Здесь мы представляем простой метод прямого наблюдения и автоматизированного измерения устьичных реакций на бактериальную инвазию у Arabidopsis thaliana. В этом методе используется портативное устройство визуализации устьиц вместе с конвейером анализа изображений, предназначенным для изображений листьев, полученных устройством.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Прямое наблюдение и автоматизированное измерение ответов устьиц на синегнойную палочку pv. помидор DC3000 в Arabidopsis thaliana
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Устьица – это микроскопические поры, находящиеся в эпидермисе листьев растений. Регуляция устьичной апертуры имеет решающее значение не только для балансировки поглощения углекислого газа для фотосинтеза и транспирационной потери воды, но и для ограничения бактериальной инвазии. В то время как растения закрывают устьица при распознавании микробов, патогенные бактерии, такие как Pseudomonas syringae pv. помидор DC3000 (PTO), снова откройте закрытые устьица, чтобы получить доступ к внутренней части листа. В традиционных анализах для оценки реакции устьиц на бактериальную инвазию эпидермальные оболочки листьев, листовые диски или отделившиеся листья плавают на бактериальной суспензии, а затем устьица наблюдают под микроскопом с последующим ручным измерением устьичного отверстия. Однако эти анализы громоздки и могут не отражать устьичные реакции на естественную бактериальную инвазию в листе, прикрепленном к растению. Недавно было разработано портативное устройство визуализации, которое может наблюдать за устьицами, прищипывая лист, не отрывая его от растения, вместе с конвейером анализа изображений на основе глубокого обучения, предназначенным для автоматического измерения апертуры устьиц по изображениям листьев, полученным устройством. Здесь, основываясь на этих технических достижениях, представлен новый метод оценки устьичных реакций на бактериальную инвазию у Arabidopsis thaliana . Этот метод состоит из трех простых этапов: распылительная инокуляция Pto , имитирующая естественные инфекционные процессы, непосредственное наблюдение устьиц на листе растения, инокулированного Pto, с помощью портативного устройства визуализации и автоматизированное измерение апертуры устьиц с помощью конвейера анализа изображений. Этот метод был успешно использован для демонстрации закрытия и повторного открытия устьиц во время инвазии Pto в условиях, которые близко имитируют естественное взаимодействие растений и бактерий.
Введение
Устьица представляют собой микроскопические поры, окруженные парой защитных клеток на поверхности листьев и других надземных частей растений. В постоянно меняющихся условиях регулирование устьичного отверстия является центральным для растений, чтобы контролировать поглощение углекислого газа, необходимого для фотосинтеза, за счет потери воды через транспирацию. Таким образом, количественная оценка устьичного отверстия сыграла важную роль в понимании адаптации растений к окружающей среде. Тем не менее, количественная оценка устьичной апертуры по своей сути является трудоемкой и громоздкой, поскольку требует человеческого труда, чтобы обнаружить и измерить устьичные пор....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Выращивание растений
- Чтобы выйти из состояния покоя, повторно суспендируйте семена A. thaliana (Col-0) в деионизированной воде и инкубируйте их при 4 °C в течение 4 дней в темноте.
- Посейте семена на почву и выращивайте в камере, оборудованной белым флуоресцентным светом. Поддерживайте следующие условия роста: температура 22 °C, интенсивность света 6 000 люкс (около 100 мкмоль/м2/с) в течение 10 часов и относительная влажность воздуха 60%.
- При необходимости поливайте растения жидким удобрением. Воздержитесь от полива от 1 недели до 2 дней до прививки и хорошо полейте за 1 день до прививки.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
После распылительной инокуляции Pto устьица на листьях, прикрепленных к инокулированным растениям, непосредственно наблюдались с помощью портативного устройства визуализации устьиц. Используя ручные и автоматизированные измерения, одни и те же изображения листьев были использованы для расчета апертуры устьиц, взяв отношение ширины к длине примерно 60 устьиц. Ручные и автоматизированные измерения последовательно указывали на уменьшение устьичной апертуры у растений, инокулированных Pto, по сравнению с ра.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В предыдущих исследованиях использовали эпидермальные корки, листовые диски или отделившиеся листья для изучения устьичных реакций на бактериальные инвазии 9,11,12. В отличие от этого, метод, предложенный в этом исследовании, использует портативное устройство визуализации устьиц для непосредственного наблюдения за устьицами на листе, прикрепленном к растению после распыления инокуляции Pto, имитируя естественные условия.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявлять.
Благодарности
Благодарим всех участников исследовательского проекта «Совместное создание адаптивных признаков растений через сборку растительно-микробного голобионта» за плодотворные дискуссии. Эта работа была поддержана Grant-in-Aid for Transformative Research Areas (21H05151 и 21H05149 to A.M. и 21H05152 to Y.T.) и Grant-in-Aid for Challenge Exploratory Research (22K19178 to A.M.).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Agar | Nakarai tesque | 01028-85 | |
| Наборы для аэрографа | ANEST IWATA | MX2900 | Комплекты аксессуаров для SPRINT JET |
| Biotron | Nippon Medical & Химические инструменты | LPH-411S | Камера для выращивания растений с белым флуоресцентным светом |
| Глицерин | Wako | 072-00626 | |
| Полуподдон | Sakata | 72000113 | Комплект подноса и крышки |
| Hyponex | Номер | по каталогу отсутствует | Разведите раствор Hyponex в соотношении 1:2000 в деионизированной воде для полива растений |
| Изображение J | Национальный институт Работоспособность | Скачать в https://imagej.nih.gov/ij/download.html | Используется для ручного измерения устьичной апертуры |
| K2HPO4 | Wako | 164-04295 | |
| KCl | Wako | 163-03545 | |
| KOH | Wako | 168-21815 | Для MES-KOH |
| MES | Wako | 343-01621 | Для MES-KOH |
| Портативное устройство для визуализации устьиц | Phytometrics | Заказать в https://www.phytometrics.jp/ | Takagi et al.(2023) doi: 10.1093/pcp/pcad018. |
| Рифампицин | Wako | 185-01003 | Растворить в ДМСО |
| Silwet-L77 | Bio medical science | BMS-SL7755 | силиконовое поверхностно-активное вещество, используемое в распылении инокуляции |
| SPRINT JET | ANEST IWATA | IS-800 | Аэрограф используется для распыления |
| СуперМикс А | Саката | семенной 72000083 | Смешать с вермикулитом G20 в равных пропорциях для приготовления почвы |
| Триптон | Nakarai tesque | 35640-95 | |
| Vermiculite G20 | Nittai Нет | каталожного номера | Смешайте с Super Mix A в равных пропорциях для приготовления почвы |
| Белый флуоресцентный свет | NEC | FHF32EX-N-HX-S | Используется для Biotron |
Ссылки
- Shimono, M., Higaki, T., Kaku, H., Shibuya, N., Hasezawa, S., Day, B. Quantitative evaluation of stomatal cytoskeletal patterns during the activation of immune signaling in Arabidopsis thaliana. PLoS One. 11, e0159291(2016).
- Bourdais, G., et al.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
