Дифференцировка линий энтеральной нервной системы из плюрипотентных стволовых клеток человека

Краткое содержание

Получение линий энтеральной нервной системы (ЭНС) из плюрипотентных стволовых клеток человека (ПСК) обеспечивает масштабируемый источник клеток для изучения развития и заболеваний ЭНС, а также для использования в регенеративной медицине. Здесь представлен подробный протокол in vitro для получения кишечных нейронов из hPSCs с использованием химически определенных условий культивирования.

Аннотация

Энтеральная нервная система человека, ЭНС, представляет собой обширную сеть глиальных и нейрональных клеток с замечательным разнообразием нейротрансмиттеров. ЭНС контролирует перистальтику кишечника, секрецию ферментов и усвоение питательных веществ, а также взаимодействует с иммунной системой и микробиомом кишечника. Следовательно, дефекты развития и приобретенные дефекты ЭНС ответственны за многие заболевания человека и могут способствовать появлению симптомов болезни Паркинсона. Ограничения в животных модельных системах и доступ к первичным тканям создают значительные экспериментальные проблемы в исследованиях ЭНС человека. Здесь представлен подробный протокол эффективного in vitro получения линий ENS из плюрипотентных стволовых клеток человека, hPSC, с использованием определенных условий культивирования. Наш протокол начинается с направленной дифференцировки hPSCs в клетки кишечного нервного гребня в течение 15 дней и позволяет получить различные подтипы функциональных кишечных нейронов в течение 30 дней. Эта платформа предоставляет масштабируемый ресурс для исследований в области развития, моделирования заболеваний, разработки лекарств и регенеративных приложений.

Введение

Энтеральная нервная система (ЭНС) является крупнейшим компонентом периферической нервной системы. ЭНС содержит более 400 миллионов нейронов, которые расположены в желудочно-кишечном тракте и контролируют почти все функции кишечника. Молекулярное понимание развития и функции ЭНС и ее дефектов при энтеральных невропатиях требует доступа к надежному и достоверному источнику энтеральных нейронов. Доступ к первичным тканям человека ограничен, и животные модели не могут воспроизвести ключевые фенотипы заболеваний при многих кишечных невропатиях. Технология плюрипотентных стволовых клеток человека (hPSC) оказалась чрезвычайно полезной в обеспечении неограниченного источника желаемых типов клеток, особенно тех, которые трудно выделить из первичных источников 2,3,4,5,6,7. Здесь мы подробно описываем поэтапный и надежный метод in vitro для получения культур ЭНС из ЧПСК. Эти масштабируемые культуры, полученные из hPSC, открывают возможности для исследований развития, моделирования заболеваний и высокопроизводительного скрининга лекарств и могут обеспечить трансплантируемые клетки для регенеративной медицины.

Линии кишечных нейронов происходят от клеток нервного гребня (НК), следующих по пути развития ЭНС во время эмбриогенеза. У эмбрионов NC-клетки появляются по краям складчатой нервной пластинки. Они размножаются, мигрируют и дают начало множеству различных типов клеток, включая сенсорные нейроны, шванновские клетки, меланоциты, черепно-лицевой скелет и энтеральные нейроны, а также глии ^8,9,10. Решение о судьбе клетки зависит от отдельной области вдоль передне-задней оси, из которой выходят НК-клетки, т.е. краниальной НК, НК блуждающего нерва, НК туловища и НК крестца. ЭНС развивается из вагусных и сакральных НК-клеток, причем первые доминируют в популяции кишечных нейронов из-за обширной миграции по длине кишечника и колонизации кишечника¹¹.

Получение НК-клеток из ПСК обычно включает комбинацию двойного ингибирования SMAD и активации пути WNT^12,13. До недавнего времени все протоколы индукции НЗ включали добавление сыворотки и других добавок продуктов животного происхождения в условия культивирования. Химически неопределенные среды не только снижают воспроизводимость индукции ЧПУ, но и затрудняют механистические исследования развития. Чтобы преодолеть эти проблемы, Barber et^{al. 14} разработали протокол индукции NC с использованием химически определенных условий культивирования и, следовательно, имел преимущество по сравнению с альтернативными методами, которые полагаются на факторы замещения сыворотки (например, KSR)^13,14. Это было получено путем замещения базальных сред и оптимизации протокола, первоначально представленного Fattahi et al. для получения кишечных НК из hPSCs. Эта усовершенствованная система является основой представленного здесь протокола дифференцировки hPSC. Он начинается с индукции клеток кишечного нервного гребня (ENC) в течение 15-дневного периода путем точной модуляции сигналов BMP, FGF, WNT и TGFβ в дополнение к ретиноевой кислоте (RA). Затем мы получаем линии ЭНС путем обработки клеток нейротрофическим фактором глиальных клеток (GDNF). Все композиции сред определяются химически и дают устойчивые культуры кишечных нейронов в течение 30-40 дней.

В дополнение к описанной здесь монослойной системе культивирования клеток были разработаны альтернативные подходы к индукции НК, в которых используются свободно плавающие эмбриоидные тельца^15,16. Было показано, что мигрирующие клетки в этих культурах экспрессируют маркеры NC с субпопуляцией, представляющей НК блуждающего нерва. Кокультуры с первичной тканью кишечника были использованы для обогащения кишечных предшественников НК в этих культурах. Медиа-композиции в этих исследованиях содержат комбинацию различных факторов, таких как фактор роста нервов, NT3 и нейротрофический фактор мозга. На данном этапе не совсем ясно, как эти факторы могут повлиять на идентичность предшественников энтеральных нейронов. Для эффективного сравнения индукции энтерального НК в монослое и культурах, основанных на эмбриоидном теле, требуется больше данных. Учитывая различия в расположении культур в этих стратегиях, использование каждого метода должно быть рассмотрено и оптимизировано в соответствии с конкретным приложением.

Представленный здесь протокол является воспроизводимым и был успешно протестирован нами и другими специалистами с использованием^{различных линий} hPSC (индуцированных и эмбриональных) ^8,14,16.

Протокол

1. Подготовка СМИ

ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрации, упомянутые в протоколе, являются конечными концентрациями компонентов среды. Подготовьте все среды в стерильных условиях в ламинарном вытяжном шкафу и храните при температуре 4 °C в темноте. Используйте в течение 2 недель.

1. Среда для поддержания hPSC: Смешайте добавку для поддерживающей среды hPSC без кормушки (20 мкл/мл) с ее основной средой.
2. Среда А: Добавьте костный морфогенетический белок 4 (BMP4; 1 нг/мл), SB431542 (10 мкМ) и CHIR99021 (600 нМ) в среду основания для дифференцировки.
3. Среда В: Добавьте SB431542 (10 мкМ) и CHIR99021 (1,5 мкМ) в среду основания для дифференцировки.
4. Среда C: Добавьте SB431542 (10 мкМ), CHIR99021 (1,5 мкМ) и RA (1 мкМ) в среду основания для дифференцировки.
5. Среда Neural crest complete (NCC): добавьте FGF2 (10 нг/мл), CHIR99021 (3 μM), добавку N2 (10 μл/мл), добавку B27 (20 μл/мл), добавку L-глутамина (10 μл/мл) и MEM NEAA (10 μл/мл) в нейробазальную среду.
6. Среда ENC: добавьте GDNF (10 нг/мл), аскорбиновую кислоту (100 мкМ), добавку N2 (10 мкл/мл), добавку B27 (20 мкл/мл), добавку L-глутамина (10 мкл/мл) и MEM NEAA (10 мкл/мл) в нейробазальную среду.
7. Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) 1х: Развести 500 мМ ЭДТА (1000х) до конечной концентрации 500 мкМ в PBS.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте PBS без Ca²⁺ и Mg²⁺ на протяжении всего этого протокола, если не указано иное.

2. Покрытие культуральных пластин

1. Планшеты с покрытием базальной мембраны: Быстро разморозьте и разведите 500 мкл замороженной аликвоты матрицы базальной мембраны в 50 мл охлажденного DMEM:F12 путем энергичного пипетирования с помощью серологической пипетки объемом 50 мл. Покройте лунки разбавленным матричным раствором базальной мембраны (100 мкл на^см2 площади лунки) и инкубируйте их в течение ночи при температуре 37 °С. Перед применением отсадите защитную среду. Чтобы предотвратить желатинизацию матрицы базальной мембраны, выполните этот шаг как можно быстрее и используйте холодный DMEM:F12 для растворения замороженной аликвоты.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Температура матрицы базальной мембраны должна поддерживаться на низком уровне во время размораживания (на льду) и аликвотирования (трубки на льду) для предотвращения коагуляции.
2. Пластины, покрытые PO/FN/ламинином: Приготовьте раствор полиорнитина (PO) в PBS с концентрацией 15 мкг/мл, разбавив 1000x запас. Промазать лунки 100 мкл раствора PO/PBS на^см2 площади лунки и инкубировать планшеты в течение ночи при температуре 37 °C. На следующий день аспирируйте ПО/ПБС и покройте лунки в концентрации 100 мкл на^см2 площади лунки свежеприготовленным раствором FN/ламинина/PBS, содержащим 2 мкг/мл фибронектина (FN) и 2 мкг/мл ламинина. Планшеты можно использовать после инкубации минимум в течение 2 часов при 37 °C. Аспират FN/ламинин/PBS перед применением.

3. Поддержание культуры hPSC

ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы инкубации клеток происходят при 5%_CO2 и 37 °C в увлажненном инкубаторе.

1. Отбирайте среду hPSC из культуры hPSC и добавляйте свежую среду (200 μL на^см2 площади лунки) через день до тех пор, пока колонии не станут ~80% сливаться.
2. Для прохождения необходимо аспирировать среду hPSC и промыть ячейки 100 мкл PBS на^см2 площади поверхности лунки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Важно использовать Ca²⁺ и Mg²⁺ free PBS для промывания клеток.
3. Добавьте 500 мкМ ЭДТА (100 мкл на^см2 площади лунки). Установите на место крышку тарелки. Наблюдайте в перевернутый микроскоп и контролируйте клетки на предмет отслойки краев колонии (2-4 мин).
4. Используйте серологическую пипетку объемом 5 или 10 мл, чтобы передать один и тот же объем среды hPSC в каждую лунку и механически собрать клетки, несколько раз пипетируя вверх и вниз.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальное время инкубации ЭДТА зависит от линии iPSC. Избегайте энергичного пипетирования для отделения колоний, так как это может привести к чрезмерной диссоциации колонии и гибели клеток. При прохождении для начала дифференцировочной пластины инкубируйте клетки с ЭДТА в течение 1-2 мин дольше.
5. Переложите клеточную суспензию в коническую пробирку объемом 15 мл. Открутите клетки (2 мин, 290 х г, 20-25 °С) и осторожно выбросьте надосадочную жидкость.
6. Ресуспендирование клеток в соответствующем объеме среды hPSC и перенос в лунки новой пластины с покрытием матрицы базальной мембраны.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для регулярного поддержания hPSC используйте соотношение пассажа 1:18 - 1:24 (1:18 означает перенос одной трети клеток, диссоциированных из одной лунки 6-луночного планшета, в полностью новую пластину). Чтобы начать дифференцировочную пластину, соблюдайте коэффициент пропускания 5:6.
7. Инкубировать при 5%_CO2 и 37 °C.

4. Индукция нервного гребня

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг схематически представлен на рисунке 1А. Дифференцировку NC начинают, когда клетки примерно на 80% сливаются. Это будет достигнуто в течение 1-2 дней при прохождении клеток в соотношении 5:6 (см. выше). Начните дифференцировку НЦ в день 0 с плюрипотентных и полностью недифференцированных клеток hPSC. Для высокой эффективности границы колонии должны иметь минимальное количество дифференцирующих клеток. Проход и планшет hPSC для дифференцировки, когда колонии большие, или центр колонии начинает утолщаться/темнеть при наблюдении с помощью инвертированного микроскопа. Обращать внимание на слияние и морфологию, как правило, более надежно, чем на количество пластинчатых клеток, поскольку оно может варьироваться в зависимости от клеточной линии и может варьироваться от 50 000 до 200 000 на см² .

1. В день 0 замените поддерживающую среду hPSC на среду A, содержащую 1 нг/мл BMP4, 10 мкМ SB431542, 600 нМ CHIR99021 (200 мкл среды на^см2 площади скважины).
2. На 2-й день клетки должны быть на 100% сливающимися. Отработавшую среду А аккуратно отсасывать и подавать ячейки со средой В, содержащей 10 мкМ SB431542, 1,5 мкМ CHIR99021 (200 мкл среды на^см2 площади лунки).
   Примечание: По мере роста культур во время индукции NC клетки могут отделяться от нижележащего монослоя. Избегайте избыточной потери клеток, аккуратно удаляя старую среду и добавляя свежую среду на бортик лунки.
3. На 4-й день снова подайте в ячейки Medium B (200 мкл среды на^см2 площади лунки).
4. На 6-й день замените среду В на среду С, содержащую 10 мкМ SB431542, 1,5 мкМ CHIR99021 и 1 мкМ ретиноевой кислоты (400 мкл среды на^см2 площади лунки).
5. На 8 и 10 день кормите как на 6 день.

5. Формирование сфероида ENC

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг схематически представлен на рисунке 1B.

1. На 12-й день осторожно отсасывайте среду С и промойте ячейки 100 мкл PBS на^см2 площади лунки. Добавьте такой же объем раствора для отделения клеток и инкубируйте в течение 30 минут при 5%_CO2 и 37 °C.
2. Раствор для отделения клеток разбавляют путем добавления того же объема среды NCC, содержащей 10 нг/мл FGF2, 3 мкМ CHIR99021, 10 мкл/мл добавки N2, 20 мкл/мл добавки B27, 10 мкл/мл добавки L-глутамина и 10 мкл/мл MEM NEAA. С помощью серологической пипетки соберите одноклеточную суспензию и добавьте ее в коническую пробирку объемом 15 мл.
3. Открутите клетки (2 мин, 290 х г, 20-25 °С) и осторожно выбросьте надосадочную жидкость.
4. С помощью серологической пипетки объемом 10 мл добавьте 12 мл (для полного 6-луночного планшета) среды NCC и полностью ресуспендируйте клетки путем механического пипетирования вверх и вниз 1-2 раза. Перенесите суспензию ячеек на пластину со сверхнизким уровнем крепления.
   Примечание: Приблизительно 10^см2 монослойных ячеек ENC ресуспендируют в 2 мл среды NCC и переносят в одну лунку планшета со сверхнизким уровнем прикрепления. Это эквивалентно тому, как если бы полная 6-луночная индукционная пластина с ЧПУ была перенесена в полную 6-луночную пластину со сверхнизким креплением.
5. На 14-й день осторожно поворачивайте пластины, пока в центре каждой лунки не соберутся маленькие сфероиды. С помощью микропипетки P1000 медленными круговыми движениями аспирируйте отработанную среду NCC по окружности каждой лунки. Старайтесь избегать удаления свободно плавающих сфероидов.
6. Подавайте в клетки исходный объем среды НКЦ.

6. Индукция EN

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг схематически представлен на рисунке 1B.

1. На 15-й день примените ту же технику, что и на 14-й день, чтобы аккуратно удалить среду и промыть сфероиды PBS. Удалите как можно больше PBS, избегая сфероидов.
2. Добавить раствор для отрыва клеток (100 мкл на^см2 площади лунки) и диссоциировать сфероиды на отдельные клетки путем инкубации в течение 30 мин при 5%_СО2 и 37 °С.
3. С помощью серологической пипетки объемом 10 мл добавьте в каждую лунку равное количество среды ENC (содержащей 10 нг/мл GDNF, 100 мкМ аскорбиновой кислоты, 10 мкл/мл добавки N2, 20 мкл/мл добавки B27, 10 мкл/мл добавки L-глутамина и 10 мкл/мл MEM NEAA в нейробазальной среде) и разбейте оставшиеся сфероиды путем 2-3 раундов механического пипетирования. Переложите клетки в коническую пробирку объемом 50 мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте чрезмерного стресса и гибели клеток, которые могут произойти из-за принудительного пипетирования или использования пипеток с меньшим отверстием наконечника.
4. Открутите клетки (2 мин, 290 х г, 20-25 °С) и осторожно выбросьте надосадочную жидкость. С помощью серологической пипетки объемом 10 мл добавьте ~ 5-10 мл среды ENC и полностью ресуспендируйте клетки путем пипетирования вверх и вниз 1-2 раза.
5. Подсчитайте концентрацию жизнеспособных клеток с помощью трипанового синего и метода подсчета клеток, такого как гемоцитометр.
   ВНИМАНИЕ: Трипановый синий является подозреваемым канцерогеном. Обращайтесь с осторожностью, утилизируйте надлежащим образом.
6. Добавьте достаточное количество среды ENC, чтобы покрыть примерно 300 000-400 000 жизнеспособных клеток на^см2 площади поверхности с плотностью около ~ 1 000 000 клеток на мл. Аспират FN/ламинин/PBS раствор из лунок планшета.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите формат планшета в соответствии с анализами, которые запланированы для культур EN, поскольку этот этап знаменует собой заключительный этап повторного покрытия протокола. Предшественники кишечных нейронов можно замораживать на 15-й день. После диссоциации сфер раствором для отслойки клеток ресуспендируйте предшественники в концентрации примерно 5 x 10⁶ клеток/мл в замораживающей среде, такой как 10% ДМСО или Stem-cellbanker. При необходимости разморозьте в теплой среде ENC с 5 мкМ ингибитором Y-27632 ROCK. Пластинчатые ячейки в нужном формате пластины. Замените носитель свежим ENC через пару часов.
7. Аккуратно добавьте ячейки в лунки, покрытые PO/FN/ламинином. Избегайте попадания пузырьков под клеточную суспензию, предотвращая прикрепление клеток к покрытию PO/FN/ламинина, особенно при использовании планшетов с меньшим размером лунки, таких как 384-луночные планшеты. Это может привести к гибели клеток.
8. Кормите клетки через день средой ENC (200 мкл на^см2 площади лунки) до 30-40 дня, после чего уменьшите частоту подачи (до одного-двух раз в неделю), но увеличьте объем подачи в два раза (до 400 мкл среды на^см2 площади лунки).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это важно, так как чрезмерное удаление и добавление среды может способствовать отделению культуры нейронов от поверхности лунок. Для проспективной профилактики отслойки, особенно при длительном посеве, добавляйте ЭНК с FN (2 мкг/мл) и ламинином (2 мкг/мл) один раз в неделю.

Результаты

Этот протокол обеспечивает метод получения энтерального нервного гребня и энтеральных нейронов из hPSCs с использованием химически определенных условий культивирования (рис. 1A-B). Генерация высококачественных нейронов зависит от эффективного этапа индукции энтерального нервного гребня. Это можно визуально оценить, проверив морфологию свободно плавающих сфер, которые должны выглядеть круглыми с гладкими поверхностями размером примерно 0,1 - 0,4 мм, как показано на рисунке 1C. Эти сфероиды также должны экспрессировать маркер нервного гребня SRY-Box транскрипционный фактор 10 (SOX10)^17,18, как видно на рисунке 1D. Во время фазы индукции энтеральных нейронов невриты могут стать заметными уже на 25-30 день (рис. 1E). Однако это может быть замедлено при дифференцировке с более низкой эффективностью, содержащей нежелательные загрязнения мезенхимальных клеток. Энтеральная нервная система человека представляет собой совокупность разнообразных нейронов, экспрессирующих различные нейротрансмиттеры. Эта гетерогенность повторяется в предоставленном протоколе in vitro, и экспрессия ключевых маркеров может быть оценена с помощью методов окрашивания клеток, таких как иммунофлуоресцентная визуализация и проточная цитометрия в соответствии с ранее описанными протоколами 13,14,19,20,21 (рисунок 1F,G).

Рисунок 1: Получение человеческих ЭНК-клеток и подтипов энтеральных нейронов из hPSCs. (A) Индукция кишечного нервного гребня (ENC) из hPSC. Протокол (дни 0-12) с указанием составов сред для получения клеток ЭНК из ПСК. (B) Формирование сфероидов ENC и индукция энтеральных нейронов по протоколу ENC (дни 12-15), показывающим состав среды для формирования сфероидов ENC. После этого энтеральные нейроны генерируются и созревают путем обработки средой, содержащей GDNF и AA. (C) Репрезентативные фазово-контрастные изображения дифференцированных hPSCs в разные временные точки протокола. Масштабная линейка: 1000 мкМ. (D) SOX10::GFP экспрессирует сфероиды ENC, полученные из H9 iPSC, на 14-й день. Масштабная линейка: 1000 мкм. (E) Изображение фазового сокращения нейронов 33-го дня. Масштабная линейка: 400 мкм. (F-G) Иммунофлуоресцентная визуализация (F) и проточная цитометрия (G) маркеров нейротрансмиттеров в нейронах 40-го дня. Масштабная линейка: 50 μм. Сокращения: BMP4 = рекомбинантный человеческий белок BMP4; RA = ретиноевая кислота; FGF2 = рекомбинантный человеческий FGF базовый; GDNF = рекомбинантный нейротрофический фактор глиальных клеток человека; AA = аскорбиновая кислота. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Обсуждение

Описанный здесь протокол дифференцировки обеспечивает надежный метод in vitro для получения энтеральных нейронов из hPSCs в течение 30-40 дней (рис. 1E) и кишечной глии, экспрессирующей глиальный фибриллярный кислый белок, GFAP и SOX10 в более старых культурах (> день 55)13,14,19,22. Эти нейроны и глия индуцируются путем ступенчатой дифференцировки hPSCs в клетки блуждающего нервного гребня и кишечного нерва, за которыми следуют энтеральные нейроны и предшественники глии^13,14. Клетки нервного гребня экспрессируют маркеры нервного гребня, фактор транскрипции AP-2 альфа и бета, TFAP2A и TFAP2B соответственно²¹. Ранее мы показали, что CD49 может быть использован в качестве маркера для указания эффективности клеток нервного гребня, полученных из hPSC¹⁴. Эффективность и успешность этого метода зависит от совокупности факторов. Во-первых, крайне важно выполнять все этапы в стерильных условиях. Тестирование культур hPSC на контаминацию микоплазмой имеет важное значение, поскольку оно может негативно влиять на рост стволовых клеток и не обнаруживается визуально. Во-вторых, использование пластин с равномерным и правильным покрытием снижает вероятность неравномерного роста культуры hPSC и отслоения культур НК и более старых нейронов от поверхности лунок. В-третьих, для высокой эффективности дифференцировки важно начинать с плюрипотентных и полностью недифференцированных клеток hPSC. Колонии hPSC должны иметь минимальное количество дифференцирующих клеток на границах колонии. ПСК следует пропускать или покрывать для дифференцировки, когда колонии большие, или когда центр колонии начинает утолщаться/темнеть по цвету, как это наблюдается под фазово-контрастным микроскопом. Нежелательные дифференцированные клетки (обычно мезенхимальные клетки) не только снижают общую эффективность дифференцировки, но и могут привести к отрыву нейронов от поверхности лунки по мере старения культур. Поэтому рекомендуется тщательно контролировать посевы ENC в первые 15 дней. В условиях эффективной дифференцировки темные диски появляются на поверхности культуры ~ 6-й день, что указывает на эффективное формирование сфероидов на 12-15 день. Кроме того, в сфероидальной фазе (12-15 сутки) свободно плавающие сферы должны иметь гладкие поверхности (рисунок 1D). Поддержание фазы 3D-сфероида на 12-15 день, как правило, достаточно для улучшения чистоты ЭНК для последующей дифференциации культур в линии ЭНС. Тем не менее, для исследований, требующих ранних и чистых популяций клеток-предшественников ENC, рекомендуется FACS с использованием CD49D. CD49D является специфическим поверхностным маркером для линий НК, полученных из SOX10:hPSC, и успешно используется в клеточных линиях ^13,14. Для получения дополнительной информации об изоляции CD49D+ клеток с помощью FACS и рекомендаций по стратегии гейтирования ридеры см. в статье Barber et al., Рисунок 2D, Вставка 1 и Дополнительный рисунок 6¹⁴. В-четвертых, для достижения максимальной эффективности дифференцировка должна начинаться, когда культуры hPSC являются однослойными и на ~80% сливаются. Это означает, что на 2-й день у нас будет полностью конфлюентная культура. Более низкая конфлюенция негативно влияет на эффективность, а очень плотные культуры, как правило, имеют более высокую скорость гибели клеток и потенциально могут привести к появлению нежелательных дифференцированных клеток.

Повторное покрытие ячеек на 15-й день знаменует собой важный шаг в этом протоколе. Это последний этап переноса клеток для монослойной культуры нейронов, поэтому расположение планшетов должно быть выбрано в соответствии с запланированными анализами. Количество клеток, переносимых в каждую лунку, может значительно влиять на разнообразие нейронов и на то, что старые нейроны остаются прикрепленными к поверхности лунок. Как правило, желательна плотность ячеек в диапазоне 25000-350000 клеток на^см2 (около 75000-100000 клеток на лунку 96-луночного планшета или 500000-7000000 клеток на лунку 24-луночного планшета). Начиная с 30-40-го дня, можно рассмотреть возможность добавления фибронектина и ламинина в питательную среду (не чаще одного раза в неделю) для перспективного предотвращения отслойки нейронов, особенно для клеток, запланированных для более длительных культур нейронов. На этом этапе рекомендуется сократить частоту кормления до одного раза в 5-7 дней и оставлять немного среды в каждой лунке перед добавлением дополнительной свежей среды. Это снижает вероятность применения ненужной физической нагрузки на нейронные проекции. Учитывая испарение среды (особенно для лунок на границе пластины), можно удалить 75 мкл и добавить в каждую лунку по 100 мкл свежей среды. Исходя из опыта, культуры, выращенные на полимерных покровных донных пластинах, как правило, живут и остаются прикрепленными к поверхности скважины в течение более длительного времени. Таким образом, рекомендуется использовать полимерные покровные донные пластины для экспериментов, требующих очень старых культур нейронов, таких как совместные культуры с другими типами клеток. Несмотря на то, что высушенные на воздухе пластины, покрытые PO/FN/ламинином, все еще могут давать эффективную дифференцировку, это не было систематически протестировано для целей настоящего протокола. Следовательно, рекомендуется использовать тарелки со свежим покрытием.

Описанный здесь протокол основан на ранее опубликованном протоколе Barber et al¹⁴. По сравнению со старыми методами индукции ENC, в которых используются среды, содержащие факторы замещения сыворотки (например, KSR)^13,14, текущие условия среды протокола определяются химически. Это дает преимущество для более последовательной дифференциации и позволяет проводить более точные исследования развития путем манипулирования условиями культивирования. Этот надежный протокол воспроизводимо генерирует культуры кишечных нейронов из независимых индуцированных и эмбриональных линий стволовых клеток, которые были протестированы, таких как H9, UCSF4 и WTC11. Важным аспектом представленного протокола является его способность генерировать различные подтипы нейронов ЭНС, напоминающие те, которые обнаружены в человеческой ЭНС. Например, экспрессия специфических маркеров для различных нейрохимических идентичностей ЭНС может быть проверена с помощью проточной цитометрии и флуоресцентной визуализации (рис. 1F, G). Типичный диапазон популяций энтеральных нейронов, полученных из hPSC, положительных на синтазу оксида азота 1 (NOS1), составляет 5%-20%; холин О-ацетилтрансфераза (ЧАТ) составляет 40%-60%; гамма-аминомасляная кислота (ГАМК) составляет 15%-30%, а серотонин (5-HT) - 15%-30%. Тем не менее, степень, в которой структурная и функциональная связь in vitro между этими подтипами точно моделирует сотовые сети in vivo, требует дальнейших исследований. Кроме того, анализ отдельных клеток для расширения транскрипционного профилирования отдельных подтипов не только поможет лучше сравнить клеточную идентичность in vivo и in vitro, но и принесет пользу исследованиям в области разработок и молекулярных исследований, а также будущей оптимизации протоколов в направлении обогащения конкретных подтипов для разработки лекарств и регенеративной медицины.

Несмотря на то, что культуры содержат различные нейронные, а в более старых культурах глиальные клетки, этот протокол не генерирует другие типы клеток, естественно встречающиеся в нише in vivo ЭНС, такие как мышечные клетки, эпителиальные клетки и иммунные клетки. Изучение взаимодействия ЭНС с этими типами клеток в контексте здоровья и болезней требует инвестиций в оптимизацию систем кокультуры и кишечных органоидов. В целом, здесь описан мощный метод генерации различных подтипов ЭНС из hPSCs in vitro . Масштабируемые культуры подходят для исследований развития ЭНС человека, токсикологических испытаний и экспериментов по моделированию заболеваний, направленных на разработку лекарственных препаратов и предоставление трансплантируемых клеток для лечения кишечных невропатий.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Аскорбиновая кислота	Sigma-Aldrich	A5960
B27 добавка (без сыворотки, минус витамин А)	Gibco	12587-010
Матрица базальной мембраны, Geltrex	Gibco	A14133-2
BMP4	R& D systems	314-BP
Центрифуга для клеточных культур	Eppendorf, модель No 5810R	02262501
Раствор для отсоединения клеток, Accutase	Stemcell Technologies	07920
CHIR99021	Tocris	4423
Конические пробирки	США научные	1475-0511, 1500-1211
Базовая среда для дифференцировки, Essential 6	Life Технологии	A1516401
DMEM/F-12 без глютамина	Life Technologies	21331020
EDTA	Corning	MT-46034CI
Среда для поддержания hPSC без питательных веществ, Essential 8 Flex Medium Kit	Life Technologies	A2858501
FGF2	R& D systems	233-FB/CF
Фибронектин	Corning	356008
GDNF	Peprotech	450-10
Гемоцитометр	Hausser Scientific	1475
Человеческие плюрипотентные стволовые клетки, H9 ESC	WiCell	RRID: CVCL_1240
Инкубатор с контролируемой влажностью, температурой и CO2	Thermo Fisher Scientific	Herralcell 150i
Инвертированный микроскоп	Thermo Fisher Scientific	EVOS FL
Ламинарный проточный колпак	Thermo Fisher Scientific	1300 серия II, тип A2
Ламинин	Cultrex	3400-010
L-глутаминовая добавка, Glutagro	Corning	25-015-CI
MEM NEAAs	Corning	25-025-CI
Планшеты Multiwell, Falcon	BD	353934, 353075
N-2 Supplement	CTS	A1370701
Neurobasal Medium	Life Technologies	21103049
PBS (Ca и Mg free)	Life Technologies	10010023
Дозатор для пипеток	Eppendorf	Z768715-1EA
Наконечники для пипеток	США научные	1111-2830
Пипетки	Fisherbrand	13-678-11E, 13-678-11F
PO	Sigma-Aldrich	P3655
полимерные покровные пластины для нижней визуализации, там же		81156
RA	Sigma-Aldrich	R2625
SB431542	R& D systems	1614
Трипан синий морилка, 0,4%	Thermo Fisher Scientific	15250-061
Пластины со сверхнизким содержанием крепления	Fisher Scientific	07-200-601
Y-27632 дигидрохлорид	R& D системы	1254