процедуры представлено на рисунке 1. Направляющая РНК (гРНК) и последовательность-мишень приведены в таблице 1. Подробная информация об используемых реагентах и оборудовании приведена в Таблице материалов.

1. Сбор RIP1-нацеленного на CRISPR вектора экспрессии лентивируса гРНК, содержащего эндонуклеазу Cas9 и резистентность к пуромицину у Escherichia coli

Квадрантная полоса E. coli, содержащая лентивирусную векторную гРНКна пластинах LB-агара, дополненная 100 мкг/мл ампициллина.
....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

После получения конфлюентной популяции мутантных клеток U937 RIP1 CRISPR были проведены SDS-PAGE и вестерн-блоттинг. Вестерн-блоттинг был использован для определения успешного создания мутантной клеточной линии RIP1 CRISPR путем оценки потери уровней экспрессии белка RIP1. Данное определение было сделано на основании сравнительного результата моноцитов WT U937 и клеток NTC. На рисунке 2 экспрессия RIP1 не была обнаружена для мутантных клеток пуромицина RIP1 CRISPR .......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол направлен на предоставление подробных инструкций и анализ потенциальных подводных камней в эффективности и надежности лентивирусной трансфекции и трансдукции для создания клеточной линии U937 с нокаутом RIP1. Несмотря на то, что этот метод трансфекции и трансдукции является трудоемким и трудоемким, в целом считается, что он является эффективным способом включения выбранной гРНК и эндонуклеазы Cas9 в трудноподдающиеся трансфекции клеточные линии

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было профинансировано Национальным институтом сердца, легких и крови (NHLBI) Национальных институтов здравоохранения (NIH), грант номер NIH 2R15-HL135675-02 для T.J.L.

....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
Имя	Компания	Каталожный номер
Скорректирован средний DMEM	Gibco	11995-040
Ампициллин	Сигма	А1593
бисБензимид Hoechst 33342 тригидрохлорид	Сигма	В2261
Средний RPMI-1640 в сборе	Сигма	Р6504
Штамм CRISPR NTC гРНК E.coli	трансОМИК	TELA1011
CRISPR RIP1 гРНК штамм E.coli	трансОМИК	ТВХ-1162203
Торцевой ротатор	Термо Сайентиал
EVOS FL Флуоресцентный микроскоп	Технологии Life
GenElute Plasmid Maxiprep Kit	Сигма	ПЛХ15
Антитела IgG козы против кролика, конъюгат HRP (H+L)	Сигма	АР307П
HEK293T Клетки	АТКС
Шейкер для инкубатора	Научный центр Нью-Брансуика
ЛБ Агар	БД	244520
LB Бульон	БД	244610
LV-MAX Лентивирусная упаковочная смесь	Gibco	А43237
MitoSOX Красный	МедХимЭкспресс	HY-D1055
Спектрофотометр NanoDrop	Термо Сайентиал
Некростатин-1	МедХимЭкспресс	HY-14622A
ОПТИ-МЕМ	Gibco	31985-062
Пуромицин	Сигма	П7255
Кролик античеловеческий RIP1 mAb	Технология клеточной сигнализации	3493
SDS-PAGE и оборудование для вестерн-блоттинга	БиоРад
TNF-α	МедХимЭкспресс	HY-P7058
U937 Моноциты человека	АТКС
WST-1 Система анализа пролиферации клеток	Такара	МК400
X-tremeGENE 9 Реагент для трансфекции ДНК	Рош Диагностика	6365779001
z-VAD-FMK	АПЕксБИО	А1902

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gostimskaya, I. CRISPR–Cas9: A History of its discovery and ethical considerations of its use in genome editing. Biochem (Mosc.). 87 (8), 777-788 (2022).
Jinek, M., et al. A programmable dual RNA-guided DNA endonuclease in ....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Генерация клеточной линии RIP1 Knockout U937 с использованием системы CRISPR-Cas9

В этой статье

Краткое содержание

Аннотация

Введение

Протокол

Результаты

Обсуждение

Благодарности

Материалы

Ссылки

Перепечатки и разрешения

Теги

Похожие статьи