Было показано, что ассоциирование перевязки печени и перевязки воротной вены для этапной гепатэктомии (ALPPS) приводит к заметной регенерации печени через несколько недель после операции первого этапа. Животные модели, которым была проведена ALPPS, были разработаны для изучения потенциальной способности печени к регенерации и достижения благоприятных клинических результатов.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Мышиная модель ассоциативного пересечения печени и лигирования воротной вены для процедуры этапной гепатэктомии с помощью микроскопии
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Гепатэктомия широко рассматривается как основной метод лечения злокачественных новообразований печени; Тем не менее, послеоперационная печеночная недостаточность остается основной причиной периоперационной смертности, серьезно влияя на исходы лечения пациентов. В здоровой печеночной среде будущий остаток печени (FLR) должен превышать 25%, а в случаях цирроза это требование увеличивается до более чем 40%. Недостаточность FLR в настоящее время является основным препятствием в прогрессировании хирургии печени.
Традиционные методы усиления гипертрофии FLR в основном сосредоточены на эмболизации воротной вены (ПВЕ), но ее эффективность значительно ограничена. В последние годы появились многочисленные сообщения о новом методе двухфазной гепатэктомии, включающем разделение печени и перевязку воротной вены, известный как ассоциативное разделение печени и лигирование воротной вены для этапной гепатэктомии (ALPPS). ALPPS превосходит ПВЕ по эффективной и значительной индуцированию гипертрофии FLR. Тем не менее, детально изученные механизмы, управляющие регенерацией печени при содействии ALPPS, до конца не изучены. Таким образом, репликация ALPPS на животных моделях имеет решающее значение для тщательного исследования молекулярных механизмов регенерации печени, предлагая ценные теоретические и практические знания.
Введение
Печень обладает огромным регенеративным потенциалом, быстро пролиферируя и восстанавливая метаболические потребности в течение всего 3 месяцев после резекции при различных заболеваниях печени1. Тем не менее, необходимость установления полноты опухолевых краев обусловливает необходимость неизбежности обширного печеночного иссечения. Таким образом, обеспечение достаточного объема партисипативной печеночной среды, известной как будущий остаток печени (FLR), приобретает первостепенное значение2. За последние несколько десятилетий ALPPS стала прорывным методом в хирургии печени, специально разработанным для пациентов с недостаточным остаточным объемом печени после резекции опухоли, что было объявлено одним из самых благоприятных прорывов в области онкохирургии печени3.
Значительный прогресс был достигнут в разработке животных моделей ALPPS. Идеальная модель обычно требует независимого притока крови (воротная вена и печеночная артерия) и оттока (печеночная вена) в сохраненной печеночной доле и четкого разделения между сохраненной и подлежащей резецации печеночных долей для предотвращения коллатеральногокровообращения. Хотя АЛПП стимулирует быструю регенерацию печени в оставшейся ткани печени, конкретные механизмы этого процесса до сих пор неясны.
В настоящее время модели ALPPS подразделяются на три типа: модели крупных животных (например, свиней и овец), модели среднего размера (например, кролики и грызуны) и маленькие модели (например, мыши)5. Использование мышей, с их быстрым размножением и легкостью генетической модификации, особенно эффективно для углубленного изучения механизмов регенерации печени6. Кроме того, строение печени мышей, особенно их средняя печеночная вена, очень похоже на строение печени человека, что делает их очень подходящими для разработки модели ALPPS.
Важно отметить, что большинство пациентов с гепатоцеллюлярной карциномой в клинической практике имеют фоновые заболевания печени, в отличие от моделей здоровой печени, обычно используемых в исследованиях7. Таким образом, использование мышей с предварительно подготовленным фиброзом печени или вирусными инфекциями может более точно моделировать хирургические реакции и послеоперационную регенерацию печени, наблюдаемую у пациентов с различными заболеваниями печени8. Такой подход может выявить новые терапевтические мишени, имеющие клиническую значимость.
До сих пор несколько известных исследовательских групп, таких как Университет Цюриха и Токийский университет, успешно разработали модели ALPPS 9,10 для мышей. Создание стандартизированной модели мыши в контролируемых условиях может улучшить наше понимание быстрой регенерации печени, наблюдаемой после процедур ALPPS.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все эксперименты в этом протоколе были одобрены ветеринарными органами Народной больницы провинции Цзянси (номер 70/2022). Кроме того, все экспериментальные этапы были выполнены в строгом соответствии с требованиями Комитета по уходу и использованию институциональных животных.
1. Начало операции
Самцы мышей C57BL/6 весом 20-22 г содержались в хорошо проветриваемой клетке, содержащейся в стандартной среде, свободной от патогенов, с циклом свет/темнота 12 ч/12 ч. Животным был предоставлен свободный доступ к пище и воде при контролируемой температуре окружающей среды 22 ± 1 °C. Операция проводилась в специализированном микрохирургическом кабинете с использованием хирургического микроскопа (рис. 1). Мышей в фиктивной группе оперировали только лапаротомией, но операция на печени не проводилась. В группе ПВЛ была перевязана часть ветвей воротной вены, а в группе АЛППС средняя доля печени была пересечена на основе лигирования воротной вены (ПВЛ).
- Подвергните мышей 4-6-часовому предоперационному периоду голодания.
ПРИМЕЧАНИЕ: Голодание необходимо, потому что прием пищи вызывает выпячивание желудка у мышей, это приводит к плохому операционному полю и подвержено случайному повреждению стенки желудка. - Расположите стерильные хирургические инструменты, в том числе микрощипцы, ножницы, абдоминальные ретракторы, а также заранее подготовленные 8-0 Лигатурные нити для воротной вены, на приставном столике. Замочите интраоперационные материалы, состоящие из стерильной марли и ватных шариков, в физиологическом растворе при температуре 37 °C.
- Для индукции животным подвергают воздействию 5% v/v изофлурана в течение 30 с с последующей поддерживающей анестезией с использованием 3 об.% изофлурана до достижения глубокого обезболивающего состояния. Исследуйте рефлекс защемления пальца ноги, чтобы выяснить уровень анестезии. Подкожно вводят медетомидин в дозе 5 мг/кг во время фазы индукции.
- Нанесите мазь на глаза животных и введите подкожно 1 мл раствора лактата Рингера, смешанного с 5% глюкозой, разделив дозу поровну между нижней частью живота с каждой стороны.
- Тщательно выбрейте брюшную область с помощью небольших машинок для стрижки шерсти животных, охватывающей боковую область шириной 2 см от мечевидного отростка до области гениталий.
- Тщательно продезинфицируйте место операции 3 раза, чередуя раунды повидон-йода и спирта.
- Сделайте разрез по средней линии длиной 2,5-3,0 см на коже с помощью хирургического скальпеля, затем с помощью хирургических ножниц деликатно вскройте брюшную полость.
- Используйте брюшной ретрактор для расширения разреза, способствуя мягкому вытяжению двенадцатиперстной кишки и сегмента тонкой кишки с помощью стерильных влажных ватных тампонов. Накройте эти структуры заранее подготовленной стерильной марлей, одновременно обнажая печеночный сегмент воротной вены.
2. Перевязка воротной вены (ПВЛ)
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что все действия были мягкими на протяжении всей процедуры. Используйте смоченные ватные тампоны при манипуляциях с тканями печени.
- Отшелушите брюшину и кишечный тракт и убедитесь, что воротная вена полностью обнажена.
- Обнажая главную портальную вену, продолжайте огибать ее ветви, используя медленные, преднамеренные движения вперед, толкающие и расширяющиеся.
- Последовательно определите различные ветви воротной вены в следующем порядке: (1) правая задняя ветвь, (2) объединенная левая боковая и левая срединная ветви и (3) хвостатая ветвь (рис. 2А).
3. Диссекция правой задней ветви воротной вены
- Пройдя по воротам печени через главную воротную вену, обратите внимание на заметную ветвь правой задней доли, которая стала видимой.
- Используйте смоченные ватные тампоны в качестве наполнителя и отделите среднюю долю печени и правую заднюю долю, чтобы избежать потенциальной травмы.
- Обязательно рассеките вдоль капсулы Глиссона (брюшину, которая простирается над поверхностью печени) и натяните шелк длиной 1,5 см, чтобы обвязать вокруг воротной жилки ветви.
- Перевязать правую заднюю ветвь воротной вены 8-0 шелковый шовный материал. Надежным показателем успешной перевязки воротной вены является видимая бледность печени.
4. Диссекция левой боковой и левой медиальной ветвей воротной вены
- Левая латеральная доля (LLL) и левая медиальная доля (love my life) имеют общую главную воротную вену. Обязательно рассмотрите любую потенциальную щель между LLL и хвостатой долей.
ПРИМЕЧАНИЕ: Лигирование LLL и ветвей воротной вены «Люби мою жизнь» является самым сложным в этой хирургической модели, потому что микрощипцы должны проходить через пространство вокруг воротной вены и избегать повреждения печени. - Введите микрощипцы через вход в шаге 4.1 и двигайте рукой медленно, так как даже малейшее сопротивление намекает на потенциальную близость к печени или кровеносным сосудам.
- Когда вы почувствуете сопротивление, слегка отрегулируйте микрощипцы так, чтобы они двигались вперед и через поверхность капсулы Глиссона правой медиальной доли (РМЛ) (рис. 3C).
- Используйте подготовленный 8-0 шелковый шов завязать вокруг воротной вены LLL и любить свою жизнь ветки. Ищите поразительную ишемическую демаркацию в средней доле печени, в то время как левая доля становится бледной после перевязки ветвей воротной вены.
5. Рассечение хвостатой ветви воротной вены
- Рассеките хвостатую долю и с помощью ватной палочки заполните потенциальное пространство между главной воротной веной и хвостатой долей.
- Снимите кожуру брюшины хвостатых долей, чтобы визуализировать воротную жилку ветвей мочки.
- Используйте шовный материал, а не завязывание, чтобы перевязать хвостатую ветвь, следя за тем, чтобы траектория иглы адекватно оборачивала хвостатую ветвь воротной вены.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сложность перевязки хвостатой ветви воротной вены заключается в том, что воротная вена хвостатой доли инкапсулирует ткань печени и находится близко к основной воротной вене. Рекомендуется глубина проникновения иглы 1 мм.
6. Пересечение печени и холецистэктомия
- Обратите внимание на четкую демаркационную линию в средней доле печени и выполните пересечение вдоль этой линии (Рисунок 2B).
- С помощью пера для электрокоагуляции создайте линию предварительного среза 0,5 мм вдоль линии разграничения.
- С помощью микрощипцов и электрокаутерной ручки разрежьте ткань печени, применяя ватные палочки для остановки кровотечения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сложность при пересечении заключается в том, чтобы освоить глубину. Цель состоит в том, чтобы расщепить печень как можно ближе к полой вене. Интраоперационного кровотечения трудно избежать, и оно требует повторяющейся практики для освоения глубины пересечения. Для усиления гемостаза можно использовать горячее обжигание, ватные палочки и желатиновые губки. - Удалите желчный пузырь в последнюю очередь, так как это обеспечит хорошую точку втягивания в течение всей операции.
- Используйте ватный тампон для контролируемого давления для гемостаза, и если кровотечение продолжается, нижняя полая вена повреждается, и эффект от наложения швов будет плохим; Усыпите животное без раздумий.
7. Заключительные этапы операции
- Обеспечьте тщательное размещение тонкой кишки в брюшной полости перед закрытием.
- Надежно закройте брюшину и брюшную стенку с помощью рассасывающихся швов 6-0, а кожу - с помощью рассасывающихся швов 4-0.
- Еще раз продезинфицируйте поверхность кожи, чтобы обеспечить оптимальную чистоту.
- Подкожно введите 1 мл физиологического раствора и фентанила 0,02 мг/кг плюс мелоксикам 4 мг/кг в место разреза для облегчения послеоперационной боли и устранения любой дополнительной интраоперационной потери жидкости.
- Поместите животное на утепленную поверхность, чтобы облегчить естественное пробуждение, и следите за кровоснабжением их конечностей. Затем поместите их по отдельности в клетки для продолжения наблюдения, когда они придут в сознание.
- Подкожно ввести медетомидин в дозе 4 мг/кг после выздоровления, продолжая в течение 24 ч после операции.
8. Интраоперационное измерение регенерации и функции печени
- Усыпьте мышей и соберите образцы печени и крови с интервалом в 1, 2, 3 и 7 дней после операции.
- Выполнить окрашивание ПЭ и исследование функции печени и исследовать маркеры воспаления в сыворотке крови, тем самым обеспечив дополнительную валидацию влияния конструкции модели.
- Задокументируйте ежедневные изменения массы тела и соотношения FLR/BW (массы тела) у мышей в течение 1 недели после хирургической процедуры.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
В отличие от ПВЛ (этапы 2,3,4 и 5 протокола), мыши, подвергшиеся хирургическому вмешательству ALPPS (шаги 2,3,4,5 и 6), продемонстрировали повышенную склонность к клеточной пролиферации. На рисунке 2 показана ишемическая демаркация средней доли печени после перевязки воротной вены, а также поле зрения во время пересечения печени, что представляет собой ключевое различие между ALPPS и PVL. Примечательно, что уровни медиаторов воспаления, в том числе фактора некроза опухоли-α (TNF-α), интерлей...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В этом исследовании представлен протокол начальной фазы операции ALPPS у мышей, включающей частичное перевязку воротной вены и разделение срединной доли печени. Этот метод очень похож на процедуру ALPPS человека, при этом уникальная дольчатая структура печени мыши и двойное портальное венозное снабжение срединной доли обеспечивают отчетливый кровотокпосле операции. Следует отметить, что процедура ALPPS состоит из двух отдельных хирургических этапов. В этом исследо...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявить.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 5% глюкоза для инъекций (500 мл) | Shapuaisi pharma (http://www.zjspas.com/) | H20003666 | Эффективный, дешевый, легкодоступный |
| наркозный аппарат | RWD (www.rwdls.com) | R500 | низкая цена и ценное качество. Подходит для операций с новичками |
| C57 BL/6 | The Jackson Lab | 22349-2023 | Стабильность штаммов |
| изофлуран | KCSW (kcsw.szqisoubao.com) | H19980141 | прочный, экономичный |
| мелоксикам | Boehringer-Ingelheim | H20020217 | Прочные и эффективные |
| микрощипцы | могут 60018920 | Прочные и эффективные | |
| микроинструмент | CH микрохирургический инструмент завод | HC-A804-1 | прочный, экономичный |
| звон лактата натрия | Shapuaisi pharma (http://www.zjspas.com/) | H20193277 | Эффективный, дешевый, легкодоступный |
| шовный материал | CH микрохирургический инструмент завод | 6-0/8-0 | высокое соотношение производительность-цена |
| топические антитела | chenxin фармакология ( www.cisen-pharma.com) | H20020217 | Эффективно предотвращают инфицирование при разрезе |
Ссылки
- Michalopoulos, G. K., Bhushan, B. Liver regeneration: Biological and pathological mechanisms and implications. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 18 (1), 40-55 (2021).
- Chapelle, T., et al. Estimation of the future remnant liver function is a better tool to pr edict post-hepatectomy liver failure than platelet-based liver scores. Eur J Surg Oncol. 43 (12), 2277-2284 (2017).
- Isfordink, C. J., et al. Portal vein ligation versus portal vein embolization for induction of hypertrophy of the future liver remnant: A systematic review and meta-analysis. Surg Oncol. 26 (3), 257-267 (2017).
- Linecker, M., et al. Risk adjustment in alpps is associated with a dramatic decrease in ear ly mortality and morbidity. Ann Surg. 266 (5), 779-786 (2017).
- Darnis, B., et al. Subtotal hepatectomy in swine for studying small-for-size syndrome and portal inflow modulation: Is it reliable. HPB (Oxford). 17 (10), 881-888 (2015).
- Casellas, J. Inbred mouse strains and genetic stability: A review. Animal. 5 (1), 1-7 (2011).
- Zhang, J., et al. Evolution of associating liver partition and portal vein ligation for staged hepatectomy from 2012 to 2021: A bibliometric analysis. Review. Int J Surg. 103, 106648(2022).
- Parola, M., Pinzani, M. Liver fibrosis: Pathophysiology, pathogenetic targets and clinical iss ues. Mol Aspects Med. 65, 37-55 (2019).
- Kikuchi, Y., et al. Impact of associating liver partition and portal vein occlusion for st aged hepatectomy on tumor growth in a mouse model of liver metastasis. Eur J Surg Oncol. 44 (1), 130-138 (2018).
- Schlegel, A., et al. Alpps: From human to mice highlighting accelerated and novel mechanism s of liver regeneration. Ann Surg. 260 (5), 839-846 (2014).
- Dili, A., Lebrun, V., Bertrand, C., Leclercq, I. A. Associating liver partition and portal vein ligation for staged hepate ctomy: Establishment of an animal model with insufficient liver remnan t. Lab Invest. 99 (5), 698-707 (2019).
- Schadde, E., Hertl, M., Breitenstein, S., Beck-Schimmer, B., Schläpfer, M. Rat model of the associating liver partition and portal vein ligation for staged hepatectomy (alpps) procedure. J Vis Exp. (126), e55895(2017).
- Allaire, M., et al. New frontiers in liver resection for hepatocellular carcinoma. JHEP Rep. 2 (4), 100134(2020).
- Memi, F., Ntokou, A., Papangeli, I. Crispr/cas9 gene-editing: Research technologies, clinical applications and ethical considerations. Semin Perinatol. 42 (8), 487-500 (2018).
- Saviano, A., Henderson, N. C., Baumert, T. F. Single-cell genomics and spatial transcriptomics: Discovery of novel cell states and cellular interactions in liver physiology and disease biology. J Hepatol. 73 (5), 1219-1230 (2020).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
