Здесь мы представляем простой метод прямого наблюдения и автоматизированного измерения устьичных реакций на бактериальную инвазию у Arabidopsis thaliana. В этом методе используется портативное устройство визуализации устьиц вместе с конвейером анализа изображений, предназначенным для изображений листьев, полученных устройством.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Прямое наблюдение и автоматизированное измерение ответов устьиц на синегнойную палочку pv. помидор DC3000 в Arabidopsis thaliana
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Устьица – это микроскопические поры, находящиеся в эпидермисе листьев растений. Регуляция устьичной апертуры имеет решающее значение не только для балансировки поглощения углекислого газа для фотосинтеза и транспирационной потери воды, но и для ограничения бактериальной инвазии. В то время как растения закрывают устьица при распознавании микробов, патогенные бактерии, такие как Pseudomonas syringae pv. помидор DC3000 (PTO), снова откройте закрытые устьица, чтобы получить доступ к внутренней части листа. В традиционных анализах для оценки реакции устьиц на бактериальную инвазию эпидермальные оболочки листьев, листовые диски или отделившиеся листья плавают на бактериальной суспензии, а затем устьица наблюдают под микроскопом с последующим ручным измерением устьичного отверстия. Однако эти анализы громоздки и могут не отражать устьичные реакции на естественную бактериальную инвазию в листе, прикрепленном к растению. Недавно было разработано портативное устройство визуализации, которое может наблюдать за устьицами, прищипывая лист, не отрывая его от растения, вместе с конвейером анализа изображений на основе глубокого обучения, предназначенным для автоматического измерения апертуры устьиц по изображениям листьев, полученным устройством. Здесь, основываясь на этих технических достижениях, представлен новый метод оценки устьичных реакций на бактериальную инвазию у Arabidopsis thaliana . Этот метод состоит из трех простых этапов: распылительная инокуляция Pto , имитирующая естественные инфекционные процессы, непосредственное наблюдение устьиц на листе растения, инокулированного Pto, с помощью портативного устройства визуализации и автоматизированное измерение апертуры устьиц с помощью конвейера анализа изображений. Этот метод был успешно использован для демонстрации закрытия и повторного открытия устьиц во время инвазии Pto в условиях, которые близко имитируют естественное взаимодействие растений и бактерий.
Введение
Устьица представляют собой микроскопические поры, окруженные парой защитных клеток на поверхности листьев и других надземных частей растений. В постоянно меняющихся условиях регулирование устьичного отверстия является центральным для растений, чтобы контролировать поглощение углекислого газа, необходимого для фотосинтеза, за счет потери воды через транспирацию. Таким образом, количественная оценка устьичного отверстия сыграла важную роль в понимании адаптации растений к окружающей среде. Тем не менее, количественная оценка устьичной апертуры по своей сути является трудоемкой и громоздкой, поскольку требует человеческого труда, чтобы обнаружить и измерить устьичные поры на изображении листа, полученном микроскопом. Чтобы обойти эти ограничения, были разработаны различные методы, облегчающие количественную оценку устьичных апертур у Arabidopsis thaliana, модельного растения, широко используемого для изучения биологии устьиц 1,2,3,4,5,6. Например, порометр может быть использован для измерения скорости транспирации в качестве показателя устьичной проводимости. Однако этот метод не дает прямой информации о устьичном числе и апертуре, определяющих устьичную проводимость. В некоторых исследованиях использовались методы конфокальной микроскопии, выделяющие устьичные поры с использованием флуоресцентного актинового маркера, флуоресцентного красителя или автофлуоресценции клеточной стенки 1,2,3,4,5. Несмотря на то, что эти подходы облегчают обнаружение устьиц, затраты как на эксплуатацию установки конфокальной микроскопии, так и на подготовку образцов для микроскопии могут стать препятствием для рутинного применения. В новаторской работе Sai et al. была разработана модель глубокой нейронной сети для автоматического измерения апертуры устьиц по светлопольным микроскопическим изображениям эпидермальных пилингов A. thaliana 6. Тем не менее, это новшество не освобождает исследователей от задачи подготовки эпидермального пилинга для микроскопического наблюдения. Недавно это препятствие было преодолено путем разработки портативного устройства визуализации, которое может наблюдать за устьицами, прищипывая лист A. thaliana, вместе с конвейером анализа изображений на основе глубокого обучения, который автоматически измеряет апертуру устьиц по изображениям листьев, полученным устройством7.
Устьица способствуют формированию у растений врожденного иммунитета против бактериальных патогенов. Ключом к этому иммунному ответу является закрытие устьиц, которое ограничивает проникновение бактерий через микроскопические поры внутрь листа, где бактериальные патогены размножаются и вызывают заболевания8. Смыкание устьиц индуцируется при распознавании микробассоциированных молекулярных паттернов (MAMP), иммуногенных молекул, которые часто являются общими для класса микробов, рецепторами распознавания образов, локализованными на плазматической мембране (PRR)9. 22-аминокислотный эпитоп бактериального флагеллина, известный как flg22, является типичным MAMP, который индуцирует закрытие устьиц путем его распознавания PRR FLS210. В качестве контрмеры бактериальные патогены, такие как Pseudomonas syringae pv. помидор DC3000 (Pto) и Xanthomonas campestris pv. Везикатории развили механизмы вирулентности для повторного открытия устьиц 9,11,12. Эти устьичные реакции на бактериальные патогены были традиционно проанализированы в тестах, в которых либо эпидермальная корка листьев, либо листовые диски, либо отделившиеся листья плавают на бактериальной суспензии, а затем устьица наблюдаются под микроскопом с последующим ручным измерением устьичного отверстия. Однако эти анализы громоздки и могут не отражать устьичные реакции на естественную бактериальную инвазию, которая происходит в листе, прикрепленном к растению.
В данной работе представлен простой метод исследования закрытия и открытия устьиц во время инвазии ВОМ в условиях, максимально приближенных к естественному взаимодействию растений и бактерий. В этом методе используется портативное устройство визуализации для непосредственного наблюдения устьиц A. thaliana на листе, прикрепленном к растению, инокулированному Pto, вместе с конвейером анализа изображений для автоматического измерения апертуры устьиц.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Выращивание растений
- Чтобы выйти из состояния покоя, повторно суспендируйте семена A. thaliana (Col-0) в деионизированной воде и инкубируйте их при 4 °C в течение 4 дней в темноте.
- Посейте семена на почву и выращивайте в камере, оборудованной белым флуоресцентным светом. Поддерживайте следующие условия роста: температура 22 °C, интенсивность света 6 000 люкс (около 100 мкмоль/м2/с) в течение 10 часов и относительная влажность воздуха 60%.
- При необходимости поливайте растения жидким удобрением. Воздержитесь от полива от 1 недели до 2 дней до прививки и хорошо полейте за 1 день до прививки.
2. Подготовка бактериального посевного материала
- Промыть ПОМ из глицеринового запаса на затвердевшей среде King's B (KB) (20 г триптона, 1,5 гК2ХПО4 и 15 г глицерина на 1 л, 1,5% агар) с 50 мкг/мл рифампицина и инкубировать при 28 °C в течение 2 дней.
- Инокулируют одну колонию до 5 мл жидкой среды KB рифампицином в дозе 50 мкг/мл и инкубируют при 28 °C при встряхивании при 200 об/мин до поздней логарифмической фазы роста.
- Центрифужируют культуру при 6 000 x g в течение 2 мин, выбрасывают надосадочную жидкость и повторно суспендируют гранулы в 1 мл стерильной воды. Повторите этот шаг еще раз.
- Удалите надосадочную жидкость, повторно суспендируйте гранулу в 1 мл буфера для открытия устьиц (25 мМ MES-KOH pH 6,15, 10 мМ KCl) и измерьте наружный диаметр600.
- Разбавляют суспензию до OD600 0,2 с буфером вскрытия устьиц, содержащим 0,04% силиконового поверхностно-активного вещества.
3. Аэрозольная инокуляция бактерий
- За 1 день до инокуляции и до конца эксперимента подвергайте растения воздействию света интенсивностью около 10 000 люкс (около 170 мкмоль/м2/с).
- Чтобы большинство устьиц были открыты, перед опрыскиванием подержите растения на подносе, накрытом прозрачной крышкой, под светом не менее 3 ч.
- Снимите крышку и с помощью аэрографа опрыскайте абаксиальную сторону листьев 2,5 мл бактериальной суспензии на три растения в одном горшке.
- Инкубируйте привитые растения на подносе, накрытом прозрачной крышкой, чтобы поддерживать относительную влажность около 85%.
- Получают изображения устьиц через 1 ч и 3 ч после распыления с помощью метода, описанного в разделе 4.
4. Непосредственное наблюдение за устьицами с помощью портативного устройства визуализации
ПРИМЕЧАНИЕ: Портативное устройство визуализации устьиц оснащено светодиодной подсветкой и модулем камеры и может получать 2 592 × 1 944 (высота × ширина; пиксели) изображения с разрешением около 0,5 мкм/пиксель.
- Подключите портативное устройство для визуализации устьиц к персональному компьютеру (ПК), оснащенному программным обеспечением для получения изображений.
- Аккуратно, но полностью удалите капли воды с привитых листьев с помощью листа бумаги.
- Откройте верхнюю крышку устройства, поместите створку на предметный столик и закройте верхнюю крышку (рис. 1).
- Отрегулируйте фокус изображения, манипулируя регуляторным винтом, затем нажмите кнопку «Сохранить изображение » на экране ПК. Изображение будет получено мгновенно. Как правило, сфокусированное изображение содержит около 10 устьиц, поддающихся анализу. Чтобы получить надежные результаты, получите изображения устьиц шести листьев трех разных растений (по два листа на растение).
5. Ручное измерение устьичной апертуры
ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение ImageJ можно загрузить по адресу https://imagej.nih.gov/ij/download.html
- Откройте файл изображения в ImageJ.
- Откройте диспетчер ROI, выбрав Analyze > Tools > ROI Manager.
- С помощью инструмента Straight-Line (Прямолинейная линия ) нарисуйте линию, соответствующую ширине стомы (рис. 2), и зарегистрируйте ROI, нажав кнопку Add в ROI Manager.
- Начертите линию, соответствующую длине той же стомы (рис. 2A), и зарегистрируйте ROI, как описано в шаге 5.3.
- Нажмите кнопку Измерить в диспетчере окупаемости инвестиций, чтобы измерить ширину и длину.
- Разделите ширину на длину, чтобы получить устьичную апертуру (соотношение). Для надежного количественного определения используйте 60 или более устьиц для каждого периода лечения и времени. Не следует выбирать для анализа преждевременные или неясные устьица (рис. 2Б, В).
6. Автоматизированное измерение устьичного отверстия
ПРИМЕЧАНИЕ: Конвейер анализа изображений выполняется в Google Colaboratory, облачной исполняемой среде на языке программирования Python. Пользователи должны иметь действующую учетную запись Google с работающим Google Диском, браузером Google Chrome и стабильным подключением к Интернету в качестве обязательного требования.
- Загрузите блокнот Google Colaboratory с сайта Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.8062528) и откройте записную книжку.
- Создайте локальную копию записной книжки на Google Диске, выбрав Файл > Сохранить копию на Диске. После того, как появится новая вкладка, безопасно закройте вкладку исходной записной книжки.
- Нажмите кнопку «Выполнить » один раз под разделом «Настройка среды » в блокноте, не разворачивая блоки ячеек, чтобы импортировать необходимые библиотеки.
- Выполните раздел Настройки каталога , чтобы создать три папки, используемые для анализа (например, example_result, inference_results и модель) на Google Диске.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом случае папки с именами example_result, inference_results и model используются в качестве родительского каталога, в котором хранятся результаты вывода и обученные модели соответственно. В этой записной книжке показан пример построения каталога в качестве репрезентативной процедуры. Чтобы изменить имя, перепишите путь pardir, infdir или modeldir . - В соответствии с разделом «Подготовка изображений » переместите полученные изображения в example_result, сгруппированные в названиях изображений по обработке или образцу (например, mock_1h_XXXXXX.jpg) для окончательной генерации графика. Примеры изображений доступны на сайте Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.8062528).
- Выполните часть Скачать обученные модели , чтобы скачать файлы ONNX обученных моделей из Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.8062528) и поместить их в каталог моделей .
- Запустите часть Вывод и измерение устьичной апертуры , чтобы количественно оценить устьичную апертуру по отдельным изображениям. Результирующие изображения с наложенным выводом и csv-файл с именем example_result.csv будут экспортированы в каталог inference_results.
- Выполните раздел Создание графика , чтобы создать график о апертуре устьиц, экспортированный в каталог inference_results .
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
После распылительной инокуляции Pto устьица на листьях, прикрепленных к инокулированным растениям, непосредственно наблюдались с помощью портативного устройства визуализации устьиц. Используя ручные и автоматизированные измерения, одни и те же изображения листьев были использованы для расчета апертуры устьиц, взяв отношение ширины к длине примерно 60 устьиц. Ручные и автоматизированные измерения последовательно указывали на уменьшение устьичной апертуры у растений, инокулированных Pto, по сравнению с ра...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В предыдущих исследованиях использовали эпидермальные корки, листовые диски или отделившиеся листья для изучения устьичных реакций на бактериальные инвазии 9,11,12. В отличие от этого, метод, предложенный в этом исследовании, использует портативное устройство визуализации устьиц для непосредственного наблюдения за устьицами на листе, прикрепленном к растению после распыления инокуляции Pto, имитируя естественные условия...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявлять.
Благодарности
Благодарим всех участников исследовательского проекта «Совместное создание адаптивных признаков растений через сборку растительно-микробного голобионта» за плодотворные дискуссии. Эта работа была поддержана Grant-in-Aid for Transformative Research Areas (21H05151 и 21H05149 to A.M. и 21H05152 to Y.T.) и Grant-in-Aid for Challenge Exploratory Research (22K19178 to A.M.).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Agar | Nakarai tesque | 01028-85 | |
| Наборы для аэрографа | ANEST IWATA | MX2900 | Комплекты аксессуаров для SPRINT JET |
| Biotron | Nippon Medical & Химические инструменты | LPH-411S | Камера для выращивания растений с белым флуоресцентным светом |
| Глицерин | Wako | 072-00626 | |
| Полуподдон | Sakata | 72000113 | Комплект подноса и крышки |
| Hyponex | Номер | по каталогу отсутствует | Разведите раствор Hyponex в соотношении 1:2000 в деионизированной воде для полива растений |
| Изображение J | Национальный институт Работоспособность | Скачать в https://imagej.nih.gov/ij/download.html | Используется для ручного измерения устьичной апертуры |
| K2HPO4 | Wako | 164-04295 | |
| KCl | Wako | 163-03545 | |
| KOH | Wako | 168-21815 | Для MES-KOH |
| MES | Wako | 343-01621 | Для MES-KOH |
| Портативное устройство для визуализации устьиц | Phytometrics | Заказать в https://www.phytometrics.jp/ | Takagi et al.(2023) doi: 10.1093/pcp/pcad018. |
| Рифампицин | Wako | 185-01003 | Растворить в ДМСО |
| Silwet-L77 | Bio medical science | BMS-SL7755 | силиконовое поверхностно-активное вещество, используемое в распылении инокуляции |
| SPRINT JET | ANEST IWATA | IS-800 | Аэрограф используется для распыления |
| СуперМикс А | Саката | семенной 72000083 | Смешать с вермикулитом G20 в равных пропорциях для приготовления почвы |
| Триптон | Nakarai tesque | 35640-95 | |
| Vermiculite G20 | Nittai Нет | каталожного номера | Смешайте с Super Mix A в равных пропорциях для приготовления почвы |
| Белый флуоресцентный свет | NEC | FHF32EX-N-HX-S | Используется для Biotron |
Ссылки
- Shimono, M., Higaki, T., Kaku, H., Shibuya, N., Hasezawa, S., Day, B. Quantitative evaluation of stomatal cytoskeletal patterns during the activation of immune signaling in Arabidopsis thaliana. PLoS One. 11, e0159291(2016).
- Bourdais, G., et al. The use of quantitative imaging to investigate regulators of membrane trafficking in Arabidopsis stomatal closure. Traffic. 20 (2), 168-180 (2019).
- Higaki, T., Kutsuna, N., Hasezawa, S. CARTA-based semi-automatic detection of stomatal regions on an Arabidopsis cotyledon surface. Plant Morphology. 26 (1), 9-12 (2014).
- Eisele, J. F., Fäßler, F., Bürgel, F., Chaban, C. A. A rapid and simple method for microscopy-based stomata analyses. PLoS One. 11, e0164576(2016).
- Chitraker, R., Melotto, M. Assessing stomatal response to live bacterial cells using whole leaf imaging. Journal of Visualized Experiments. 44, 2185(2010).
- Sai, N., et al. StomaAI: an efficient and user-friendly tool for measurement of stomatal pores and density using deep computer vision. New Phytologist. 238 (2), 904-915 (2023).
- Takagi, M., et al. Image-based quantification of Arabidopsis thaliana stomatal aperture from leaf images. Plant and Cell Physiology. pcad018, (2023).
- Melotto, M., Zhang, L., Oblessuc, P. R., He, S. Y. Stomatal defense a decade later. Plant Physiology. 174 (2), 561-571 (2017).
- Melotto, M., Underwood, W., Koczan, J., Nomura, K., He, S. Y. Plant stomata function in innate immunity against bacterial invasion. Cell. 126 (5), 969-980 (2006).
- Zeng, W., He, S. A prominent role of the flagellin receptor FLAGELLIN-SENSING2 in mediating stomatal response to Pseudomonas syringae pv tomato DC3000 in Arabidopsis. Plant Physiology. 153 (3), 1188-1198 (2010).
- Zheng, X. Y., et al. Coronatine promotes Pseudomonas syringae virulence in plants by activating a signaling cascade that inhibits salicylic acid accumulation. Cell Host and Microbe. 11 (6), 587-596 (2012).
- Raffeiner, M., et al. The Xanthomonas type-III effector XopS stabilizes CaWRKY40a to regulate defense responses and stomatal immunity in pepper (Capsicum annuum). The Plant Cell. 34 (5), 1684-1708 (2022).
- Munemasa, S., Hauser, F., Park, J., Waadt, R., Brandt, B., Schroeder, J. I. Mechanisms of abscisic acid-mediated control of stomatal aperture. Current Opinion in Plant Biology. 28, 154-162 (2015).
- Förster, S., et al. Wounding-induced stomatal closure requires jasmonate-mediated activation of GORK K+ channels by a Ca2+ sensor-kinase CBL1-CIPK5 complex. Developmental Cell. 48 (1), 87-99 (2018).
- Cheng, Y. T., Zhang, L., He, S. Y. Plant-microbe interactions facing environmental challenge. Cell Host and Microbe. 26 (2), 183-192 (2019).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
