Прямое наблюдение и автоматизированное измерение ответов устьиц на синегнойную палочку pv. помидор DC3000 в Arabidopsis thaliana

Устьица представляют собой микроскопические поры, окруженные парой защитных клеток на поверхности листьев и других надземных частей растений. В постоянно меняющихся условиях регулирование устьичного отверстия является центральным для растений, чтобы контролировать поглощение углекислого газа, необходимого для фотосинтеза, за счет потери воды через транспирацию. Таким образом, количественная оценка устьичного отверстия сыграла важную роль в понимании адаптации растений к окружающей среде. Тем не менее, количественная оценка устьичной апертуры по своей сути является трудоемкой и громоздкой, поскольку требует человеческого труда, чтобы обнаружить и измерить устьичные поры на изображении листа, полученном микроскопом. Чтобы обойти эти ограничения, были разработаны различные методы, облегчающие количественную оценку устьичных апертур у Arabidopsis thaliana, модельного растения, широко используемого для изучения биологии устьиц 1,2,3,4,5,6. Например, порометр может быть использован для измерения скорости транспирации в качестве показателя устьичной проводимости. Однако этот метод не дает прямой информации о устьичном числе и апертуре, определяющих устьичную проводимость. В некоторых исследованиях использовались методы конфокальной микроскопии, выделяющие устьичные поры с использованием флуоресцентного актинового маркера, флуоресцентного красителя или автофлуоресценции клеточной стенки 1,2,3,4,5. Несмотря на то, что эти подходы облегчают обнаружение устьиц, затраты как на эксплуатацию установки конфокальной микроскопии, так и на подготовку образцов для микроскопии могут стать препятствием для рутинного применения. В новаторской работе Sai et al. была разработана модель глубокой нейронной сети для автоматического измерения апертуры устьиц по светлопольным микроскопическим изображениям эпидермальных пилингов A. thaliana ⁶. Тем не менее, это новшество не освобождает исследователей от задачи подготовки эпидермального пилинга для микроскопического наблюдения. Недавно это препятствие было преодолено путем разработки портативного устройства визуализации, которое может наблюдать за устьицами, прищипывая лист A. thaliana, вместе с конвейером анализа изображений на основе глубокого обучения, который автоматически измеряет апертуру устьиц по изображениям листьев, полученным устройством⁷.

Устьица способствуют формированию у растений врожденного иммунитета против бактериальных патогенов. Ключом к этому иммунному ответу является закрытие устьиц, которое ограничивает проникновение бактерий через микроскопические поры внутрь листа, где бактериальные патогены размножаются и вызывают заболевания⁸. Смыкание устьиц индуцируется при распознавании микробассоциированных молекулярных паттернов (MAMP), иммуногенных молекул, которые часто являются общими для класса микробов, рецепторами распознавания образов, локализованными на плазматической мембране (PRR)⁹. 22-аминокислотный эпитоп бактериального флагеллина, известный как flg22, является типичным MAMP, который индуцирует закрытие устьиц путем его распознавания PRR FLS2¹⁰. В качестве контрмеры бактериальные патогены, такие как Pseudomonas syringae pv. помидор DC3000 (Pto) и Xanthomonas campestris pv. Везикатории развили механизмы вирулентности для повторного открытия устьиц ^9,11,12. Эти устьичные реакции на бактериальные патогены были традиционно проанализированы в тестах, в которых либо эпидермальная корка листьев, либо листовые диски, либо отделившиеся листья плавают на бактериальной суспензии, а затем устьица наблюдаются под микроскопом с последующим ручным измерением устьичного отверстия. Однако эти анализы громоздки и могут не отражать устьичные реакции на естественную бактериальную инвазию, которая происходит в листе, прикрепленном к растению.

В данной работе представлен простой метод исследования закрытия и открытия устьиц во время инвазии ВОМ в условиях, максимально приближенных к естественному взаимодействию растений и бактерий. В этом методе используется портативное устройство визуализации для непосредственного наблюдения устьиц A. thaliana на листе, прикрепленном к растению, инокулированному Pto, вместе с конвейером анализа изображений для автоматического измерения апертуры устьиц.

1. Выращивание растений

1. Чтобы выйти из состояния покоя, повторно суспендируйте семена A. thaliana (Col-0) в деионизированной воде и инкубируйте их при 4 °C в течение 4 дней в темноте.
2. Посейте семена на почву и выращивайте в камере, оборудованной белым флуоресцентным светом. Поддерживайте следующие условия роста: температура 22 °C, интенсивность света 6 000 люкс (около 100 мкмоль/^м2/с) в течение 10 часов и относительная влажность воздуха 60%.
3. При необходимости поливайте растения жидким удобрением. Воздержитесь от полива от 1 недели до 2 дней до прививки и хорошо полейте за 1 день до прививки.

2. Подготовка бактериального посевного материала

1. Промыть ПОМ из глицеринового запаса на затвердевшей среде King's B (KB) (20 г триптона, 1,5 г_К2ХПО4 и 15 г глицерина на 1 л, 1,5% агар) с 50 мкг/мл рифампицина и инкубировать при 28 °C в течение 2 дней.
2. Инокулируют одну колонию до 5 мл жидкой среды KB рифампицином в дозе 50 мкг/мл и инкубируют при 28 °C при встряхивании при 200 об/мин до поздней логарифмической фазы роста.
3. Центрифужируют культуру при 6 000 x g в течение 2 мин, выбрасывают надосадочную жидкость и повторно суспендируют гранулы в 1 мл стерильной воды. Повторите этот шаг еще раз.
4. Удалите надосадочную жидкость, повторно суспендируйте гранулу в 1 мл буфера для открытия устьиц (25 мМ MES-KOH pH 6,15, 10 мМ KCl) и измерьте наружный диаметр₆₀₀.
5. Разбавляют суспензию до OD₆₀₀ 0,2 с буфером вскрытия устьиц, содержащим 0,04% силиконового поверхностно-активного вещества.

3. Аэрозольная инокуляция бактерий

1. За 1 день до инокуляции и до конца эксперимента подвергайте растения воздействию света интенсивностью около 10 000 люкс (около 170 мкмоль/^м2/с).
2. Чтобы большинство устьиц были открыты, перед опрыскиванием подержите растения на подносе, накрытом прозрачной крышкой, под светом не менее 3 ч.
3. Снимите крышку и с помощью аэрографа опрыскайте абаксиальную сторону листьев 2,5 мл бактериальной суспензии на три растения в одном горшке.
4. Инкубируйте привитые растения на подносе, накрытом прозрачной крышкой, чтобы поддерживать относительную влажность около 85%.
5. Получают изображения устьиц через 1 ч и 3 ч после распыления с помощью метода, описанного в разделе 4.

4. Непосредственное наблюдение за устьицами с помощью портативного устройства визуализации

ПРИМЕЧАНИЕ: Портативное устройство визуализации устьиц оснащено светодиодной подсветкой и модулем камеры и может получать 2 592 × 1 944 (высота × ширина; пиксели) изображения с разрешением около 0,5 мкм/пиксель.

1. Подключите портативное устройство для визуализации устьиц к персональному компьютеру (ПК), оснащенному программным обеспечением для получения изображений.
2. Аккуратно, но полностью удалите капли воды с привитых листьев с помощью листа бумаги.
3. Откройте верхнюю крышку устройства, поместите створку на предметный столик и закройте верхнюю крышку (рис. 1).
4. Отрегулируйте фокус изображения, манипулируя регуляторным винтом, затем нажмите кнопку «Сохранить изображение » на экране ПК. Изображение будет получено мгновенно. Как правило, сфокусированное изображение содержит около 10 устьиц, поддающихся анализу. Чтобы получить надежные результаты, получите изображения устьиц шести листьев трех разных растений (по два листа на растение).

5. Ручное измерение устьичной апертуры

ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение ImageJ можно загрузить по адресу https://imagej.nih.gov/ij/download.html

1. Откройте файл изображения в ImageJ.
2. Откройте диспетчер ROI, выбрав Analyze > Tools > ROI Manager.
3. С помощью инструмента Straight-Line (Прямолинейная линия ) нарисуйте линию, соответствующую ширине стомы (рис. 2), и зарегистрируйте ROI, нажав кнопку Add в ROI Manager.
4. Начертите линию, соответствующую длине той же стомы (рис. 2A), и зарегистрируйте ROI, как описано в шаге 5.3.
5. Нажмите кнопку Измерить в диспетчере окупаемости инвестиций, чтобы измерить ширину и длину.
6. Разделите ширину на длину, чтобы получить устьичную апертуру (соотношение). Для надежного количественного определения используйте 60 или более устьиц для каждого периода лечения и времени. Не следует выбирать для анализа преждевременные или неясные устьица (рис. 2Б, В).

6. Автоматизированное измерение устьичного отверстия

ПРИМЕЧАНИЕ: Конвейер анализа изображений выполняется в Google Colaboratory, облачной исполняемой среде на языке программирования Python. Пользователи должны иметь действующую учетную запись Google с работающим Google Диском, браузером Google Chrome и стабильным подключением к Интернету в качестве обязательного требования.

1. Загрузите блокнот Google Colaboratory с сайта Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.8062528) и откройте записную книжку.
2. Создайте локальную копию записной книжки на Google Диске, выбрав Файл > Сохранить копию на Диске. После того, как появится новая вкладка, безопасно закройте вкладку исходной записной книжки.
3. Нажмите кнопку «Выполнить » один раз под разделом «Настройка среды » в блокноте, не разворачивая блоки ячеек, чтобы импортировать необходимые библиотеки.
4. Выполните раздел Настройки каталога , чтобы создать три папки, используемые для анализа (например, example_result, inference_results и модель) на Google Диске.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом случае папки с именами example_result, inference_results и model используются в качестве родительского каталога, в котором хранятся результаты вывода и обученные модели соответственно. В этой записной книжке показан пример построения каталога в качестве репрезентативной процедуры. Чтобы изменить имя, перепишите путь pardir, infdir или modeldir .
5. В соответствии с разделом «Подготовка изображений » переместите полученные изображения в example_result, сгруппированные в названиях изображений по обработке или образцу (например, mock_1h_XXXXXX.jpg) для окончательной генерации графика. Примеры изображений доступны на сайте Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.8062528).
6. Выполните часть Скачать обученные модели , чтобы скачать файлы ONNX обученных моделей из Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.8062528) и поместить их в каталог моделей .
7. Запустите часть Вывод и измерение устьичной апертуры , чтобы количественно оценить устьичную апертуру по отдельным изображениям. Результирующие изображения с наложенным выводом и csv-файл с именем example_result.csv будут экспортированы в каталог inference_results.
8. Выполните раздел Создание графика , чтобы создать график о апертуре устьиц, экспортированный в каталог inference_results .

После распылительной инокуляции Pto устьица на листьях, прикрепленных к инокулированным растениям, непосредственно наблюдались с помощью портативного устройства визуализации устьиц. Используя ручные и автоматизированные измерения, одни и те же изображения листьев были использованы для расчета апертуры устьиц, взяв отношение ширины к длине примерно 60 устьиц. Ручные и автоматизированные измерения последовательно указывали на уменьшение устьичной апертуры у растений, инокулированных Pto, по сравнению с растениями, получившими фиктивную инокуляцию через 1 час после инокуляции (hpi) (рис. 3A, B), что указывает на то, что растения A thaliana закрывают устьица в ответ на инвазию Pto . При 3 hpi устьичное отверстие у растений, инокулированных Pto, и растений, получивших фиктивную инокуляцию, было практически одинаковым (рис. 3C, D), что напоминало повторное открытие устьиц Pto. Примечательно, что автоматическое измерение апертуры устьиц занимало всего около 5 с для обработки одного изображения (табл. 1), что сокращало время измерения более чем на 95% по сравнению с ручным измерением. Таким образом, этот протокол предлагает простой в операционном отношении и трудозатратный способ отслеживания динамических устьичных реакций A. thaliana на бактериальный патоген.

Рисунок 1: Портативное устройство визуализации. Фотографии, на которых изображено портативное устройство визуализации с листом, установленным на сцене (слева) и с закрытой верхней крышкой (справа). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Принципиальная схема измерения устьичной апертуры. (А) Апертура устьица определяется путем вычисления отношения ширины к длине стомы, как показано белыми стрелками. (Б) Преждевременные и (В) неясные устьица должны быть исключены из измерения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Реакция устьиц на Pto у интактного целого растения. Растения A. thaliana инокулировали методом распыления фиктивной или Pto, а устьица на листьях, прикрепленных к инокулированным растениям, непосредственно наблюдали при (A,B) 1 hpi и (C,D) 3 hpi с помощью портативного устройства визуализации устьиц. Апертуру (ratio) устьиц рассчитывали с помощью (A,C) ручных и (B,D) автоматизированных измерений. P-значения рассчитывались с помощью двустороннего t-критерия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1: Время обработки ручных и автоматизированных измерений устьичной апертуры на изображение. Средние значения и стандартные отклонения (SD) времени обработки были рассчитаны на основе измерений девяти репрезентативных изображений.

У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявлять.