Получение линий энтеральной нервной системы (ЭНС) из плюрипотентных стволовых клеток человека (ПСК) обеспечивает масштабируемый источник клеток для изучения развития и заболеваний ЭНС, а также для использования в регенеративной медицине. Здесь представлен подробный протокол in vitro для получения кишечных нейронов из hPSCs с использованием химически определенных условий культивирования.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Дифференцировка линий энтеральной нервной системы из плюрипотентных стволовых клеток человека
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Энтеральная нервная система человека, ЭНС, представляет собой обширную сеть глиальных и нейрональных клеток с замечательным разнообразием нейротрансмиттеров. ЭНС контролирует перистальтику кишечника, секрецию ферментов и усвоение питательных веществ, а также взаимодействует с иммунной системой и микробиомом кишечника. Следовательно, дефекты развития и приобретенные дефекты ЭНС ответственны за многие заболевания человека и могут способствовать появлению симптомов болезни Паркинсона. Ограничения в животных модельных системах и доступ к первичным тканям создают значительные экспериментальные проблемы в исследованиях ЭНС человека. Здесь представлен подробный протокол эффективного in vitro получения линий ENS из плюрипотентных стволовых клеток человека, hPSC, с использованием определенных условий культивирования. Наш протокол начинается с направленной дифференцировки hPSCs в клетки кишечного нервного гребня в течение 15 дней и позволяет получить различные подтипы функциональных кишечных нейронов в течение 30 дней. Эта платформа предоставляет масштабируемый ресурс для исследований в области развития, моделирования заболеваний, разработки лекарств и регенеративных приложений.
Введение
Энтеральная нервная система (ЭНС) является крупнейшим компонентом периферической нервной системы. ЭНС содержит более 400 миллионов нейронов, которые расположены в желудочно-кишечном тракте и контролируют почти все функции кишечника. Молекулярное понимание развития и функции ЭНС и ее дефектов при энтеральных невропатиях требует доступа к надежному и достоверному источнику энтеральных нейронов. Доступ к первичным тканям человека ограничен, и животные модели не могут воспроизвести ключевые фенотипы заболеваний при многих кишечных невропатиях. Технология плюрипотентных стволовых клеток человека (hPSC) оказалась чрезвычайно полезной в обеспечении не....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Подготовка СМИ
ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрации, упомянутые в протоколе, являются конечными концентрациями компонентов среды. Подготовьте все среды в стерильных условиях в ламинарном вытяжном шкафу и храните при температуре 4 °C в темноте. Используйте в течение 2 недель.
- Среда для поддержания hPSC: Смешайте добавку для поддерживающей среды hPSC без кормушки (20 мкл/мл) с ее основной средой.
- Среда А: Добавьте костный морфогенетический белок 4 (BMP4; 1 нг/мл), SB431542 (10 мкМ) и CHIR99021 (600 нМ) в среду основания для дифференцировки.
- Среда В: Добавьте SB431542 (10 мкМ) и CHIR99021 (1,5 мкМ) в среду....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Этот протокол обеспечивает метод получения энтерального нервного гребня и энтеральных нейронов из hPSCs с использованием химически определенных условий культивирования (рис. 1A-B). Генерация высококачественных нейронов зависит от эффективного этапа индукции энтерального нервного гребня. Это можно визуально оценить, проверив морфологию свободно плавающих сфер, которые должны выглядеть круглыми с гладкими поверхностями размером примерно 0,1 - 0,4 мм, как показано на
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Описанный здесь протокол дифференцировки обеспечивает надежный метод in vitro для получения энтеральных нейронов из hPSCs в течение 30-40 дней (рис. 1E) и кишечной глии, экспрессирующей глиальный фибриллярный кислый белок, GFAP и SOX10 в более старых культурах (> день 55)13,14,19,22. Эти нейроны и глия индуцируются путем ступенчатой дифференцировки hPSCs в.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Работа была поддержана грантами от Программы прорывных биомедицинских исследований UCSF и Фонда Сандлера, грантом March of Dimes No 1-FY18-394 и 1DP2NS116769-01, премией директора NIH New Innovator Award (DP2NS116769) для F.F. и Национальным институтом диабета, болезней пищеварительной системы и почек (R01DK121169) для F.F., H.M. поддерживается стипендией Фонда Ларри Л. Хиллблома для постдокторантов. Стипендия NIH T32-DK007418 и независимая постдокторская стипендия UCSF Program for Breakthrough Biomedical Research.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Аскорбиновая кислота | Sigma-Aldrich | A5960 | |
| B27 добавка (без сыворотки, минус витамин А) | Gibco | 12587-010 | |
| Матрица базальной мембраны, Geltrex | Gibco | A14133-2 | |
| BMP4 | R& D systems | 314-BP | |
| Центрифуга для клеточных культур | Eppendorf, модель No 5810R | 02262501 | |
| Раствор для отсоединения клеток, Accutase | Stemcell Technologies | 07920 | |
| CHIR99021 | Tocris | 4423 | |
| Конические пробирки | США научные | 1475-0511, 1500-1211 | |
| Базовая среда для дифференцировки, Essential 6 | Life Технологии | A1516401 | |
| DMEM/F-12 без глютамина | Life Technologies | 21331020 | |
| EDTA | Corning | MT-46034CI | |
| Среда для поддержания hPSC без питательных веществ, Essential 8 Flex Medium Kit | Life Technologies | A2858501 | |
| FGF2 | R& D systems | 233-FB/CF | |
| Фибронектин | Corning | 356008 | |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | |
| Гемоцитометр | Hausser Scientific | 1475 | |
| Человеческие плюрипотентные стволовые клетки, H9 ESC | WiCell | RRID: CVCL_1240 | |
| Инкубатор с контролируемой влажностью, температурой и CO2 | Thermo Fisher Scientific | Herralcell 150i | |
| Инвертированный микроскоп | Thermo Fisher Scientific | EVOS FL | |
| Ламинарный проточный колпак | Thermo Fisher Scientific | 1300 серия II, тип A2 | |
| Ламинин | Cultrex | 3400-010 | |
| L-глутаминовая добавка, Glutagro | Corning | 25-015-CI | |
| MEM NEAAs | Corning | 25-025-CI | |
| Планшеты Multiwell, Falcon | BD | 353934, 353075 | |
| N-2 Supplement | CTS | A1370701 | |
| Neurobasal Medium | Life Technologies | 21103049 | |
| PBS (Ca и Mg free) | Life Technologies | 10010023 | |
| Дозатор для пипеток | Eppendorf | Z768715-1EA | |
| Наконечники для пипеток | США научные | 1111-2830 | |
| Пипетки | Fisherbrand | 13-678-11E, 13-678-11F | |
| PO | Sigma-Aldrich | P3655 | |
| полимерные покровные пластины для нижней визуализации, там же | 81156 | ||
| RA | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| SB431542 | R& D systems | 1614 | |
| Трипан синий морилка, 0,4% | Thermo Fisher Scientific | 15250-061 | |
| Пластины со сверхнизким содержанием крепления | Fisher Scientific | 07-200-601 | |
| Y-27632 дигидрохлорид | R& D системы | 1254 |
Ссылки
- Gershon, M. D. The enteric nervous system: a second brain. Hosp Pract. 34 (7), 35-38 (1999).
- Haggarty, S. J., Silva, M. C., Cross, A., Brandon, N. J., Perlis, R. H. Advancing drug discovery for neuropsychiatric disorders using patient-specific stem cell models. Mol C....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
