Преобразование статических барьерных моделей тканей в динамические микрофизиологические системы

Сосудистые барьеры служат критически важным интерфейсом, который отделяет отсек крови от окружающих тканей. Они играют важнейшую роль в сохранении гомеостаза, привлекая иммунные клетки, контролируя молекулярную проницаемость и защищая от вторжения патогенов в ткань ^1,2. Были разработаны модели культивирования in vitro, имитирующие микроокружение in vivo, что позволяет систематически исследовать факторы и условия, влияющие на барьерные свойства как в здоровом, так и в больном состоянии ^3,4.

Наиболее широко используемым подходом для таких моделей культивирования является конфигурация 5, подобная конфигурации «открытая скважина»⁵, в которой пористая мембрана для культивирования с трековым травлением разделяет заполненные средой отсеки (рис. 1A). В этом формате клетки могут быть засеяны с любой стороны мембраны, и был разработан широкий спектр экспериментальных протоколов. Тем не менее, эти системы ограничены в своей способности обеспечивать потоки жидкости, необходимые для поддержки созревания барьеров и имитации циркуляции иммунных клеток, наблюдаемой in vivo ^5,6. Следовательно, они не могут быть использованы для исследований, требующих динамических потоков, которые вводят дозы лекарств, механическое раздражение или индуцированные жидкостью сдвиговые напряжения ^6,7,8.

Для преодоления ограничений систем с открытыми скважинами были разработаны микрофлюидные платформы, сочетающие пористые мембраны культур с индивидуально адресуемыми флюидными каналами⁹. Эти платформы обеспечивают точный контроль над маршрутизацией жидкости, перфузией и введением химических соединений, контролируемой стимуляцией сдвига и возможностями динамического добавления клеток 7,10,11,12,13. Несмотря на расширенные возможности, предоставляемые микрофлюидными платформами, они не получили широкого распространения в бионаучных лабораториях из-за сложных микрофлюидных протоколов и их несовместимости с установленными экспериментальными рабочими процессами ^4,10,14.

Чтобы преодолеть разрыв между этими технологиями, мы представляем протокол, в котором используется магнитно реконфигурируемая модульная система. Эта система может легко переключаться между режимами открытой скважины и микрофлюидным режимом в зависимости от конкретных потребностей эксперимента. Платформа представляет собой устройство с открытой лункой, известное как m-μSiM (модульная микрофизиологическая система на основе кремниевой мембраны), с культуральной мембраной (наномембраной) толщиной 100 нм. Эта наномембрана обладает высокой пористостью (15%) и стеклоподобной прозрачностью, как показано на рисунке 1B. Он физически отделяет верхний отсек от нижнего канала, обеспечивая молекулярный транспорт по физиологическим шкалам длины¹⁵. В отличие от обычных трековых мембран, которые имеют известные проблемы при визуализации живых клеток с помощью визуализации в светлом поле, благоприятные оптические и физические свойства наномембраны позволяют четко визуализировать клетки по обе стороны поверхности мембраны ^15,16,17.

В настоящем протоколе описывается изготовление специализированных модулей посева и потока, а также объясняется магнитная реконфигурация платформы. Он демонстрирует, как платформа может быть использована для создания эндотелиальных барьеров как в статических, так и в динамических условиях. Эта демонстрация показывает, что эндотелиальные клетки выстраиваются вдоль направления потока, с повышением регуляции чувствительных к сдвигу генов-мишеней при стимуляции сдвигом.

Данная конструкция может использоваться в различных режимах исходя из экспериментальных требований и предпочтений конечного пользователя. Перед каждым экспериментом сверяйтесь с блок-схемой принятия решений, представленной на рисунке 2 , чтобы определить необходимые шаги и модули для протокола. Например, если пользователь намерен поддерживать формат открытой лунки на протяжении всего эксперимента, чтобы напрямую сравнить его с системой типа Transwell, трафарет шаблона не требуется для засева клеток. Основной модуль коммерчески доступен (см. Таблицу материалов), а ультратонкая наномембрана может быть выбрана из библиотеки материалов с различной пористостью и размером пор в соответствии с экспериментальными потребностями.

1. Изготовление трафарета с рисунком

ПРИМЕЧАНИЕ: Трафарет с рисунком служит для позиционирования клеток исключительно на пористой области мембранного чипа, предотвращая оседание клеток на окружающем кремниевом слое, где они потенциально могут быть повреждены после добавления модуля потока¹⁶ (см. рис. 3). Повреждение монослоя может отрицательно сказаться на целостности барьера и поставить под угрозу результаты эксперимента. Трафарет не нужен в открытой, статичной культуре, так как отсутствует риск повреждения.

1. Приобретите, обработайте или напечатайте на 3D-принтере пресс-форму, используя дизайн, представленный в Дополнительном файле кодирования 1 (Рисунок 4A).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Стенки трафарета сужаются, чтобы увеличить емкость носителя и свести к минимуму захват пузырьков по сравнению с прямыми стенками с высоким соотношением сторон.
2. Прикрепите самоклеящуюся пленку толщиной 130 мкм к акриловому листу толщиной 3,2 мм с помощью холодного валика (см. Таблицу материалов).
3. Лазерная резка акрилового листа в соответствии с дизайном, представленным в Дополнительном файле кодирования 2 , для создания массива полостей (Рисунок 4B).
4. Снимите защитный слой с пленки PSA и приложите акриловый лист к форме.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что лист, вырезанный лазером, выровнен по отношению к пресс-форме так, чтобы элементы пресс-формы были центрированы в полости (Рисунок 4C). От этого шага зависит точность позиционирования клеток на мембране.
5. Тщательно перемешайте преполимер PDMS (используя соотношение оснований и катализаторов 10:1) (см. Таблицу материалов) и дегазируйте его в вакуумной камере до тех пор, пока не останется видимых пузырьков (5-15 минут).
6. Медленно залейте ПДМС в полости формы, разравнивая ее ровным краем.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы предотвратить застревание пузырьков, медленно залейте PDMS в каждую полость. Если после заливки присутствуют пузырьки, поместите форму в вакуумную камеру и снова дегазируйте.
7. Отверждайте PDMS на конфорке при температуре 70 °C в течение 1 часа, а затем дайте ему остыть до комнатной температуры.
8. Извлеките трафареты из полостей формы с помощью пинцета с плоским наконечником.

2. Изготовление модуля потока

ПРИМЕЧАНИЕ: Проточный модуль имеет ту же площадь, что и клеверный колодец основного модуля, и включает в себя формованный микроканал (ширина = 1,5 мм, высота = 0,2 мм, длина = 5 мм). Форма клевера помогает выровнять канал по пористой области культуры (рис. 5).

1. Используйте стандартные методы мягкой литографии¹⁸ для создания кремниевой формы с характеристиками, определенными конструкцией, представленной в дополнительном файле кодирования 3 (рисунок 4D).
2. Прикрепите пленку PSA толщиной 130 мкм к акриловому листу толщиной 3,2 мм.
3. Лазерная резка акрилового листа на основе дизайна, приведенного в Дополнительном файле кодирования 4 , для создания массива полостей в форме клевера (Рисунок 4E).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Высота полости определяет высоту проточного модуля, которая должна быть немного выше (на 0-0,1 мм), чем высота колодца основного модуля, чтобы обеспечить надлежащую герметизацию.
4. Снимите защитный слой с пленки PSA, а затем прикрепите вырезанный лазером лист к силиконовой форме, совместив треугольные метки выравнивания на силиконовой форме с метками на листе, вырезанном лазером.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Аналогично шагу 1.4, убедитесь, что вырезанный лазером акриловый лист выровнен по силиконовой форме так, чтобы элементы пресс-формы были центрированы в каждой полости (Рисунок 4F). На этом шаге определяется положение микроканала относительно посадочного места.
5. Медленно вылейте дегазированный PDMS в полости формы и разровняйте его плоским краем.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если после заливки присутствуют пузырьки, дегазируйте форму, пока пузырьки не будут удалены.
6. Поместите форму на конфорку и выпекайте PDMS при температуре 70 °C в течение 1 часа, затем дайте форме остыть до комнатной температуры.
7. Осторожно извлеките модули потока из полостей пресс-формы с помощью пинцета с плоским наконечником.
8. Сориентируйте модуль потока так, чтобы элементы микроканала были направлены вверх, и расположите впускные и выходные отверстия сердцевины в конце канала с помощью пробойника для биопсии (см. Таблицу материалов).

3. Изготовление нижнего и верхнего акриловых корпусов

ПРИМЕЧАНИЕ: Основной модуль помещается в нижний корпус. Притяжение между встроенными магнитами в корпусах сжимает и уплотняет модуль потока к основному модулю (Рисунок 6).

1. Вырежьте лазером акриловый лист толщиной 2 мм, используя дизайн, приведенный в Дополнительном файле кодирования 5 , чтобы создать верхний корпус с отверстиями для вставки магнита.
2. Прикрепите пленку PSA толщиной 130 мкм к акриловому листу толщиной 3,5 мм.
3. Вырежьте акриловый лист лазером на основе дизайна, приведенного в Дополнительном файле кодирования 6 , чтобы создать нижний корпус с отверстиями для вставки магнита.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Толщина нижнего корпуса является критическим параметром и должна соответствовать общей толщине основного модуля, чтобы предотвратить утечку во время потока.
4. Снимите защитный слой PSA и прикрепите нижний корпус к стеклянному защитному стеклу.
5. Запрессовать никелированные неодимовые магниты диаметром 4,75 мм (см. таблицу материалов) в вырезанные лазером отверстия корпусов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что магниты в нижнем и верхнем корпусах расположены с противоположной полярностью, чтобы обеспечить магнитное притяжение (Рисунок 6).

4. Изготовление проточного контура

ПРИМЕЧАНИЕ: Проточный контур с замкнутым контуром содержит две пробирки для сбора проб в качестве резервуаров (Рисунок 7). Входной резервуар оснащен фильтром из поливинилидендифторида (PVDF), который позволяет клеточной среде уравновешиваться с концентрацией_CO2 в инкубаторе.

1. Используйте пуансон для биопсии диаметром 1 мм, чтобы создать два отверстия в крышке флакона для сбора образцов.
2. С помощью пробойников для биопсии создайте два отверстия (1 мм и 4 мм) в крышке отдельного флакона для сбора образцов и создайте отверстие 1 мм в нижней части этого флакона.
3. Вставьте дозирующие наконечники по 20 г в каждое из отверстий диаметром 1 мм и заклейте их горячим клеем.
4. Поместите фильтр PVDF 0,22 мкм (см. Таблицу материалов) в отверстие диаметром 4 мм и заклейте его горячим клеем.
5. Лазерная резка акрилового листа толщиной 1,5 мм с использованием дизайна, приведенного в Дополнительном файле кодирования 7 , для создания этапа выдержки образца.
6. Расположите резервуары на акриловой сцене.
7. Подсоедините дозирующие наконечники с помощью микропроточных трубок (см. Таблицу материалов).
8. Соедините трубки с входным и выходным отверстиями модуля потока с помощью дозирующих наконечников 21 G.
9. Используйте перистальтический насос (см. Таблицу материалов) для циркуляции потока.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При желании для подачи потока также можно использовать шприц или пневматические насосы. Расход должен определяться исходя из экспериментальных потребностей. Полная таблица, полученная на основе экспериментально проверенной модели COMSOL, приведена в Дополнительной таблице 1 , чтобы помочь пользователям выбрать необходимую скорость потока для достижения желаемого напряжения сдвига в монослое ячейки¹⁶.

5. Посев клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Как и в случае с обычными мембранными вставками, на наномембране можно культивировать различные типы клеток. Вторичный тип клеток также может быть совместно культивирован на другой стороне мембраны в нижнем канале¹⁵.

1. Покройте мембрану 5 мкг/^см2 фибронектина (см. таблицу материалов) при комнатной температуре в течение 1 ч для улучшения прикрепления клеток.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выбранный тип ячейки может повлиять на требуемое покрытие и плотность ячеек. Процедура, описанная здесь, предназначена для эндотелиальных клеток пупочной вены человека (HUVEC, см. Таблицу материалов).
2. Аспирируйте раствор покрытия с помощью пипетки P200 и поместите трафарет с рисунком в лунку модуля сердечника.
3. Добавьте ячеистую среду в лунку и нижний канал устройства.
4. Высевают HUVEC с плотностью 40 000 клеток/^см2 в лунку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: HUVEC при такой плотности обычно образуют сливающийся монослой после 24 ч инкубации^16,19.
5. Поместите прибор в чашку Петри. Добавьте в чашку Петри коническую крышку пробирки объемом 15 мл с деионизированной водой для поддержания локальной влажности.
6. Перенесите чашку Петри в инкубатор.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Клеточные среды в верхнем колодце и нижнем канале устройства следует менять каждые 24 часа. Чтобы заменить фильтрующий материал в нижнем канале, осторожно введите свежий носитель в один из портов, чтобы вытеснить старый носитель из другого порта.

6. Перенастройка в микрофлюидный режим

1. Перед сборкой простерилизуйте верхний корпус, нижний корпус, проточный модуль, резервуары, пробирки и дозирующие наконечники, поместив их в УФ-стерилизационную камеру на 30 минут. Циркулируйте 70% этанол, а затем стерильный PBS в проточном контуре.
2. Заполните резервуары и пробирки средой для выращивания эндотелиальных клеток (см. таблицу материалов).
3. Поместите нижний корпус на предметный столик. Вставьте модуль сердечника с открытым колодцем в нижний корпус.
4. Отсасывайте клеточную среду из лунки модуля. Поместите модуль потока в колодец.
5. Поместите верхний корпус, чтобы уплотнить модуль потока в колодце основного модуля. Подсоедините впускной и выпускной дозирующие наконечники к портам модуля потока.
6. Запустите перистальтический насос, чтобы ввести поток жидкости в систему.

7. Проведение последующего анализа в формате открытой скважины после ввода потока

ПРИМЕЧАНИЕ: Время культивирования здесь зависит от целей эксперимента. Пользователи могут проводить последующий анализ (например, иммуноцитохимию, экстракцию РНК) либо в открытом луночном формате, либо в микрофлюидном формате в зависимости от своих предпочтений. Например, если предпочтительный формат открытой скважины, система должна быть перенастроена для проведения анализов на основе стандартных протоколов^16,19.

1. Остановите насос по достижении желаемого времени воздействия сдвигового потока. Снимите впускной и выпускной дозирующие наконечники.
2. Снимите верхний корпус. Аккуратно извлеките модуль потока из колодца с помощью пинцета.
3. Добавьте в лунку 100 мкл клеточной среды. Проведение желаемых анализов на основе стандартных протоколов.

Модуль керна открытого колодца первоначально размещается в специальной полости, образованной нижним корпусом и покровным стеклом, как показано на рисунке 6A. Затем модуль потока, включающий в себя микроканал и порты доступа, вставляется в лунку основного модуля. Модуль потока надежно прилегает к кремниевому опорному слою мембраны за счет силы магнитного притяжения между магнитами, встроенными в нижний и верхний корпуса, как показано на рисунке 6B. Для оценки эффективности этого механизма магнитной фиксации было проведено испытание на разрывное давление, продемонстрировавшее, что система может выдерживать тупиковые давления до 38,8 ± 2,4 кПа. Этот допуск к давлению значительно превышает типичное рабочее давление, встречающееся при работе с клеточными культурами. Кроме того, система не допускает утечек при воздействии скорости потока до 4000 мкл/мин, что эквивалентно напряжению сдвига 74 дин/см2 в области культивирования16.

При разработке платформы, которая может переключаться между режимами открытой скважины и микрофлюидным режимом, необходимо тщательно рассмотреть подход к засеиванию клеток, который обычно не является проблемой для обычных статических платформ с открытой скважиной16. Повреждение монослоя вокруг границы канала может привести к осложнениям в результатах экспериментов20. Для решения этой проблемы был разработан съемный трафарет, который помещается в открытую лунку основного модуля и обеспечивает определенное окно для предпочтительного оседания клеток на поверхности мембраны (рис. 3). После того, как монослой ячейки сформирован и достигает слияния, пользователь может продолжить эксперимент в формате открытой лунки или перенастроить платформу в микрофлюидный режим, чтобы подвергнуть монослой клетки физиологическому напряжению сдвига (рис. 3). Магнитный механизм фиксации обеспечивает возможность легкого переключения между форматами с открытой скважиной и микрофлюидными форматами по мере необходимости. Например, устройство может быть возвращено к формату открытой лунки после стимуляции потока, предлагая пользователям гибкость для проведения различных анализов (таких как иммуноокрашивание, экстракция РНК и измерение молекулярной проницаемости) с использованием стандартных экспериментальных протоколов15,16.

В физиологических условиях человеческого организма сосудистый барьер подвергается индуцированному потоком сдвиговому напряжению, которое служит ключевым биофизическим сигналом, влияющим на структуру и функцию барьера 5,21,22. Таким образом, добавление потока жидкости в микрофизиологические системы является ключевым требованием. Для демонстрации универсальности платформы был установлен монопласт HUVEC в формате открытого колодца с использованием стандартных протоколов. После 24 часов статического культивирования платформа была перенастроена в микрофлюидный режим, чтобы подвергнуть монослой клетки напряжению сдвига 10,7 дин/см2 в течение 24 часов. Результаты показали, что клетки, культивируемые под потоком, выравнивались по направлению потока, в то время как клетки, культивируемые без потока, оставались случайно ориентированными (рис. 8A, B). После стимуляции сдвига платформа была перенастроена на формат открытой лунки для извлечения РНК по стандартным протоколам. Результаты показали, что воздействие на клетки сдвигового стресса привело к повышению регуляции круппель-подобного фактора 2 (KLF2) и эндотелиальной синтазы оксида азота (eNOS), которые выполняют важнейшие роли, такие как антитромботические и атеропротекторные функции в здоровых кровеносных сосудах23,24 (рис. 8C).

Рисунок 1: Сравнение моделей сосудистого барьера in vitro . Схематическое изображение (A) обычных Transwell-подобных вставок и (B) открытой лунки m-μSiM. Светлопольные изображения сливающегося монослоя HUVEC подчеркивают разницу в качестве изображения в светлом поле между трековой мембраной и ультратонкой наномембраной. Масштабные линейки = 100 мкм. По материалам Mansouri et al.16. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Блок-схема принятия решений. Блок-схема, основанная на экспериментальных потребностях и предпочтениях последующего анализа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Экспериментальный рабочий процесс платформы. (A) Для непосредственного позиционирования клеток на пористой мембране в лунку основного модуля вставляется съемный трафарет с рисунком (на врезке показаны узорчатые ячейки, желтые линии демонстрируют границы микроканалов). (B) Трафарет можно хранить или извлекать в устройстве для статической клеточной культуры. (C) Для перенастройки платформы в микрофлюидный режим трафарет заменяется модулем потока. Благодаря механизму магнитного уплотнения конфигурация является обратимой; Корпуса и модуль расхода могут быть сняты для переключения в режим открытого колодца. Масштабная линейка = 200 мкм. По материалам Mansouri et al.16. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Схематическое изображение пресс-форм. (А) Трафаретная форма. (B) Акриловый лист, вырезанный лазером. (C) Собранный вид трафаретной формы. (D) Пресс-форма для модуля потока. (E) Акриловый лист, вырезанный лазером. (F) Собранный вид пресс-формы модуля потока. Элементы треугольной формы являются метками выравнивания для облегчения крепления акриловых листов к формам. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5: Схема модуля потока в форме клевера. (A) Контактный интерфейс между модулем потока и мембранным чипом. Впускные и выпускные отверстия для потока жидкости показаны розовым цветом. (B) 3D-изображение модуля потока PDMS. По материалам Mansouri et al.16. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 6: Магнитный узел для реконфигурации устройства. (A) Схематическая демонстрация компонентов для перенастройки устройства в микрофлюидный режим. Встроенные магниты с противоположными полюсами вызывают притяжение для уплотнения. (B) Вид в поперечном сечении реконфигурированного устройства, показывающий сосудистый канал розовым цветом и тканевый отсек зеленым цветом. По материалам Mansouri et al.16. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 7: Собранный вид проточного контура. Контур состоит из перистальтического насоса, двух резервуаров для подачи ячеистой среды и демпфирования колебаний, трубки и акриловой ступени для удержания компонентов на месте. По материалам Mansouri et al.16. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 8: Сравнение HUVEC, культивируемых в открытом и микрофлюидном режимах. Клетки высевали и культивировали в открытом лунке в течение 24 ч для создания сливающегося монослоя. В течение последующих 24 часов один комплект устройств был перенастроен в микрофлюидный режим. (A) Клетки, культивируемые под действием потока (напряжение сдвига 10,7 dynes.cm-2 ), выровненные вдоль направления потока (на врезке актин и ядра клеток показаны зеленым и синим цветом соответственно). (B) Клетки, культивируемые без потока в формате открытых лунок, не показали выравнивания. Длина столбцов на радиолокационных графиках показывает количество ячеек в соответствующем направлении. (C) Клетки, культивируемые под потоком, показали более высокую регуляцию генов KLF2 и eNOS по сравнению с состоянием отсутствия потока (**p < 0,01, n = 3, среднее ± SD). Масштабные линейки = 100 мкм. По материалам Mansouri et al.16. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительная таблица 1: Напряжение сдвига на поверхности наномембраны при различных скоростях потока. В этой таблице приведена информация о значениях напряжения сдвига на поверхности наномембраны при различных скоростях потока. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл кодирования 1: CAD-модель трафаретной формы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл кодирования 2: CAD-модель полостей лазерной резки для трафаретной формы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл кодирования 3: CAD-модель модуля потока. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл кодирования 4: CAD-модель полостей лазерной резки для пресс-формы модуля потока. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл кодирования 5: CAD-модель верхнего корпуса. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл кодирования 6: CAD-модель нижнего корпуса. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл кодирования 7: CAD-модель акрилового столика. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

J.L.M. является соучредителем SiMPore, Inc. и владеет долей в уставном капитале компании. SiMPore коммерциализирует ультратонкие технологии на основе кремния, включая мембраны, используемые в этом исследовании.