Этот протокол описывает реконфигурируемую платформу клеточных культур на основе мембраны, которая объединяет формат открытой лунки с возможностями потока жидкости. Эта платформа совместима со стандартными протоколами и позволяет осуществлять обратимые переходы между режимами культивирования в открытых лунках и микрофлюидными культурами, удовлетворяя потребности как инженерных, так и бионаучных лабораторий.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Преобразование статических барьерных моделей тканей в динамические микрофизиологические системы
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Микрофизиологические системы представляют собой миниатюрные платформы для клеточных культур, используемые для имитации структуры и функций тканей человека в лабораторных условиях. Тем не менее, эти платформы не получили широкого распространения в бионаучных лабораториях, где мембранные подходы с открытыми лунками служат золотым стандартом для имитации тканевых барьеров, несмотря на отсутствие возможностей для потока жидкости. Эта проблема может быть связана, прежде всего, с несовместимостью существующих микрофизиологических систем со стандартными протоколами и инструментами, разработанными для систем с открытыми лунками.
В этой статье мы представляем протокол для создания реконфигурируемой мембранной платформы со структурой открытого ствола, возможностью увеличения потока и совместимостью с обычными протоколами. В этой системе используется подход магнитной сборки, который обеспечивает обратимое переключение между режимами открытой скважины и микрофлюидным режимом. При таком подходе пользователи могут начать эксперимент в формате открытой скважины с использованием стандартных протоколов и добавлять или удалять возможности потока по мере необходимости. Для демонстрации практического использования этой системы и ее совместимости со стандартными методиками был создан монослой эндотелиальных клеток в формате открытого лунки. Система была перенастроена для введения потока жидкости, а затем переведена в формат открытой лунки для проведения иммуноокрашивания и экстракции РНК. Благодаря совместимости с традиционными протоколами работы с открытыми скважинами и возможности увеличения потока, ожидается, что эта реконфигурируемая конструкция будет принята как инженерными, так и биологическими лабораториями.
Введение
Сосудистые барьеры служат критически важным интерфейсом, который отделяет отсек крови от окружающих тканей. Они играют важнейшую роль в сохранении гомеостаза, привлекая иммунные клетки, контролируя молекулярную проницаемость и защищая от вторжения патогенов в ткань 1,2. Были разработаны модели культивирования in vitro, имитирующие микроокружение in vivo, что позволяет систематически исследовать факторы и условия, влияющие на барьерные свойства как в здоровом, так и в больном состоянии 3,4.
Наиболее широко используем....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Данная конструкция может использоваться в различных режимах исходя из экспериментальных требований и предпочтений конечного пользователя. Перед каждым экспериментом сверяйтесь с блок-схемой принятия решений, представленной на рисунке 2 , чтобы определить необходимые шаги и модули для протокола. Например, если пользователь намерен поддерживать формат открытой лунки на протяжении всего эксперимента, чтобы напрямую сравнить его с системой типа Transwell, трафарет шаблона не требуется для засева клеток. Основной модуль коммерчески доступен (см. Таблицу материалов), а ультратонкая наномембрана может быть выбрана из библиотеки ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Модуль керна открытого колодца первоначально размещается в специальной полости, образованной нижним корпусом и покровным стеклом, как показано на рисунке 6A. Затем модуль потока, включающий в себя микроканал и порты доступа, вставляется в лунку основного модуля. Модуль потока надежно прилегает к кремниевому опорному слою мембраны за счет силы магнитного притяжения между магнитами, встроенными в нижний и верхний корпуса, как показано на рисунке 6B. Для оценки эфф.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Целью данного протокола является разработка практического метода включения возможностей потока в открытую платформу с ультратонкой наномембраной. В данной конструкции используется магнитная фиксация, позволяющая переключаться между открытым и флюидным режимами во время экспериментов и сочетать преимущества обоих подходов. В отличие от обычных стационарно скрепленных платформ, магнитная фиксация позволяет разбирать платформу в удобных точках во время экспериментального рабочего процесса 16,25,26,27.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
J.L.M. является соучредителем SiMPore, Inc. и владеет долей в уставном капитале компании. SiMPore коммерциализирует ультратонкие технологии на основе кремния, включая мембраны, используемые в этом исследовании.
Благодарности
Это исследование было частично профинансировано Национальным институтом здравоохранения в рамках грантов R43GM137651, R61HL154249, R16GM146687 и гранта NSF CBET 2150798. Авторы благодарят RIT Machine Shop за изготовление алюминиевых форм. Содержание является исключительной ответственностью авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения Национальных институтов здравоохранения.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 0,5 x 0,86 Микропроточные трубки | Langer Instruments | WX10-14 & | |
| 1 мм, Integra Miltex | VWR | 95039-090 | |
| 1x PBS 7,4 pH | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| 20 калибр Дозирующий наконечник серии | IT Jensen | Global JG20-1,5X | |
| 21 КАЛИБР NT PREMIUM SERIES УГЛОВОЙ ДОЗИРУЮЩИЙ НАКОНЕЧНИК | Jensen Global | JG21-1.0HPX-90 | |
| 3M 467 MP Чувствительный к давлению клей (ПСА) | DigiKey | 3M9726-ND | |
| 3M 468 MP Чувствительный к давлению клей (ПСА) | DigiKey | 3M9720-ND | |
| AlexaFluor 488 сопряженный фаллоидин | ThermoFisher Scientific | A12379 | |
| Прикладные биосистемы TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444556 | |
| Бычья сыворотка Альбумин (БСА), Фракция V, 98%, Реагент, Альфа Аэзар, Размер = 10 г | VWR | AAJ64100-09 | |
| Прозрачный устойчивый к царапинам и ультрафиолетовому излучению литой акриловый лист | McMaster-Carr | 8560K171 | 12" x 12" x 1/16" |
| Прозрачный литой акриловый лист, устойчивый к царапинам и ультрафиолетовому излучению | McMaster-Carr | 8589K31 | 12" x 12" x 3/32" |
| Прозрачный устойчивый к царапинам и ультрафиолетовому излучению литой акриловый лист | McMaster-Carr | 8560K191 | 12" x 12" x 7.64" |
| Corning Фибронектин, человек, 1 мг | Corning | 47743-728 | |
| Защитные очки, Globe Scientific, Д x Ш = 24 x 60 мм | VWR | 10118-677 | |
| DOW SYLGARD 184 СИЛИКОНОВЫЙ ИНКАПСУЛЯТОР ПРОЗРАЧНЫЙ 0,5 КГ КОМПЛЕКТ | Ellsworth Адгезивы | 4019862 | |
| EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | |
| Fixture A1& A2 | SiMPore Inc. | Приспособление для Северной Америки | |
| B1 и B2 | SiMPore Inc. | NA | |
| Набор для обратной транскрипции кДНК высокой емкости с ингибитором РНКазы | Thermo Fisher Scientific | 4374966 | |
| эндотелиальных клеток пуповинных вен человека (HUVEC) | ThermoFisher Scientific | C0035C | |
| Набор для визуализации живых/мертвых клеток (488/570) | Thermo Fisher Scientific | R37601 | |
| Молекулярные зонды Hoechst 33342, тригидрохлорид, тригидрат | Никелированные магниты Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| (диаметр 4,75 мм, усилие натяжения 0,34 кг) | K & J Magnetics | D31 | 3/16" диаметр. x 1/16" густой |
| параформальдегид, 4% w/v акв. солн., без метанола, Alfa Aesar | Fisher Scientific | aa47392-9M | |
| Перистальтический насос | Langer Instruments | BQ50-1J-A | |
| Фоторезист SU-8 раствор проявителя | Fisher Scientific | NC9901158 | |
| PVDF шприцевые фильтры | PerkinElmer | 2542913 | |
| кремниевая пластина | Университетская пластина,США | 1196 | |
| SU-8 3050 | Научный | NC0702369 | |
| Fisher Целевой ген: eNOS (Hs01574659_m1) | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
| Целевой ген: GAPDH (Hs02786624_g1) | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
| Целевой ген: KLF2 (Hs00360439_g1) | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
| Термо Научный Pierce 20x PBS Tween 20 | Thermo Fisher Scientific | 28352 | |
| Транспортная трубка Образец Белые колпачки, 5 мл, Стерильный | VWR | 100500-422 | |
| ТРИ-реагент | ThermoFisher Scientific | AM9738 | |
| Ультратонкий нанопористый мембранный чип | SiMPore Inc. | NPSN100-1L | Конструкция совместима со всеми мембранами SiMPore |
| uSiM component 1 | SiMPore Inc. | NA | |
| uSiM компонент 2 | SiMPore Inc. | NA |
Ссылки
- Claesson-Welsh, L., Dejana, E., McDonald, D. M. Permeability of the Endothelial Barrier: Identifying and Reconciling Controversies. Trends in Molecular Medicine. 27 (4), 314-331 (2021).
- Vera, D., et al. Engineering t....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
