Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Мышиная модель коронарного коллатерального роста посредством повторяющейся ишемии

509 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/66127

⸱

9 мая 2025 г.

 ,  ,  , 
1Department of Integrative Medical Sciences, Northeast Ohio Medical University, 2Department of Biological Sciences, Kent State University, 3College of Medicine, University of Arizona, Phoenix

В этой статье

Краткое содержание

В данной работе представлен метод изучения постнатального коронарного коллатерального роста, индуцированного повторяющейся ишемией у мышей, включая хирургическую имплантацию пневматического окклюдера на левую переднюю нисходящую артерию, автоматизированную систему надувания для протокола повторяющейся ишемии и потенциальные методы оценки коллатерального роста.

Аннотация

Коронарные коллатерали являются естественным обходным путем при ишемической болезни сердца (ИБС), и поэтому в течение многих лет коронарный коллатеральный рост (ККГ) был многообещающей терапевтической мишенью для лечения ИБС, особенно у пациентов с сахарным диабетом 2 типа или метаболическим синдромом, при котором КБГ нарушена. Тем не менее, этот процесс недостаточно изучен, отчасти из-за отсутствия мышиных моделей ККИ, хотя были созданы и другие животные модели, такие как свиньи, собаки и крысы. Мышиная модель может использовать многие генетические модификации, доступные для данного вида, включая отслеживание родословной и регуляцию генов (сверхэкспрессия или нокаут), чтобы пролить свет на процесс и механизм ККИ, включая участвующие в ней пути и типы клеток. Поэтому мы решили разработать мышиную модель ККИ, индуцированной повторяющейся ишемией (RI) через транзиторную ишемию, повторная окклюзия левой передней нисходящей артерии (ПМЖ). В данной рукописи подробно описывается модель ККИ мыши, в том числе операция по имплантации пневматического окклюдера на ПМЖ, автоматизированная система надувания на основе давления, используемая для контроля давления и времени надувания, а также последовательность протокола RI. Этот метод уже породил одну публикацию для разъяснения процесса ККГ, индуцированного RI, показывающей, что прорастающий ангиогенез приводит к образованию зрелых коронарных артерий в ККГ в сердцах взрослых мышей.

Введение

Ишемическая болезнь сердца (ИБС) является основной причиной смертности в Соединенных Штатах, и ежегодно проводится более 200 000 операций по шунтированию коронарных артерий с цельюлечения этого заболевания. Коронарные коллатерали, анастомозы между ветвями коронарного артериального дерева, являются естественным обходным средством, которое может снабжать кровью ишемизированную ткань ниже по течению от закупорки2; Тем не менее, люди демонстрируют широкий разброс в протяженности своих родных коллатеральных сетей 3,4. Пациенты с ИБС с более обширной коронарной коллатерацией имеют лучшие исходы во время сердечных событий, включая уменьшение размера инфаркта и смертность. Следовательно, коронарный коллатеральный рост (ККГ) является терапевтической целью на протяжении более десяти лет 5,6,7. Это представляет особый интерес в связи с растущим числом пациентов с метаболическим синдромом8, у которых наблюдается более слабая коллатерация коронарных артерий9. Тем не менее, до тех пор, пока процесс и механизм ХКГ не будут лучше изучены, попытки индуцировать ККГ для лечения ИБС вряд ли будут плодотворными.

Коронарные коллатерали были изучены на крупных животных моделях, а краткие, повторяющиеся окклюзии основных коронарных артерий были использованы для индуцирования ККГ у свиней10, собак11 и крыс12. Мышиная модель ККИ, однако, будет иметь больше преимуществ при изучении молекулярных и клеточных механизмов ККИ из-за множества генетически модифицированных мышиных линий, включая отслеживание линии, ген-специфические или клеточно-специфические трансгенные и нокаутные линии. Интересно, что в отличие от людей, у мышей, как сообщается, нет нативных коронарных коллатералей13,14, что делает их привлекательной моделью для изучения формирования коронарных коллатералей. Действительно, недавнее исследование показало, что у пациентов с обструктивной болезнью артерий почти половина (47%) не имели коллатерации (степень Рентропа 0)3; таким образом, мышиная модель ККГ может быть клинически значимой для пациентов с минимальной нативной коллатерацией.

Поэтому мы разработали мышиную модель ККГ, индуцированной повторяющейся ишемией, с надувным баллонным окклюдером над левой передней нисходящей артерией (ПМЖ), которая использует систему надувания на основе давления, автоматизированную с таймером. Протокол повторяющейся ишемии способен стимулировать коллатеральный рост, как показано в недавней публикации14. Эта мышиная модель ККИ обеспечит новое понимание процесса ККИ на клеточном и молекулярном уровнях и может быть использована для проверки потенциальных мишеней для продвижения ККИ.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Описанные эксперименты на животных проводились в соответствии с Руководством по уходу за лабораторными животными и их использованию и были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию Медицинского университета Северо-Восточного Огайо.

1. Хирургическая подготовка

ПРИМЕЧАНИЕ: Для протокола RI используйте мышей C57BL/6 любого пола весом не менее 25 г. Используйте асептическую технику на протяжении всей операции.

  1. Настройка
    1. Стерилизуйте все инструменты в автоклаве или стерилизаторе для шариков. Стерилизуйте деликатные материалы и имплантаты, такие как окклюдер, страховочный трос и полиэтиленовые трубки, с помощью этиленоксида (EtO).
    2. Очистите операционную область, протерев все участки 70% этанолом. Подготовьте помещение, разложив все инструменты и принадлежности на стерильных шторах. Полный список расходных материалов см. в Таблице материалов .
  2. Интубация мышей
    1. Кратковременно обезболите мышь 3% изофлураном с кислородом (скорость потока 1 л/мин) до тех пор, пока не будет утрачен рефлекс коррекции. Побрейте область груди, центр спины и за правым ухом; Полностью удалите выпавшие волосы. Внутримышечно вводят гликопирролат в дозе 0,01-0,02 мг/кг.
    2. Снова обезболить 3%-4% изофлураном в течение 5 мин. Положите мышь лежа на спину под наклоном, ограниченным от ее верхних резцов, и с помощью тупых щипцов отодвиньте язык в сторону. Быстро интубируйте мышь с помощью ангиокаты 20G с помощью оптоволоконного фонаря и увеличительного ларингоскопа.
    3. Положите мышь лежа на согревающую хирургическую прокладку и подключите интубационную трубку к аппарату искусственной вентиляции легких для мелких животных с 3% изофлураном. Подтвердите интубацию, проверив ритмичный двусторонний подъем грудной клетки. Подтвердите достаточную глубину анестезии отсутствием реакции на защемление пальца ноги.
  3. Подготовка операционного поля
    1. Нанесите офтальмологическую мазь на глаза, чтобы предотвратить высыхание.
    2. Очистите выбритые участки бетадином, а затем 70% этанолом, протирая один раз в одном направлении.
    3. Нанесите электродный крем на контакты электрокардиограммы (ЭКГ) на операционной подушечке и прикрепите к ним конечности мыши. Накиньте стерильную марлю на нижнюю половину мыши.
    4. Контролируйте частоту дыхания, температуру и глубину анестезии в течение операции с помощью программного интерфейса хирургической прокладки.
  4. Левая торакотомия и имплантация окклюдера
    1. Уменьшите изофлуран до 2%. Сделайте разрез по средней линии в 2-3 см на коже на груди с помощью ножниц, затем с помощью изогнутых щипцов аккуратно отделите кожу и мышечные слои на левой стороне груди (рисунок 1А).
    2. Используя тупые щипцы, аккуратно сделайте отверстие через грудную стенку, чтобы обнажить сердце, обычно между3-м и5-м межреберьями.
    3. Используйте ретрактор, чтобы аккуратно раздвинуть ребра и визуализировать сердце. С помощью тупых щипцов разорвите перикард, чтобы обнажить сердце. Найдите левое ушное предсердие (рисунок 1B) и визуализируйте базальную часть левой передней нисходящей артерии (ПМЖ), если это возможно.
    4. Пас 8-0 полипропиленовый шов через миокард под ПМЖ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Расстояние между входом и выходом должно быть примерно равно ширине окклюдера и перпендикулярно LAD.
    5. Удалите втягивающие устройства. С помощью заостренных щипцов выведите наружу конец окклюдерной трубки через грудную стенку во втором нижнем межреберье и вытяните окклюдерную трубку через грудную стенку до тех пор, пока окклюдер не будет расположен над сердцем в грудной полости.
    6. Надежно завяжите окклюдер к сердцу с помощью хирургического узла (рисунок 1C) так, чтобы окклюдер лежал на сердце, но не вдавливался в него.
    7. Кратковременно надуйте окклюдер (~10 с) при давлении 10 фунтов на квадратный дюйм с помощью кнопочного устройства для надувания (Рисунок 2). Проверьте ЭКГ, чтобы подтвердить повышение сегмента ST во время раздувания и, по возможности, визуально подтвердить побледнение верхушки сердца. При необходимости отрегулируйте положение или натяжение шва для подтверждения ишемии.
  5. Закрытие
    1. Закройте боковые ребра полипропиленовым швом 6-0, вставив плевральную дренажную трубку. Удалите воздух и кровь из грудной клетки, затем извлеките плевральную дренажную трубку. Нанесите 2% лидокаин на закрытый разрез в области грудной стенки.
    2. С помощью заостренных щипцов проведите окклюдерную трубку под кожей правого плеча, чтобы вывести трубку наружу через кожу за правым ухом. Замените мышцы груди и закройте кожу полиглактиновым швом 6-0 (Рисунок 1D).
    3. Переверните мышь в положение лежа. Вводите кетопрофен подкожно в дозировке 3 мг/кг (с использованием разведения 1 мг/мл в 0,9% стерильном физрастворе) не менее чем за 30 минут до окончания операции.
  6. Имплантация Tether
    1. С помощью маленьких ножниц сделайте небольшой (1 см) разрез на коже в центре спины и аккуратно отделите кожу от подкожного жира и мышечной ткани.
    2. Проложите трубку окклюдера к разрезу в центре спины, выведите его наружу и проденьте через страховочный трос. С помощью шва 6-0 закройте небольшое отверстие возле уха.
    3. Используйте полипропиленовые швы 6-0 для фиксации привязи к мышцам спины (рисунок 1E). Закройте кожу над кнопкой привязи швами 6-0.
  7. Выздоровление
    1. Снимите интубационную трубку, как только мышь сможет дышать самостоятельно; поместить мышь в послеоперационную клетку для RI (для одного животного; Рисунок 3) как только реакция на щипывание ноги вернется. Непрерывно следите за мышью, пока она не придет в сознание, достаточное для поддержания лежачего положения за грудиной. Поместите клетку на грелку до тех пор, пока мышь не восстановит полную подвижность.
    2. На следующий день введите вторую дозу кетопрофена подкожно в дозе 3 мг/кг.
    3. Дайте мыши отдохнуть в течение 5-7 дней перед началом протокола RI. Ежедневно контролируйте мышей на предмет целостности приборов и при необходимости меняйте клетки. При необходимости обеспечьте соответствующее обогащение, так как мыши содержатся в одиночном помещении в течение всего срока действия протокола RI.

2. Повторяющаяся ишемия

  1. Проверьте расположение окклюдера с помощью эхокардиографии в 0-й день протокола RI, как описано ранее15. Наблюдайте снижение сердечной функции во время надувания окклюдера.
  2. Подсоедините окклюдерную трубку мыши к системе надувания RI (рис. 4). Система будет надувать окклюдер до 10 фунтов на квадратный дюйм в течение 6 минут, 4 раза в день, с 3-часовым перерывом между каждым надуванием (Рисунок 5).
  3. После 17 дней RI повторно проверьте сердечную функцию, как описано в шаге 2.1.

3. Полимерная перфузия и забор тканей

  1. Во время жертвоприношения обезболите мышь 3%-4% изофлураном и введите гепарин (500 ЕД/кг) внутрибрюшинно. Используйте носовой конус для продолжения введения изофлурана в концентрации 2% в течение не менее 5 минут, затем подтвердите достаточную глубину анестезии отсутствием реакции на защемление пальца ноги.
  2. Откройте грудную полость, чтобы обнажить сердце и грудную аорту. Канюлезируйте нисходящую грудную аорту с помощью трубки PE20 и рассеките нижнюю полую вену (IVC) для обеспечения оттока; перфузируйте сердце ретроградно с помощью 1x PBS до тех пор, пока жидкость, выходящая из IVC, не станет прозрачной, затем 3 мл 1% лидокаина, затем 3 мл 4% параформальдегида (PFA) в PBS. Сделайте постоянное лигирование ПМЖ в точном положении окклюдера.
  3. Ретроградно перфузируйте сердце рентгеноконтрастным реагентом до тех пор, пока артериальный контур не будет заполнен. Зажмите трубку PE20 гемостатиком и дайте полимеру застыть в течение 90 минут. Представьте себе сердце под эндоскопом для вскрытия.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Из 136 мышей C57BL/6, включая самцов и самок, выживаемость после операции RI составила 93,4%, при этом 80,9% мышей выжили в течение всего 17-дневного протокола RI.

Протокол RI у мышей был оптимизирован на основе предыдущих моделей RI на животных 12,16, которые имеют короткие эпизоды ишемии без постоянного повреждения миокарда. Во время операции можно провести функциональную оценку окклюдера путем наблюдения за видимым побледнением верх...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Коронарные коллатерали являются естественным шунтированием для пациентов с ИБС. После неудачных клинических испытаний, нацеленных на ангиогенез17, стимулирование развития коронарных коллатералей может быть лучшим терапевтическим подходом для этих пациентов. В отличие от капилляров, полученных в результате ангиогенеза, которые имеют только один слой эндотелиальных клеток, коллатерали представляют собой зрелые артерии с покрытием гладкомышечных клеток. Коллатерали п...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Авторы благодарят Вэйго Вана, Коди Джугилона, Иянуолуву Огунмилуйи и Девана Ричардсона за их вклад в обсуждаемые здесь методы. Эта работа была поддержана 1R15HL115540-01 и 1 R01 HL137008-01A1.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
# 5/45 градус щипцыFine Science Tools11251-35
1/4 " Закрытый латунный электрический электромагнитный клапанU.S. SolidUSS2-00054система накачивания
1/4 " Открытый латунный электрический электромагнитный клапанAceCrewсистема накачивания
1/4 " пневматическая трубка‎ Китай SNS Pneumatic Co., Ltd‎ APU1/4-32,8ftкнопочное устройство
1/4" push-in разъемыRuoFeng543Yкнопочное устройство
1/8" латунные фитингиEdge Промышленнаясистема накачивания
2-позиционный пневматический электрический электромагнитный клапанU.S. ТвердыйUSS-PSV00033кнопочное устройство
20G ангиокатBD381703
45 градусов Иглодержатели CastroviejoRobozRS-6421
6-0 полиглактиновые шовные материалыDemeTECHG176011B13M
6-0 полипропиленовые шовные материалыAD SugicalXS-P618R11
70% этанол
8-0 полипропиленовые шовные материалыDemeTECHPM19800, 65G0P
BetadinePurdue Products367618150085
Ножницы с тупым носомWorld Precision Intruments500366
Карбоновый стреловидный стерженьпослеоперационная клетка; обрезано до 12,5 см
Ватные палочки (3")Puritan872-PC DBL
Марлевые губки Curity (2x2)Cardinal Health2146
Вертлюжные грузила DipseyWater Gremlinпослеоперационная клетка
Электрод кремSignacreme17-05
ГликопирролатВествард0143-9679-01
Гемостаты ХартманаFine Science Tools13003-10
ИзофлуранCovetrus29404
Кетофен (кетопрофен)zoetis10004031
Лидокаин (2%)Covetrus14583
MICROFIL (желтый)Flow TekMV-122
Мини кнопкаInteractiviaE-SWC-PBM-PBS-105кнопочное устройство
Миниатюрный регулятор давления воздухаPneumaticPlusPPR2-N02BG-4кнопочное устройство
Пружинное втягивающее устройство Mini-ColibriИнструменты для тонкой науки17000-01
Вентилятор MiniVentГарвардский аппарат73-0044
ОкклюдерИзготовленный на заказ
Восьмиугольные щипцы с ручкойFine Science Tools11041-08
Ohan Система интубации грызуновBMR SupplyOhan-201
Раствор параформальдегида 4% в PBSSanta Cruzsc-281692
PE20 трубка
PE50
Пластиковый вертлюг (1 канал)Instech375/25PSпослеоперационная клетка
Предварительно смешанный PBS буфер, 10xRoche11666789001Разбавленный до 1x
МанометрPIC102D-158D-10/32кнопочное устройство
Программируемый цифровой выходной таймерBN-LINK‎ BND-60/SU105система накачивания
Puralube Vet Офтальмологическая мазьDechra17033-211-38
Ретракторы с 18200-07 эластомеромFine Science Tools18200-10 и 18200-11
Хирургический монитор для грызунов +Scintica900-0053-01
Щипцы для завязывания швов с круглой ручкойFine Science Tools18026-10
Snap-lock вертлюг для ствола (размер 5)Eagle Claw‎ 01032-005Держатели игл для послеоперационного периода
FineScience Tools12060-01
TetherInstechPS62
Трубка

Ссылки

  1. Tsao, C. W., et al. Heart disease and stroke statistics-2023 update: A report from the American heart association. Circulation. 147 (8), e93-e621 (2023).
  2. Chilian, W. M., et al. Coronary collateral growth--back to the future. J Mol Cell Cardiol. 52 (4), 905-911 (2012).
  3. Liu, Z., et al. Coronary collateralization shows sex and racial-ethnic differences in obstructive artery disease patients. PLoS One. 12 (10), e0183836(2017).
  4. Kinnaird, T., Stabile, E., Zbinden, S., Burnett, M. S., Epstein, S. E. Cardiovascular risk factors impair native collateral development and may impair efficacy of therapeutic interventions. Cardiovasc Res. 78 (2), 257-264 (2008).
  5. Traupe, T., Gloekler, S., de Marchi, S. F., Werner, G. S., Seiler, C. Assessment of the human coronary collateral circulation. Circulation. 122 (12), 1210-1220 (2010).
  6. Schaper, W. Collateral vessels reduce mortality. Eur Heart J. 33 (5), 564-566 (2012).
  7. Meier, P., et al. The impact of the coronary collateral circulation on mortality: a meta-analysis. Eur Heart J. 33 (5), 614-621 (2012).
  8. Hirode, G., Wong, R. J. Trends in the prevalence of metabolic syndrome in the United States, 2011-2016. JAMA. 323 (24), 2526-2528 (2020).
  9. Turhan, H., et al. Impaired coronary collateral vessel development in patients with metabolic syndrome. Coron Artery Dis. 16 (5), 281-285 (2005).
  10. Ishikawa, K., et al. Development of a preclinical model of ischemic cardiomyopathy in swine. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 301 (2), H530-H537 (2011).
  11. Rys, R., et al. An automated coronary artery occlusion device for stimulating collateral development in vivo. J Pharmacol Toxicol Methods. 48 (2), 111-118 (2002).
  12. Toyota, E., et al. Vascular endothelial growth factor is required for coronary collateral growth in the rat. Circulation. 112 (14), 2108-2113 (2005).
  13. Zhang, H., Faber, J. E. De novo collateral formation following acute myocardial infarction: Dependence on CCR2⁺ bone marrow cells. J Mol Cell Cardiol. 87, 4-16 (2015).
  14. Jamaiyar, A., et al. The essential role for endothelial cell sprouting in coronary collateral growth. J Mol Cell Cardiol. 165, 158-171 (2022).
  15. Yin, L., et al. Induction of vascular progenitor cells from endothelial cells stimulates coronary collateral growth. Circ Res. 110 (2), 241-252 (2012).
  16. Lavine, K. J., Kovacs, A., Weinheimer, C., Mann, D. L. Repetitive myocardial ischemia promotes coronary growth in the adult mammalian heart. J Am Heart Assoc. 2 (5), e000343(2013).
  17. Simons, M., et al. Clinical trials in coronary angiogenesis: issues, problems, consensus: An expert panel summary. Circulation. 102 (11), E73-E86 (2000).
  18. Leavesley, S. J., Ledkins, W., Rocic, P. A device for performing automated balloon catheter inflation ischemia studies. PLoS One. 9 (4), e95823(2014).
  19. Aghajanian, A., et al. Decreased inspired oxygen stimulates de novo formation of coronary collaterals in adult heart. J Mol Cell Cardiol. 150, 1-11 (2021).
  20. He, L., et al. Genetic lineage tracing discloses arteriogenesis as the main mechanism for collateral growth in the mouse heart. Cardiovasc Res. 109 (3), 419-430 (2016).
  21. Das, S., et al. A unique collateral artery development program promotes neonatal heart regeneration. Cell. 176 (5), 1128-1142.e18 (2019).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Ишемическая болезнь сердцакоронарные коллатералипередняя нисходящая артерияпневматический окклюдерангиогенезнокаут генапрослеживание клеточных линий

Эта статья была опубликована

Видео скоро будет доступно

Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.