Визуализация белков с низкой распространенностью и посттрансляционных модификаций в живых эмбрионах дрозофилы с помощью инъекции флуоресцентных антител

Summary

Этот протокол описывает индивидуальную флуоресцентную мечение на основе антител и инъекцию в ранние эмбрионы дрозофилы , чтобы обеспечить живую визуализацию белков с низкой распространенностью или посттрансляционных модификаций, которые трудно обнаружить с помощью традиционных подходов GFP/mCherry-tag.

Abstract

Визуализация белков в живых клетках с помощью GFP (Green Fluorescent Protein) и других флуоресцентных меток значительно улучшила понимание локализации, динамики и функции белков. По сравнению с иммунофлуоресценцией, визуализация в реальном времени более точно отражает локализацию белка без потенциальных артефактов, возникающих в результате фиксации тканей. Важно отметить, что визуализация в реальном времени позволяет количественно и во времени охарактеризовать уровни и локализацию белков, что имеет решающее значение для понимания динамических биологических процессов, таких как движение или деление клеток. Тем не менее, основным ограничением флуоресцентных подходов к мечению является необходимость достаточно высоких уровней экспрессии белка для достижения успешной визуализации. Следовательно, многие эндогенно меченные флуоресцентные белки с относительно низким уровнем экспрессии не могут быть обнаружены. С другой стороны, эктопическая экспрессия с использованием вирусных промоторов иногда может привести к неправильной локализации белка или функциональным изменениям в физиологическом контексте. Для устранения этих ограничений представлен подход, который использует высокочувствительное антитело-опосредованное обнаружение белка у живых эмбрионов, по сути, выполняя иммунофлуоресценцию без необходимости фиксации тканей. В качестве доказательства принципа, эндогенный рецептор Notch, помеченный GFP, который едва обнаруживается в живых эмбрионах, может быть успешно визуализирован после инъекции антител. Кроме того, этот подход был адаптирован для визуализации посттрансляционных модификаций (ПТМ) у живых эмбрионов, что позволило обнаружить временные изменения в паттернах фосфорилирования тирозина во время раннего эмбриогенеза и выявить новую субпопуляцию фосфотирозина (p-Tyr) под апикальными мембранами. Этот подход может быть модифицирован для размещения других белково-специфических, меткоспецифических или PTM-специфических антител и должен быть совместим с другими поддающимися инъекциям модельными организмами или клеточными линиями. Этот протокол открывает новые возможности для визуализации в реальном времени белков с низкой распространенностью или PTM, которые ранее было сложно обнаружить с помощью традиционных методов флуоресцентного мечения.

Introduction

Иммунофлуоресценция является краеугольным камнем современной клеточной биологии, первоначально разработанным Альбертом Кунсом, который позволяет обнаруживать молекулы в их собственных клеточных компартментах и характеризовать молекулярный состав субклеточных органелл или^{механизмов.} В сочетании с генетическими манипуляциями иммунофлуоресценция помогает установить общепринятую концепцию о том, что локализация белка имеет важное значение для^{его функционирования.} Помимо специфических первичных антител и ярких флуоресцентных красителей, успех этого метода основан на предварительном процессе, называемом фиксацией и пермеабилизацией, который сохраняет клеточную морфологию, иммобилизует антигены и увеличивает доступ антител во внутриклеточные компартменты. Процесс фиксации и пермеабилизации неизбежно убьет клетки и завершит все биологические^{процессы.} Таким образом, иммунофлуоресценция дает только моментальные снимки жизненного пути белков. Однако многие биологические процессы, такие как миграция и деление клеток, являются динамическими по своей природе, что требует исследования поведения белков в пространственно-временном ^{разрешении.}

Для изучения динамики белков в живых организмах были разработаны методы визуализации в реальном времени, основанные на генетически кодируемых флуоресцентных белках, таких как зеленый флуоресцентный белок (GFP)⁶ и высокоскоростные конфокальные микроскопы. Вкратце, интересующий нас белок может быть генетически модифицирован для слияния с GFP⁷, а затем эктопически экспрессирован из вирусных или дрожжевых промоторов, таких как цитомегаловирус (ЦМВ)⁸ или восходящая последовательность активации (UAS)⁹. Поскольку GFP является автофлуоресцентным по своей природе, для выявления локализации белков-мишеней не требуется никаких флуорофорных антител, что позволяет избежать необходимости предварительных процессов фиксации или пермеабилизации. За последние два десятилетия были разработаны флуоресцентные метки, охватывающие весь спектр длин^волн10, что позволяет получать многоцветную живую визуализацию нескольких белков-мишеней одновременно. Однако, по сравнению с химически модифицированными флуоресцентными красителями, такими как AlexaFluor или ATTO, автофлуоресценция этих генетически кодируемых флуоресцентных белков относительно слаба и нестабильна при экспрессии от эндогенных промоторов, особенно во время визуализации в реальном времени в более длительных^{временных} масштабах. Хотя этот недостаток может быть смягчен чрезмерной экспрессией флуоресцентно меченных белков-мишеней, многие из них с ферментативной активностью, такой как киназы и фосфатазы, серьезно нарушают нормальные биологические процессы, если не экспрессируются на физиологическом уровне.

Этот протокол представляет собой метод, который позволяет подсвечивать мишень на основе фотостабильных антител в режиме реального времени, по сути, обеспечивая иммунофлуоресценцию без процесса фиксации или пермеабилизации (рис. 1). С помощью простой первичной аминовой реакции¹¹ на основе NHS можно конъюгировать флуоресцентные красители, такие как AlexaFluor 488 или 594, практически с любым первичным антителом или GFP/HA/Myc nanobody¹². Используя особенность развития, заключающуюся в том, что все эмбриональные клетки дрозофилы имеют общую цитоплазму во время^13-й стадии синцития, можно добиться связывания антигена и освещения целых эмбрионов после инъекции антител, конъюгированных с красителем. С расширением библиотек эндогенно меченых белков, доступных в дрозофиле и других модельных системах¹⁴, этот метод потенциально может расширить применение этих библиотек, выявляя динамику флуоресцентно меченных белков с низким содержанием и других нефлуоресцентно меченных белков (HA/Myc-меченых) в живых тканях.

Protocol

Эксперименты проводились в соответствии с рекомендациями и одобрением Школы наук о жизни Университета SUSTech. Используемый микроорганизм - Drosophila melanogaster, а генотипы - Notch-Knockin-GFP (хромосома X) и Sqh-sqh-GFP (хромосома II), любезно предоставленные лабораториями доктора Франсуа Швайсгута (Институт Пастера) и доктора Дженнифер Заллен (Институт Слоуна-Кеттеринга) соответственно. Несмотря на то, что этот протокол в основном сосредоточен на аспектах мечения антител и визуализации в реальном времени, более подробное описание сбора и инъекции эмбрионов дрозофилы см. в опубликованных отчетах ^15,16.

1. Флуоресцентное мечение антител

1. Предпочтительно использовать моноклональные антитела или нанотела для интересующего белка. Приготовьте исходную концентрацию антител на уровне 1 мг/мл или выше.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В данном исследовании в качестве примера используется GFP nanobody (см. Таблицу материалов). Коммерчески доступный GFP nanobody упакован в концентрацию 1,0 мг/мл и объем 250 мкл. Кроме того, используется коммерчески доступный набор для маркировки антител (см. Таблицу материалов), который конъюгирует Alexa Fluor 594 с первичными аминами белков посредством реакции¹¹ сукцинимидилового эфира. Важно отметить, что этот процесс мечения существенно не влияет на концентрацию антител.
2. Приготовьте 1 М раствор бикарбоната натрия, повторно суспендировав компонент B (входит в комплект для маркировки антител) в 1 мл деионизированной воды.
3. Отрегулируйте концентрацию антител до 1,0 мг/мл, затем добавьте 1/10^{объема (} 10 мкл для 100 мкл нанотела GFP) 1 М раствора бикарбоната натрия.
4. Добавьте 110 мкл смеси антител (с шага 1.3) непосредственно в пробирку, содержащую краситель Alexa Fluor 594. Перемешать (не перемешивать) и выдержать на ротаторе в течение 1 ч при комнатной температуре.
5. Соберите очистительную колонку из комплекта сопряжения (см. Таблицу материалов). Приготовьте слой смолы объемом 1,5 мл (входит в комплект для маркировки антител) и центрифугируйте колонку при 1100 x g в течение 3 минут при комнатной температуре (RT), чтобы удалить лишнюю жидкость из смолы.
6. Добавьте реакционную смесь (из шага 1.4) по каплям в верхнюю часть столбика смолы и центрифугируйте при 1100 x g в течение 5 минут при 4 °C, чтобы собрать меченое антитело. Собранное антитело должно иметь розовый цвет, а объем должен быть чуть меньше 100 мкл. Хранить в тюбиках, завернутых в фольгу или темного цвета, при температуре 4 °C.

2. Подготовка эмбрионов дрозофилы

1. Поместите 200 только что вылупившихся взрослых дрозофил в пластиковую клетку цилиндрической формы (диаметр = 5 см, высота = 8 см) с соотношением самцов и самок 1:10. Загерметизируйте одну сторону пористой металлической сеткой для вентиляции, а другую — тарелкой из фруктового сока/дрожжевой пасты.
2. Меняйте пластинку каждые 12 ч в течение трех дней до забора эмбрионов. Это позволяет синхронизировать яйцекладку дрозофилы и повышает эффективность сбора.
3. В день инъекции смените клетку на тарелку с фруктовым соком с минимальным количеством дрожжевой пасты и собирайте эмбрионы при 25 °C в течение 1 ч. Если первый этап сбора не дает достаточного количества эмбрионов (<50 эмбрионов), выбросьте первую пластину и повторяйте этот шаг для второго раунда сбора до тех пор, пока в течение 1 часа не будет отложено более 100 эмбрионов.
4. Выньте пластину из клетки, чтобы остановить яйцекладку, и инкубируйте при 25 °C еще 2 ч для получения эмбрионов возрастом 2-3 ч. Правильная стадия эмбрионов имеет решающее значение для успеха инъекции антител.
5. Чтобы удалить яичную скорлупу эмбрионов, добавьте 2 мл 50% отбеливателя в пластину с фруктовым соком и осторожно вытесните эмбрионы из чашки с помощью кисти (Рисунок 2A-4). Часто эмбрионы будут откладываться прямо поверх дрожжевой пасты. В этом случае допустимо смазать дрожжевую пасту в раствор хлорной извести, чтобы собрать все эмбрионы.
6. Инкубируйте плавающие эмбрионы в 50% отбеливателе в течение 2 минут и перемешивайте тарелку с фруктовым соком каждые 30 с, чтобы повысить эффективность удаления яичной скорлупы.
7. Перенесите смесь эмбрионов и отбеливателя, вылив ее в ситечко из нейлоновых ячеек размером 70 мкм (Рисунок 2A-7). Тщательно промойте эмбрионы с помощью бутылки с водой, чтобы удалить остатки отбеливателя и дрожжевой пасты. Полностью высушите ситечко бумажными полотенцами, убедившись, что лишняя вода вокруг эмбрионов удалена.

3. Выравнивание и высыхание эмбрионов

1. Приготовьте 4% агарозный гель размером 5 см х 5 см х 0,5 см (ширина, длина, высота) (рис. 2А-9) и дайте гелю остыть до комнатной температуры. Отрежьте агарозный блок размером 1 см x 3 см x 0,5 см (ширина, длина, высота) чистым лезвием бритвы и поместите блок на предметное стекло (рис. 2A-2). Осмотрите гелевый блок под эндоскопом, чтобы убедиться, что края срезаны прямо, а поверхность ровная и сухая.
2. Перенесите эмбрионы из ситечка на гелевый блок с помощью кисти. Равномерно распределите эмбрионы по средней линии блока, аккуратно расчесывая их. В идеале кластеры эмбрионов разделяют на одиночные или дублеты, не соприкасаясь друг с другом.
3. Подготовьте пинцет с двумя ножками, плотно приклеенными друг к другу, чтобы получился один тонкий кончик (Рисунок 2A-5). Под препарирующим эндоскопом возьмите пинцетом отдельные эмбрионы и поместите их вдоль длинного края гелевого блока. Выровняйте 20-30 эмбрионов, убедившись, что их передняя задняя ось параллельна краю (рис. 2C).
4. Нанесите на пипетку 10 мкл гептанового клея (см. таблицу материалов) в центр покровного стекла размером 24 мм x 50 мм (Рисунок 2A-1) и распределите клей по прямоугольному участку размером 0,5 см x 3 см с помощью наконечника пипетки. Перед использованием дождитесь полного высыхания клея.
5. Поместите предметное стекло с гелевым блоком на край стола эмбрионами наружу. Приподнимите покровное стекло с клеем с помощью пинцета с плоским кончиком (Рисунок 2A-6) и держите его неподвижно поверх эмбрионов так, чтобы клеевая сторона была обращена к эмбрионам под углом около 45 градусов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Осторожно прижмите покровное стекло к гелевому блоку, чтобы эмбрионы соприкасались с клеем, а затем быстро ослабьте давление и поднимите покровное стекло. Величина приложенного натяжения имеет решающее значение для того, чтобы эмбрионы могли быть стабильно прикреплены к клею, не прижимаясь слишком сильно и не разрываясь.
6. Налейте пипетку 10 мкл воды в центр нового предметного стекла и поместите покровное стекло с эмбрионами поверх него стороной эмбриона вверх (Рисунок 2B). Убедитесь, что вы используете воду вместо лака для ногтей или другого клея для крепления покровного стекла к предметному стеклу, так как эта сторона покровного стекла будет размещена непосредственно поверх конфокальной линзы для получения изображения в реальном времени.
7. Высушите эмбрионы в сушильной камере (Рисунок 2А-3) (см. Таблицу материалов) в течение 10-15 мин до тех пор, пока вителлиновая мембрана не сморщится (Рисунок 2Е). Требуемое время может варьироваться в зависимости от влажности помещения и должно быть экспериментально проверено для каждого лабораторного условия.
8. Пипетка 40 мкл галогеноуглеродного масла (смесь типа 27 и типа 700 в соотношении 1:1 по объему, см. таблицу материалов) на один конец полоски эмбриона. Наклоняйте предметное стекло до тех пор, пока галогеноуглеродное масло не покроет всю поверхность эмбрионов.

4. Инъекция антител и визуализация

1. Подготовьте несколько стеклянных игл для инъекций с помощью съемника микропипетки (настройки параметров см. в таблице материалов ) и загрузите в каждую иглу 5 мкл раствора антител, меченного AlexaFluor (начиная с шага 1.6).
2. Поместите защитное стекло размером 25 мм x 25 мм на предметное стекло. Наберите пипетку 40 мкл галогеноуглеродного масла и распределите ее по краю покровного стекла.
3. Под эндоскопом для инъекций совместите кончик иглы с краем покровного стекла под маслом. Отрегулируйте давление воздуха для впрыска пиконасоса (см. Таблицу материалов) таким образом, чтобы один насос генерировал один пузырь, наполненный антителами. Диаметр пузырька должен быть ограничен 20-50 мкм (рис. 2F).
4. Замените пустое предметное стекло на предметное скоб, содержащее эмбрионы под маслом. Выровняйте кончик инъекционной иглы перпендикулярно передне-задней оси эмбрионов (рис. 2D, G).
5. Проверьте стадию эмбрионов, чтобы убедиться, что большинство из них инициировали целлюляризацию, но еще не начали гаструляцию (стадии 4 и 5), оставаясь в виде синцития (рис. 2F, G).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Отличительной чертой этой стадии является отсутствие каких-либо бороздок или складок и наличие желточного мешка овальной формы темного цвета, видимого в центре эмбриона. Морфологическая характеристика стадии эмбриона под действием масла основана на главе книги Фолькера Хартенштейна «Стадии эмбриогенеза дрозофилы»¹⁷.
6. Используйте манипулятор стадии X-Y, чтобы перемещать эмбрионы к игле до тех пор, пока кончик не достигнет центра желтка. Накачайте два-три раза, чтобы ввести антитела в желток. Об успешном впрыске свидетельствует быстрое исчезновение складки вителлиновой мембраны по мере того, как эмбрионы набирают объем из раствора антител (рис. 2G).
7. Используйте манипулятор стадии X-Y, чтобы отодвинуть эмбрионы от иглы после инъекции и переместить их вниз к следующему эмбриону. Повторяйте шаг 6 до тех пор, пока не будут введены все эмбрионы на предметном стекле.
8. Перенесите предметное стекло с введенными эмбрионами во влажную камеру (рис. 2A-8). Инкубируйте при температуре 25 °C до тех пор, пока не будет достигнута желаемая стадия развития эмбриона.
9. Снимите покровное стекло размером 24 мм x 50 мм со предметного стекла и поместите его непосредственно в держатель предметного стекла микроскопа. Перед задачами будет стоять сторона, у которой нет эмбрионов. Определите местонахождение эмбрионов с помощью линзы с малым увеличением при ярком освещении и переключитесь на линзу с 40-кратным или 63-кратным увеличением для получения флуоресцентной визуализации в реальном времени с высоким разрешением.

Results

Чтобы продемонстрировать преимущества метода введения антител по сравнению с флуоресцентной визуализацией или иммунофлуоресценцией на основе флуоресцентных меток, представлены два тематических исследования, характеризующих динамическую локализацию трансмембранного рецептора с низкой распространенностью, Notch, и тип посттрансляционной модификации, называемой тирозиновым фосфорилированием, у живых эмбрионов.

Сигнальная активность Notch играет важную роль в определении судьбы клеток в процессе эмбриогенеза и гомеостаза взрослого органа^18,19. При активации его лигандами Delta/Jagged²⁰ внутриклеточный домен трансмембранного рецептора Notch расщепляется и высвобождается в ядро²¹, инициируя последующие транскрипционные программы, управляющие изменениями судьбы клетки²². Статическая локализация Notch-рецептора хорошо характеризуется иммунофлуоресценцией в тканях, зафиксированных формальдегидом. Тем не менее, динамическая локализация Notch во время связывания лиганда или внутриклеточного процесса расщепления остается в значительной степени^{неизвестной23} из-за отсутствия метода быстрой визуализации этого белка с относительно низкой численностью в реальном времени. В данном случае мы вводили конъюгированный GFP нано AlexaFluor эмбрионам, экспрессирующим GFP-меченый Notch из эндогенного локуса²⁰. Без инъекции Notch-GFP едва обнаруживается в стандартных условиях визуализации в реальном времени, а флуоресцентный сигнал быстро обесцвечивается во время интервальной съемки. После инъекции соотношение сигнал/шум Notch-рецептора значительно улучшается, сравнимое с качеством сигнала иммунофлуоресценции (рис. 3А). Кроме того, инъекция антител позволяет определить временную характеристику локализации Notch с интервалом в 45 с без видимой потери интенсивности сигнала в течение 5-минутного окна визуализации (рис. 3B).

Фосфорилирование тирозина является основным типом посттрансляционной модификации белка, которая опосредует передачу сигнала во многих биологических путях²⁴. Высокоспецифичные моноклональные антитела (такие как PY20 и 4G10) против фосфотирозина (p-Tyr) были разработаны для характеристики локализации и уровней общего фосфорилирования тирозина с использованием иммунофлуоресценции и вестерн-блоттинга²⁵. Несмотря на то, что никакие флуоресцентные метки не могут отслеживать изменения фосфорилирования, ткани или клетки должны быть зафиксированы и окрашены или лизированы и промоканы в разные моменты времени, чтобы получить моментальные снимки статуса фосфорилирования с течением времени, чтобы изучить кинетику фосфорилирования тирозина при активации сигнала²⁶ (например, лечение фактором роста). Временной интервал этого подхода составляет не менее нескольких минут и по своей сути неточен из-за переменного времени, необходимого для таких процедур, как фиксация или лизис клеток.

Представлены доказательства того, что метод введения антител позволяет непосредственно визуализировать статус фосфорилирования у живых эмбрионов, отслеживая локализацию и изменения интенсивности фосфорилирования тирозина через регулярные интервалы времени на уровне секунд. Конъюгированное AlexaFluor антитело PY20 вводили эмбрионам, экспрессирующим легкую цепь миозина, меченую GFP, и выполняли двухцветную визуализацию в реальном времени с интервалом 45 с. Как было показано ранее, фосфорилирование тирозина сильно обогащено в трехклеточных соединениях²⁷, что также повторяется иммунофлуоресценцией (рис. 4А). Интересно, что визуализация в реальном времени также выявила новую, вторую популяцию сигнала p-Tyr под центром апикальной мембраны, которая не наблюдается при использовании иммунофлуоресценции (рис. 4B). С помощью двухцветной визуализации было обнаружено, что эта популяция сигнала p-Tyr находится в непосредственной близости от медиального миозина (рис. 4B, крупные планы), субпопуляции миозина²⁸ , которая также выражена только в условиях живой визуализации, но едва обнаруживается с помощью иммунофлуоресценции. Кроме того, медиальная популяция p-Tyr демонстрирует аналогичные паттерны пульсирующей коалесценции и диссипации (рис. 4C), как ранее было показано для медиального миозина²⁸. Идентичность и функции медиальной субпопуляции p-Tyr до сих пор неизвестны. Вместе эти результаты показывают, что метод введения антител может в значительной степени дополнить традиционные подходы к характеристике поведения белков с низкой распространенностью и выявить новые паттерны локализации, которые могли быть нарушены в процессе иммунофлуоресценции.

Рисунок 1: Рабочий процесс инъекции антител. Схематический рабочий процесс, иллюстрирующий этапы метода инъекции антител. Весь процесс, от забора эмбрионов до инъекции антител, обычно занимает около 4-5 часов. После инъекции антител эмбрионы могут быть инкубированы во влажной камере до желаемой стадии развития, прежде чем получить живую визуализацию. AEL, после яйцекладки; RT, комнатная температура; АТ, антитела. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Выравнивание эмбриона и инъекция. (A) Обзор предметов, необходимых перед инъекцией, включая покровное стекло, предметное стекло, коробку для сушки, кисть, пинцет, клеточный фильтр, камеру влажности и агарозный гель. (B) Выровненные эмбрионы, прикрепленные к гептановому клею в центре покровного стекла и помещенные поверх шариков для сушки. (C) Выравнивание передне-задней оси эмбрионов параллельно краю агарозного геля. (D) Общие сведения о настройке впрыска. (E) Сравнение морфологии эмбрионов до и после процесса десикации с акцентом на морщины вителлиновой мембраны после высыхания. (F) Размер пузырька впрыска после однократного нажатия пиконасоса. (G) Сравнение морфологии эмбрионов до и после инъекции антител, подчеркивающее исчезновение морщин на мембране после инъекции. (E-G) были сняты под объективом с 10-кратным увеличением с помощью светлопольной микроскопии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Живая визуализация Notch-рецептора у ранних эмбрионов. (A) Локализация эндогенного рецептора Notch, помеченного GFP, посредством иммунофлуоресценции (слева), прямая визуализация в реальном времени на основе автофлуоресценции GFP (в центре) и конъюгированная инъекция GFP nanobody с AlexaFluor 594 (справа). (B) Динамическая локализация Notch-GFP с интервалом в 45 с после введения антител. Все изображения были получены с передней частью эмбрионов влево и вентральной стороной вниз. Масштабные линейки = 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Визуализация эмбриональных фосфотирозиновых паттернов в реальном времени. (A) Локализация фосфорилированного тирозина (p-Tyr) в фиксированных эмбрионах с помощью иммунофлуоресценции. (B) Локализация p-Tyr (пурпурного) в живых эмбрионах, экспрессирующих GFP-меченую миозиновую легкую цепь (зеленый). Белая пунктирная рамка показывает крупным планом медиальную популяцию фосфотирозина и миозина под апикальной мембраной. Масштабные линейки = 10 мкм. (C) Локализация p-Tyr и GFP-миозина, визуализированная каждые 45 с у живых эмбрионов. Белыми стрелками обозначена медиальная популяция p-Tyr и миозина. Все изображения были сделаны так, чтобы передняя часть эмбрионов была обращена влево, а брюшная сторона была обращена вниз. Масштабные линейки = 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Discussion

Данная методика представляет собой специализированный метод флуоресцентного мечения с помощью специальных антител и последующей инъекции эмбрионам дрозофилы на ранних стадиях. Этот метод облегчает визуализацию в режиме реального времени белков или посттрансляционных модификаций, которые существуют в небольших количествах и, как правило, трудно наблюдаются с помощью обычных методов мечения GFP/mCherry.

Следует проявлять осторожность при расширении этого метода для проведения количественных сравнений между эмбрионами дикого типа и эмбрионами-мутантами. В то время как концентрация первичных и вторичных антител может быть одинаковой в контрольной и экспериментальной группах при иммунофлуоресценции, количество введенных антител и эффективность мечения могут варьироваться в зависимости от эмбриона. Поэтому количественный анализ должен быть ограничен отслеживанием изменений интенсивности флуоресценции во времени или проведением корреляционного анализа с сигналами других каналов в том же эмбрионе при выполнении многоцветной визуализации в реальном времени. Например, анализ колокализации и корреляции может быть выполнен с использованием интенсивностей p-Tyr и миозина²⁷, в то время как интенсивность p-Tyr не может быть напрямую сравнена между эмбрионами дикого типа и эмбрионами с нокдауном гена X, использующими метод инъекции антител.

Подобно другим подходам к изучению динамики белков на основе флуоресцентных меток, связывание антител потенциально может изменить активность, транспорт или локализацию белков-мишеней. Поэтому моноклональные антитела или нанотела предпочтительнее поликлональных антител для инъекций. Поскольку эпитопы моноклональных антител или нанотел хорошо определены, вопрос о том, изменяет ли блокирование этих эпитопов антителами активность белка, может быть смоделирован на основе альфа-складчатых структур^12,25. С другой стороны, эпитопы поликлональных антител точно не разграничены, и их связывание потенциально может изменить локализацию или активность белка, если каталитические карманы или сигнальные пептиды белков-мишеней блокируются. Во-вторых, антитела могут распознавать неспецифические эпитопы, отличные от белков-мишеней, особенно с учетом того, что здесь, как в иммунофлуоресценции, нет этапов «вымывания», чтобы удалить низкоаффинные неспецифические связывания. Поэтому важно иметь контрольные группы, такие как инъекции антител в клетки, лишенные эпитопа, чтобы проверить, действительно ли наблюдаемый сигнал отражает белки-мишени или другие неспецифические эпитопы.

Инъекция антител ничем не отличается от инъекции миРНК или CRISPR гРНК с точки зрения экспериментальной установки. Поэтому большинство клеточных систем, которые поддаются инъекциям, должны быть совместимы с методом введения антител. У эмбрионов дрозофилы флуор-конъюгированные антитела Alexa стабильны во время развития, а флуоресцентные сигналы остаются обнаруживаемыми через несколько часов эмбриогенеза. Для других систем, таких как эмбрионы Xenopus или рыбок данио, концентрация и объем инъекций антител должны быть эмпирически проверены с помощью последовательных разведений для достижения идеальной эффективности мечения. Кроме того, альтернативные флуоресцентные красители, такие как ATTO¹⁰ , потенциально могут обеспечить лучшее соотношение сигнал/шум и растворимость в воде.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Агароза	Сангон Биотех&	nbsp; A620014
Alexa Fluor 594 Набор для мечения антител	Invitrogen	A20185	Очистительная колонка с шага 1.6 входит в этот комплект
Биологический микроскоп	SOPTOP	EX20	Окулярная линза: PL 10X/20. Объектив: 10x/0.25
Bleach	Clorox®
Капилляры из боросиликатного стекла	World Precision Instruments	TW100F-4
Центрифуга	Eppendorf	5245
Сетчатый фильтр	FALCON	352350
Камера сушки	ЗАМОК & LOCK	HSM8200	320 мл
Препарирующий микроскоп	Mshot	MZ62	Объектив окуляра: WF10X/22 мм.
Скотч двухсторонний		665
тонкий суперпинцет	VETUS	ST-14
Fisherbrand™ Чехлы для стекла: прямоугольники	Fisherbrand	12-545F
Fisherbrand™ Superfrost™ Плюс предметные стекла для микроскопа	Fisherbrand	12-550-15
Щипцы	VETUS	33A-SA
Галокарбоновое масло 27	Sigma-Aldrich	H8773-100ML
Галокарбоновое масло 700	Sigma-Aldrich	H8898-100ML
Гептан	Sigma-Aldrich	H2198-1L	Гептановый клей изготовлен из двустороннего скотча, погруженного в гептан
Реагент для обезвоживания	TOKAI	1-7315-01	Заполнение до 90% объема камеры сушки
Ручной микроманипулятор	World Precision Instruments	M3301R
Вытягиватель микропипеток	World Precision Instruments	PUL-1000	Процедура: шаг 1, Нагрев: 290, Сила:300, Расстояние:1.00, Задержка:50.<бр/> Шаг 2, Нагрев: 290, Сила:300, Расстояние:2.21, Задержка:50
Пневматический пиконасос	World Precision Instruments	PV 830	Eject: 20 psi;   Дальность: 100 мс; Продолжительность: timed
PY20	Santa Cruz	SC-508
Квадратные чашки Петри	Biosharp	BS-100-SD
GFP нанотело	Chromotek	gt