Методическая статья

Одномолекулярное измерение динамики взаимодействия белков в биомолекулярных конденсатах

DOI:

10.3791/66169

⸱

5 января 2024 г.

 , 
1Division of Chemistry and Chemical Engineering, California Institute of Technology, 2Division of Biology and Biological Engineering, California Institute of Technology

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Было показано, что многие внутренне неупорядоченные белки участвуют в образовании высокодинамичных биомолекулярных конденсатов, что важно для многих клеточных процессов. В данной работе мы представляем метод количественной оценки динамики, с помощью которой белки взаимодействуют друг с другом в биомолекулярных конденсатах в живых клетках, основанный на визуализации одной молекулы.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Биомолекулярные конденсаты, образующиеся с помощью фазового разделения жидкость-жидкость (LLPS), считаются критически важными для клеточной организации и растущего числа клеточных функций. Характеристика LLPS в живых клетках важна еще и потому, что аберрантная конденсация связана со многими заболеваниями, включая рак и нейродегенеративные расстройства. LLPS часто обусловлен селективными, транзиторными и поливалентными взаимодействиями между внутренне неупорядоченными белками. Большой интерес представляет динамика взаимодействия белков, участвующих в LLPS, которая хорошо обобщается измерениями времени их пребывания в связях (RT), то есть количества времени, которое они проводят связанными в конденсатах. Здесь мы представляем метод, основанный на визуализации живых клеток одной молекулы, который позволяет измерить среднюю RT конкретного белка в конденсатах. Мы одновременно визуализируем отдельные белковые молекулы и конденсаты, с которыми они связаны, используем отслеживание одной частицы (SPT) для построения одномолекулярных траекторий, а затем подгоняем траектории к модели связывания белка с каплей для извлечения среднего RT белка. Наконец, мы показали репрезентативные результаты, в которых этот метод визуализации одной молекулы был применен для сравнения средних RT белка в его конденсатах LLPS при слиянии и неслиянии с олигомеризующим доменом. Этот протокол широко применим для измерения динамики взаимодействия любого белка, участвующего в LLPS.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Растущее количество работ показывает, что биомолекулярные конденсаты играют важную роль в клеточной организации и многочисленных клеточных функциях, например, транскрипционная регуляция 1,2,3,4,5, восстановление повреждений ДНК 6,7,8, организация хроматина 9,10,11,12, Х-хромосома инактивация 13,14,15 и внутриклеточная сигнализация 16,17,18. Кроме того, нарушение регуляции биомолекулярных конденсатов связано со многими заболеваниями, включая рак 19,20,21 и нейродегенеративные расстройства 22,23,24,25,26. Образование конденсата часто обусловлено переходными, селективными и поливалентными взаимодействиями белок-белок, белок-нуклеиновая кислота или нуклеиновая кислота-нуклеиновая кислота27. При определенных условиях эти взаимодействия могут привести к разделению фаз жидкость-жидкость (LLPS), переходу плотности, который локально обогащает определенные биомолекулы в безмембранных каплях. Такие поливалентные взаимодействия часто опосредованы внутренне неупорядоченными областями (IDR) белков 1,28,29. Биофизическая характеристика этих взаимодействий на молекулярном уровне имеет решающее значение для нашего понимания многочисленных здоровых и аберрантных клеточных функций, учитывая распространенность конденсата в них. Несмотря на то, что методы, основанные на конфокальной флуоресцентной микроскопии, например, восстановление флуоресценции после фотообесцвечивания (FRAP)30,31,32, широко используются для качественного показа того, что молекулярные обмены между конденсатами и окружающей клеточной средой являются динамическими, количественная оценка динамики взаимодействия конкретных биомолекул в конденсатах, как правило, невозможна с помощью обычной конфокальной микроскопии или одномолекулярной микроскопии микроскопия без специализированных методов анализа данных. Метод отслеживания отдельных частиц (SPT), описанный в этом протоколе, основан на микроскопии живых клеток с одной молекулой33 и предоставляет уникальный мощный инструмент для количественной оценки динамики взаимодействия между конкретными белками в конденсатах. Считывание SPT для такого измерения представляет собой среднее время пребывания интересующего белка в конденсатах.

Протокол можно разбить на две части - сбор данных и анализ данных. Первым этапом получения данных визуализации является экспрессия в клетках интересующего белка, который соединяется с HaloTag34. Это позволяет помечать интересующий белок двумя флуорофорами, где большинство белковых молекул должны быть помечены нефотоактивируемым флуорофором (например, JFX549 Halo лиганд35), а небольшая часть из них должна быть помечена спектрально различным, фотоактивируемым флуорофором (например, PA-JF646 Halo лиганд36). Это позволяет одновременно захватывать все места скопления конденсата в клетке и получать одномолекулярные пленки интересующего белка, связываясь и разсвязываясь с конденсатами. Между тем, один и тот же тип клеток модифицируется для стабильной экспрессии Halo-меченого H2B, гистона, который в значительной степени неподвижен на хроматине. Затем клетки окрашивают гало-лигандом PA-JF646, чтобы обеспечить одномолекулярную визуализацию H2B. Как будет подробно рассмотрено ниже, этот эксперимент учитывает вклад фотообесцвечивания в точную количественную оценку динамики взаимодействия интересующего белка. Затем клетки для экспериментов по визуализации должны быть культивированы на чистых покровных стеклах, окрашены лигандом (лигандами) HaloTag и собраны в камеру для визуализации живых клеток. После этого образец визуализируется под высоконаклонным и ламинированным оптическим листом (HILO) на флуоресцентном микроскопе с полным внутренним отражением (TIRF), способном выполнять двухканальную визуализацию и детектирование одной молекулы. Затем излучение разделяется на две камеры, одна из которых отслеживает положение конденсата, а другая — отдельные молекулы. Сбор данных осуществляется с длительным временем интеграции (порядка сотен мс) для размытия свободно диффундирующих белков и захвата только тех белков, которые менее подвижны из-за связывания со стабильными структурами в клетке37.

Первым шагом анализа данных является использование установленного алгоритма отслеживания отдельных частиц (SPT)38,39 для локализации отдельных белковых молекул в каждом кадре фильма и объединения локализаций в траекторию для каждой молекулы в течение ее обнаруживаемого времени жизни. Затем траектории сортируются на те, которые представляют молекулы внутри, и те, которые представляют молекулы вне конденсата, путем сравнения локализаций молекул на протяжении их траекторий с локализациями всех конденсатов в соответствующие моменты времени1.

Далее строится кривая выживаемости (1 - CDF) с использованием длин всех траекторий в конденсате. Кажущееся среднее время пребывания молекул затем извлекается путем подгонки кривой выживания к следующей двухкомпонентной экспоненциальной модели связывания с белками:

figure-introduction-1,

где A — доля неспецифически связанных молекул и kobs,ns и kobs,s — наблюдаемые скорости диссоциации неспецифически связанных и специфически связанных молекул соответственно. С этого момента рассматривается только kobs,s . Динамика как диссоциации белков, ktrue,s, так и фотообесцвечивания флуорофора, kpb, вносит свой вклад в kobs,s как

figure-introduction-2;

таким образом, чтобы изолировать эффекты диссоциации белка, измеряется удельная скорость диссоциации H2B-Halo в упомянутой выше клеточной линии.

figure-introduction-3

H2B представляет собой белок, который стабильно интегрирован в хроматин и испытывает минимальную диссоциацию во временной шкале захвата одномолекулярной кинопленки37. Его удельная скорость диссоциации в этом случае равна скорости фотообесцвечивания гало-лиганда PA-JF646, или

figure-introduction-4.

Среднее время пребывания в конденсате интересующего figure-introduction-5белка , , равно

figure-introduction-6.

Приведены репрезентативные результаты работы Irgen-Gioro et al.40 , где этот протокол был применен для демонстрации того, что слияние домена олигомеризации с IDR приводит к более длительному времени пребывания IDR в его конденсатах. Этот результат говорит о том, что добавленный домен олигомеризации стабилизирует гомотипические взаимодействия IDR, которые управляют LLPS. В принципе, тот же метод с несколько измененными протоколами может быть применен для характеристики гомотипических или гетеротипических взаимодействий любого белка, участвующего в образовании любых типов конденсатов.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Мечение белков в клетках

  1. Экспрессируйте интересующий белок, слившийся с HaloTag, в желаемой клеточной линии.
  2. Стабильно экспрессировать Halo-меченый H2B в том же типе клеток, что и в 1.1, с помощью транспозонов или вирусной трансдукции.

2. Подготовка покровных листов

  1. Перед использованием покровных стекол для клеточной культуры очистите покровные стекла для удаления автофлуоресцентных загрязнений.
    1. Установите покровные стекла диаметром 25 мм #1,5 на керамическую стойку для окрашивания и поместите в полипропиленовый контейнер.
    2. Полностью погружают покровные стекла в 1 М раствор КОН и ультразвукируют на 1 ч.
    3. Промойте покровные стекла три раза дважды дистиллированной водой (ddH2O).
    4. Полностью погрузите покровные стекла в 100% этанол и проведите ультразвуком в течение 1 часа.
    5. Полностью погрузите покровные стекла в 20% этанол, разбавленный ddH2O, и храните при температуре 4 °C до использования.

3. Подготовка клеток к микроскопии

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте действия, описанные в этом разделе, в шкафу биобезопасности, чтобы предотвратить загрязнение клеток.

  1. Пластинчатые ячейки на очищенных покровных стеклах. Выполните за 2 дня до визуализации, если белок, меченный гало, должен быть временно экспрессирован. Выполняйте за 1 день до визуализации, если белок, помеченный гало, экспрессируется стабильно или эндогенно.
    1. Используйте стерильные щипцы, чтобы поместить покровные стекла в 6-луночный планшет (один покровный лист/лунка на образец клетки) и дайте остаточному этанолу испариться.
    2. Заполните каждую лунку соответствующим количеством ячеек, чтобы достичь 70% слияния к моменту визуализации. Выложите дополнительную лунку с клетками, стабильно экспрессирующими H2B-Halo с тем же целевым слиянием.
    3. Выполняйте этот шаг только в том случае, если вы временно экспрессируете интересующий вас белок, помеченный гало. Инкубируют клетки в течение 24 ч при 37 °C и 5% CO2. Затем трансфицируют клетки плазмидой, кодирующей интересующий меченый белок, используя соответствующие трансфекционные реагенты и следуя рекомендациям производителя.
    4. Инкубируют клетки в течение 24 ч при 37 °C и 5%CO2.
  2. Окрасьте клетки, экспрессирующие интересующий Halo-меченый белок, как нефотоактивируемым Halo-лигандом (например, JFX549), так и фотоактивируемым Halo-лигандом (например, PA-JF646). Окрашивание клеток, экспрессирующих H2B-Halo, только фотоактивируемым Halo-лигандом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрации галолигандов, перечисленные здесь, должны использоваться в качестве отправной точки; Оптимальная концентрация будет зависеть от уровня экспрессии и локальной концентрации в конденсате интересующего белка.
    1. Для каждого образца клеток, экспрессирующих интересующий Halo-меченый белок, разводят 100 нМ JFX549 Halo лиганд35 и 20 нМ PA-JF646 Halo лиганд36 в 500 мкл соответствующей клеточной среды. Для каждого образца, экспрессирующего H2B-Halo, разводят только 20 нМ лиганда PA-JF646 Halo в 500 мкл соответствующей клеточной среды.
    2. Для каждой лунки аспирируйте существующую среду, добавляйте 2 мл 1x PBS, затем аспирируйте PBS (это называется «промывкой» для остальной части протокола) и заменяйте средой, содержащей соответствующие гало-лиганды.
    3. Инкубируют в течение 1 ч при 37 °C и 5% CO2.
    4. Промойте PBS четыре раза и замените свежей средой, не содержащей галолигандов.
    5. Инкубировать 15 мин при 37 °C и 5% CO2.
    6. Повторите шаги 3.2.4 и 3.2.5 три раза (всего четыре цикла промывки-инкубации).
    7. Используйте стерильные щипцы для переноса покровного стекла с клетками в камеру для клеточной культуры, совместимую со столиком микроскопа.
    8. Добавьте в камеру среду, не содержащую фенолового красителя, и приступайте к визуализации. Инкубируйте образцы, не подвергающиеся немедленному визуализации, при температуре 37 °C и 5%CO2 до тех пор, пока это не понадобится.

4. Одномолекулярная визуализация

ПРИМЕЧАНИЕ: Независимые эксперименты, измеряющие время пребывания как H2B, так и интересующего белка, должны проводиться в течение нескольких (≥3) дней для получения статистически значимых результатов. Перед визуализацией образцов клеток на микроскопе совместите две камеры с помощью окрашенных микросфер размером 0,1 мкм (таблица материалов) или аналогичного калибровочного стандарта.

  1. Подготовьте микроскоп.
    1. Включите микроскоп и компьютер, который управляет микроскопом.
    2. Включите на микроскопе компоненты инкубации живых клеток (нагреватель иСО2) и установите его на 37 °C и 5% CO2. Дайте системе уравновеситься.
    3. Нанесите каплю соответствующего масла на 100-кратный масляный иммерсионный объектив TIRF на микроскопе и загрузите образец клетки на предметный столик микроскопа.
  2. Идентификация ячейки для изображения.
    1. Визуализируйте образец ячейки при ярком освещении и отрегулируйте z-положение до тех пор, пока ячейки не окажутся в фокусе.
    2. Определите клетку, которая проявляет морфологические характеристики здоровых клеток.
    3. Обрежьте поле зрения (FOV) так, чтобы оно захватывало только ядро целевой клетки.
    4. Используйте лазерную подсветку и регулируйте угол TIRF до тех пор, пока не будет достигнута освещенность HILO41 с оптимальным соотношением сигнал/шум отдельных молекул.
  3. Изображение H2B-Halo в живых клетках.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мощность лазера, используемая в этом разделе, специфична для данного эксперимента и приведена в качестве примера. Соответствующие мощности лазера должны быть выбраны в соответствии с критериями, перечисленными в обсуждении.
    1. Настройте конфигурацию сбора данных следующим образом. Установите время экспозиции 500 мс. В течение каждых 500 мс возбуждайте молекулы H2B-Halo, меченные PA-JF646, пучком 9,1 мВт, 640 нм. В течение мертвого времени между кадрами (158,01 мкс на используемой здесь системе визуализации) фотоактивируйте молекулы с помощью пучка 111 мкВт, 405 нм.
    2. Непрерывная съемка 2000 кадров с этими настройками. Постепенно увеличивайте мощность пучка с длиной волны 405 нм в процессе захвата, когда количество фотоактивированных молекул становится недостаточным.
  4. Изображение Halo-меченого белка, представляющего интерес в живых клетках.
    1. Используйте длиннопроходное дихроичное зеркало для разделения длин волн излучения между двумя камерами, одна из которых предназначена для обнаружения PA-JF646, а другая — для обнаружения JFX549. Используйте соответствующие фильтры излучения перед камерами.
    2. Используйте ту же конфигурацию сбора, что описана в 4.3.1, но со следующей модификацией. Добавьте дополнительный канал JFX549 для отслеживания местоположения белковых конденсатов, помеченных гало, с течением времени. Каждые 10 с захватывайте один кадр (500 мс, 2,1 мВт, возбуждение 561 нм) в канале JFX549, сохраняя при этом захват канала PA-JF646. Это приведет к утечке в канал PA-JF646, что будет учтено при анализе данных после сбора данных.
    3. Непрерывная съемка 2000 кадров с этими настройками. Постепенно увеличивайте мощность пучка с длиной волны 405 нм в процессе захвата, когда количество фотоактивированных молекул становится недостаточным.

5. Анализ данных визуализации отдельных молекул

ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры, используемые в разделе 5, относятся к данному эксперименту и приведены в качестве примера. Соответствующие параметры должны быть выбраны в соответствии с критериями, перечисленными в обсуждении.

  1. Подготовка необработанных данных визуализации для обработки.
    1. Для получения данных интересующего белка преобразуйте каждый канал из файла необработанных данных изображения в независимый файл .tif с помощью ImageJ или аналогичного программного обеспечения для обработки изображений. Для данных H2B таким же образом преобразуйте один канал из файла необработанных данных изображения в файл .tif.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от используемого программного обеспечения для сбора данных, в видеоролике о конденсате могут быть пустые кадры, так как каждые 10 секунд делается только один кадр отслеживания конденсата. Пустые кадры должны быть заполнены самой последней рамкой конденсата (некоторые программы для сбора данных делают это автоматически). Кроме того, если во время этих рамок слежения за конденсатом происходит значительное просачивание из конденсатного канала (JFX549) в одномолекулярный (PA-JF646) канал, соответствующие одномолекулярные рамки должны быть заменены самыми последними одномолекулярными рамками.
    2. Если в каком-либо из фильмов есть кадры, которые необходимо заменить по вышеуказанным причинам, замените их самым последним кадром из этого фильма, изменив (при необходимости) и запустив pretracking_comb.txt, макрос ImageJ, доступный в Chong et al.1, и следуя подсказкам.
  2. Генерация траекторий одиночных частиц с помощью программного обеспечения SPT, например, SLIMfast39, реализации алгоритма MTT38 с графическим интерфейсом, доступной в Teves et al.42.
    1. Загрузите файл из версии 5.1.2, содержащий одномолекулярный фильм, в SLIMfast, нажав на кнопку Load > Imagestack.
    2. Задайте параметры (частота ошибок локализации: 10-6; дефляционные петли: 3) для локализации, нажав OPT > Лист: Локализация.
    3. Задайте параметры (пик излучения: 664 нм; время задержки: 500 мс) для сбора данных, нажав кнопку OPT > Лист: Сбор.
    4. Визуализируйте локализацию всех молекул в одном кадре, чтобы убедиться в том, что выбранные параметры соответствуют (TEST LOC). Если это неуместно, измените параметры на шагах 5.2.2 и 5.2.3 и повторите этот шаг.
    5. Сгенерируйте файл, содержащий локализации всех молекул в каждом кадре (LOC ALL).
    6. Загрузите файл из версии 5.2.5 в SLIMfast, щелкнув Load > Particle Data > SLIMfast.
    7. Задайте параметры (максимальный ожидаемый коэффициент диффузии: 0,1мкм2/с; максимальное количество участников: 5) для генерации траектории нажатием кнопки OPT > Лист: Отслеживание.
    8. Сгенерируйте файл, содержащий траектории всех молекул (GEN TRAJ).
  3. Отфильтруйте траектории, которые короче tmin, 2,5 с, используя evalSPT39, доступный в Drosopoulos et al.43, чтобы учесть ошибки отслеживания, которые приводят к искусственно коротким траекториям.
    1. Загрузите файл из 5.2.8 в evalSPT (+ > файл из 5.2.8 > OK).
    2. Задайте параметры (мин.: 5 кадров; max: максимальная длина траектории для файла из 5.2.8), чтобы отфильтровать траектории короче 2.5 с.
    3. Сгенерируйте файл со всеми отфильтрованными траекториями (EXPORT DATA).
  4. Выполните этот шаг только для траекторий интересующего вас белка. Отсортируйте траектории на траектории в конденсатах и вне конденсатов, а затем извлеките среднее время пребывания в конденсате.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все коды для этого раздела доступны в Chong et al.1.
    1. Установите пороговое значение для всех кадров фильма, полученных в канале JFX549, для создания интервального видеоролика, заполненного изменяющейся во времени двоичной маской, выделяющей местоположения конденсата, запустив макрос ImageJ, ядро и кластер mask_v2.txt и следуя подсказкам.
    2. Переформатирование одномолекулярных траекторий, сгенерированных в 5.3.3. с помощью сценария MATLAB, ConvertASCII_SlowTracking_css3.m, и при необходимости изменяя имена файлов, пути и параметры. (Параметры: Выдержка, 0,5 с; Разрешение, 0,16 мкм/пиксель).
    3. Сортируйте траектории на основе доли времени жизни, которое данная молекула проводит в конденсате, F, используя сценарий MATLAB, categorization_v4.m и корректируя имена файлов и пути по мере необходимости.
    4. Продолжайте, используя только траектории в конденсате.
  5. Извлеките kobs,s и kpb и вычислите скорректированное среднее время пребывания, figure-protocol-1.
    1. Извлечение kobs,s из траекторий интересующего нас белка в конденсате с помощью сценария MATLAB, PLOT_ResidenceHist_css.m и настройки имен файлов, путей и параметров по мере необходимости.
      (Параметры: Выдержка, 0,5 с; StartFrameForFit, 5 кадров).
    2. Извлеките kpb из траекторий H2B с помощью сценария MATLAB, PLOT_ResidenceHist_css.m и настроив имена файлов, пути и параметры по мере необходимости.
      (Параметры: Выдержка, 0,5 с; StartFrameForFit, 5 кадров).
    3. Вычислить скорректированное среднее время пребывания интересующего белка, специфически связанного с его конденсатами, figure-protocol-2как
      figure-protocol-3
      ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимо провести контроль, чтобы убедиться, что различное время экспозиции, достаточное для размытия подвижных частиц, например, 300 мс и 800 мс, по-прежнему приводит к одинаковому среднему времени пребывания интересующего белка.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем репрезентативные результаты работы Irgen-Gioro et al.40, где мы использовали этот протокол SPT для сравнения динамики взаимодействия двух белков в соответствующих самоорганизующихся конденсатах LLPS. TAF15 (TATA-box-связывающий белок-ассоциированный фактор 15) содержит IDR, который может подвергаться LLPS при гиперэкспрессии в клетках человека. Мы предположили, что слияние TAF15(IDR) с FTH1 (тяжелая цепь ферритина 1), который образует 24-субъединичный олигомер, приведет к более стабильным гомотипическим белок-белковым взаимодействиям, которые управляют LLPS. Чтобы проверить эту гипотезу, мы временно экспрессировали в клетках U2OS слияние Halo-TAF15 (IDR) или TAF15(IDR)-Halo-FTH1 и выполнили двухцветную одномолекулярную визуализацию каждого белка в соответствии с описанным выше протоколом. Репрезентативный кадр из видеоролика TAF15(IDR)-Halo-FTH1 показан на рисунке 1A. Молекулы, обнаруженные в канале PA-JF646, были локализованы, и эти локализации были собраны в траектории. Затем полученные траектории были отсортированы между популяциями в конденсате и вне конденсата путем сравнения с бинарной маской, выделяющей местоположения конденсата (рис. 1B). Несмотря на то, что для хорошей видимости мы показываем лишь малую часть траекторий, существует четкое различие между траекториями молекул, связанных с конденсатом и связанных вне конденсата. Затем кривая выживаемости длин траекторий в конденсате была сопоставлена с двухкомпонентной экспоненциальной моделью (рис. 1C). Наконец, были извлечены и построены графики среднего времени пребывания после коррекции на фотообесцвечивание для обоих белков (рис. 1D). Мы обнаружили, что среднее время пребывания Halo-TAF15(IDR) в конденсатах LLPS составило 10,23 с ± 1,10 с, в то время как TAF15(IDR)-Halo-FTH1 составило 64,15 с ± 11,65 с. Этот результат говорит о том, что добавление олигомеризирующего домена к TAF15(IDR) действительно стабилизирует связывание белка с конденсатом.

figure-results-1
Рисунок 1: Метод на основе SPT позволяет устранить различия во времени пребывания белков в их конденсатах. Ответ. Репрезентативные кадры из двухцветного одномолекулярного фильма TAF15(IDR)-Halo-FTH1. Белки были помечены комбинацией более высокой концентрации нефотоактивируемого красителя (100 нМ JFX549, желтый) для визуализации расположения конденсатов и более низкой концентрации фотоактивируемого красителя (20 нМ PA-JF646, пурпурный) для визуализации отдельных белков, что позволило использовать SPT. Для Halo-TAF15(IDR) были получены видеоролики в одинаковых условиях изображения, а для H2B-Halo — одноканальные видеоролики PA-JF646. Ядро очерчено белой пунктирной линией. B. Репрезентативное объединенное изображение с наложением бинарной маски положения конденсата (серый) и траекторий (многоцветный). C. Репрезентативная кривая выживаемости TAF15(IDR)-Halo-FTH1, адаптированная к двухкомпонентной экспоненциальной модели. D. Среднее время пребывания Halo-TAF15 в конденсате было значительно короче, чем у TAF15(IDR)-Halo-FTH1 в соответствующих конденсатах. Значение для каждого белка было усреднено из 20 клеток, измеренных в независимых экспериментах, проведенных в течение трех дней. Ошибка распространялась как стандартная ошибка среднего значения, а звездочка представляет собой существенную разницу во времени пребывания двух белков (p<0,05, критерий ранговой суммы Вилкоксона). Этот рисунок был адаптирован с разрешения Irgen-Gioro et al.40. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол, представленный здесь, предназначен для систем, подобных тем, которые исследованы в работе Irgen-Gioro et al.40. В зависимости от области применения некоторые компоненты протокола могут быть изменены, например, метод генерации флуоресцентно меченных клеточных линий, система флуоресцентного мечения и используемый стиль покровного стекла. Гало-мечение белка в клетке может быть выполнено с помощью двух стратегий, в зависимости от того, какая из них больше подходит для данного эксперимента. 1) Экзогенная экспрессия: слияние интересующего белка с HaloTag и экспрессия слияния в клеточной линии-мишени либо временно с помощью трансфекции, либо стабильно с помощью транспозонов или вирусной трансдукции. 2) Редактирование генома: вбивание HaloTag в локус гена, кодирующего интересующий эндогенный белок в клеточной линии-мишени, с помощью методов редактирования генома, например, CRISPR44. Преимущества и недостатки каждого из них обсуждаются в другомместе, но вкратце стратегия экзогенной экспрессии менее трудоемка, но создает популяцию клеток с широким диапазоном уровней экспрессии, которые часто являются нефизиологичными. Стратегия редактирования генома занимает гораздо больше времени, но помечает эндогенно экспрессируемые белки, представляющие интерес, на уровне их нативной экспрессии.

Кроме того, этот протокол специально не требует использования HaloTag; Скорее, он совместим с любой меткой, которая позволяет одновременно мечить одну молекулу и ансамбль одного и того же белка в клетке. Таким образом, протокол может быть модифицирован для использования с другими самомаркировочными метками, такими как SNAP-tag46. Наконец, предварительно очищенные коммерческие чашки со стеклянным дном для клеточных культур, такие как чашки MatTek (MatTek Life Sciences, P35G-1,5-20-C), могут использоваться вместо покровных камер при условии, что они совместимы с объективом микроскопа и иммерсионным маслом; Тем не менее, покровные стекла можно более тщательно очищать непосредственно перед использованием, поэтому они предпочтительнее.

Несмотря на то, что вышеуказанные модификации протокола являются необязательными, существуют экспериментальные и аналитические параметры, которые должны быть оптимизированы, а именно: концентрации лигандов HaloTag, мощность лазера, параметры локализации и отслеживания, а также tmin. Концентрация нефотоактивируемого лиганда HaloTag должна быть выбрана таким образом, чтобы конденсат был достаточно плотно помечен для создания маски. Концентрация фотоактивируемого лиганда HaloTag и мощность фотоактивационного лазера должны быть подобраны таким образом, чтобы белковые молекулы были мечены и фотоактивированы достаточно редко, чтобы генерировать качественные одночастичные траектории, так как избыток локализаций в каждом кадре приведет к неточной генерации траектории. Для экспериментов, показанных в репрезентативных результатах, как правило, было менее пяти локализаций на кадр. Мощность возбуждающего лазера должна быть достаточно низкой, чтобы свести к минимуму быстрое фотообесцвечивание, но достаточно высокой, чтобы точно локализовать отдельные молекулы. Параметры локализации и трекинга одной молекулы должны быть скорректированы в зависимости от плотности возбуждений и ожидаемой динамики диффузии интересующего белка. Наконец, значения должны figure-discussion-1 быть вычислены в диапазоне tmin (начиная с 0 с и увеличиваясь с шагом времени экспозиции). Значения должны figure-discussion-2 сходиться выше некоторого порога tmin; это tmin должно быть использовано на шаге 5.3.

Описанный здесь метод количественно определяет динамику взаимодействия белков в конденсатах с точностью, недоступной для обычных методов. Кроме того, он может делать это в живых клетках с минимальным возмущением образца. Это имеет решающее значение, поскольку поведение взаимодействия РДЭ, включая образование конденсата, в значительной степени зависит от их локальной среды40.

Репрезентативные результаты Irgen-Gioro et al.40 демонстрируют способность этого метода извлекать время пребывания белков, связывающихся с их самоорганизующимися конденсатами LLPS. Важно отметить, что этот метод может быть легко расширен на связывание любого белка с любым типом конденсатов посредством гомотипных или гетеротипических взаимодействий. Более того, она не ограничивается измерением динамики взаимодействия белков, подвергающихся ТЛП. Было показано, что слияние онкопротеина EWS::FLI1, который, как известно, вызывает саркому Юинга, образует локальные, высококонцентрированные концентраторы, которые играют важную роль в его транскрипционной активации и функциях онкогенной трансформации 1,2. Несмотря на то, что формирование этих концентраторов обусловлено переходными, селективными и полновалентными IDR-IDR взаимодействиями EWS::FLI1, до сих пор нет убедительных доказательств того, что они являются добросовестными конденсатами LLPS 1,2. Тем не менее, мы использовали представленный здесь метод для измерения среднего времени пребывания EWS::FLI1 в его узлах и показали, что мутация специфических остатков и делеция его IDR значительно дестабилизируют связывание EWS::FLI1 с его концентраторами1.

Несмотря на универсальность этого метода в характеристике динамики связывания белков в конденсатах, следует проявлять осторожность при выборе модели связывания белков в конкретных условиях. Существующие биохимические данные подтверждают идею о том, что двухкомпонентное экспоненциальное распределение часто является подходящей моделью для многих систем 1,37,40,42, но также было показано, что то же самое распределение является неподходящим представлением связывания с белками в других системах, где альтернативные модели, такие как трехкомпонентное экспоненциальное 47,48,49 и степенное распределение 50 лучше соответствуют экспериментальным наблюдениям. Чтобы не делать неточных выводов, следует тщательно выбирать и мотивировать модель, проверять, поддерживает ли качество подгонки использование модели, и разумно интерпретировать результаты.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана стипендией Национального научного фонда в рамках гранта No. DGE-1745301 (S.Y.), Премия Pew-Stewart Scholar Award (Южная Каролина), Премия Searle Scholar Award (Южная Каролина), Исследовательский грант Фонда Шерла и Кей Курчи (Южная Каролина), Грант Merkin Innovation Seed Grant (Южная Каролина), Исследовательский грант Маллинкродта (Южная Каролина) и Маргарет Э. Грант Фонда ранних медицинских исследований 2024 года (Южная Каролина). S.C. также поддерживается NIH/NCI под номером P30CA016042.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,1 & микро; m TetraSpeck микросфераInvitrogenT7279Одномолекулярная визуализация
25 мм Диаметр, #1.5 Покровные стеклаMarienfeld Superior111650Подготовка покровных колпачков
593/40 нм Полосовой фильтрSemrockFF01-593/40-25Одномолекулярная визуализация
676/37 нм Полосовой фильтрSemrockFF01-676/37-25Одномолекулярная визуализация
6-Well TC PlateGenesee25-105MPПодготовка клеток к микроскопии
Клеточная линия: U-2 OSATCCHTB-96Мечение белков в клетках
ConvertASCII_SlowTracking_css3
.m		Анализ данных визуализации одиночных молекул: Доступно в Chong et al., 2018
Штатив для окрашивания покровного стеклаThomas24957Подготовка покровных стекол
Deuterated Janelia Fluor 549 (JFX549)Janelia Research CampusПодготовка клеток к микроскопии
DMEM, Low GlucoseGibco10-567-022Мечение белков в клетках: Используемые питательные среды: DMEM с 5% фетальной бычьей сывороткой, 1% пенстрепом
Eclipse Ti2-E Инвертированный микроскопNikonОдномолекулярная визуализация
этанола 200 ProofLab AlleyEAP200-1GALПодготовка покровных стекол
evalSPTАнализ данных визуализации одиночных молекул: Доступно в Drosopoulos et al., 2020
Фетальная бычья сывороткаCytivaSH30396.03Мечение белков в клетках: Используемые питательные среды: DMEM с 5% фетальной бычьей сывороткой, 1% пенстреком
ФиджиАнализ данных визуализации одиночных молекул
Ikon Ultra CCD CameraAndorX-13723Одномолекулярная визуализация
Longpass dichroic beamsplitterSemrockDi02-R635-25x36Визуализация одиночных молекул: Красный/дальний красный светоделитель
LUN-F Laser UnitNikonОдномолекулярная визуализация: 405/488/561/640
MatTek чашка со стеклянным дномMatTekP35G-1.5-20-CПодготовка клеток к микроскопии: 35 мм, чашка #1.5 для клеточной культуры.
NIS-ElementsNikonВизуализация одиночных молекул: программное обеспечение для сбора данных микроскопа
ядра и кластера mask_v2.txtАнализ данных визуализации одиночных молекул: Доступно в Chong et al., 2018
Пенициллин-стрептомицинGibco15-140-122Мечение белков в клетках: Используемые питательные среды: DMEM с 5% фетальной бычьей сыворотки, 1% пенстреп
Фосфат буферизованный физиологический растворThermo Fisher Scientific18912014Мечение белков в клетках
Фотоактивируемый Janelia Fluor 646 (PA-JF646)Janelia Research CampusПодготовка клеток к микроскопии
PLOT_ResidenceHist_css.mАнализ данных визуализации одиночных молекул: Доступно в Chong et al., 2018
Гидроксид калияMallinckrodt Chemicals6984-06Получение Покровные листы
pretracking_comb.txtАнализ данных визуализации отдельных молекул: Доступно в Chong et al., 2018
SLIMfastАнализ данных визуализации одиночных молекул: Доступно в Teves et al., 2016
Инкубационная система Stage-topTokai HitВизуализация одиночных молекул: Для визуализации живых клеток
TwinCam Dual emission image splitterCairn ResearchУльтразвуковой
очистительBranson5800Подготовка покровных стекол
для визуализации с одной молекулой

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chong, S., et al. Imaging dynamic and selective low-complexity domain interactions that control gene transcription. Science. 361 (6400), (2018).
  2. Chong, S., Graham, T. G. W., Dugast-Darzacq, C., Dailey, G. M., Darzacq, X., Tjian, R. Tuning levels of low-complexity domain interactions to modulate endogenous oncogenic transcription. Molecular Cell. 82 (11), 2084-2097 (2022).
  3. Boehning, M., et al. RNA polymerase II clustering through carboxy-terminal domain phase separation. Nature Structural & Molecular Biology. 25 (9), 833-840 (2018).
  4. Sabari, B. R., et al. Coactivator condensation at super-enhancers links phase separation and gene control. Science. 361 (6400), New York, N.Y. (2018).
  5. Boija, A., et al. Transcription factors activate genes through the phase-separation capacity of their activation domains. Cell. 175 (7), 1842-1855 (2018).
  6. Levone, B. R., et al. FUS-dependent liquid-liquid phase separation is important for DNA repair initiation. Journal of Cell Biology. 220 (5), e202008030(2021).
  7. Kilic, S., et al. Phase separation of 53BP1 determines liquid-like behavior of DNA repair compartments. The EMBO Journal. 38 (16), e101379(2019).
  8. Pessina, F., et al. Functional transcription promoters at DNA double-strand breaks mediate RNA-driven phase separation of damage-response factors. Nature Cell Biology. 21 (10), 1286-1299 (2019).
  9. Nozaki, T., et al. Condensed but liquid-like domain organization of active chromatin regions in living human cells. Science Advances. 9 (14), (2023).
  10. Maeshima, K., et al. Nucleosomal arrays self-assemble into supramolecular globular structures lacking 30-nm fibers. The EMBO Journal. 35 (10), 1115-1132 (2016).
  11. Strickfaden, H., Tolsma, T. O., Sharma, A., Underhill, D. A., Hansen, J. C., Hendzel, M. J. Condensed chromatin behaves like a solid on the mesoscale in vitro and in living cells. Cell. 183 (7), 1772-1784 (2020).
  12. Gibson, B. A., et al. Organization of chromatin by intrinsic and regulated phase separation. Cell. 179 (2), 470-484 (2019).
  13. Cerase, A., Armaos, A., Neumayer, C., Avner, P., Guttman, M., Tartaglia, G. G. Phase separation drives X-chromosome inactivation: a hypothesis. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (5), 331-334 (2019).
  14. Jachowicz, J. W., Strehle, M., Banerjee, A. K., Blanco, M. R., Thai, J., Guttman, M. Xist spatially amplifies SHARP/SPEN recruitment to balance chromosome-wide silencing and specificity to the X chromosome. Nature Structural & Molecular Biology. 29 (3), 239-249 (2022).
  15. Pandya-Jones, A., et al. A protein assembly mediates Xist localization and gene silencing. Nature. 587 (7832), 145-151 (2020).
  16. Du, M., Chen, Z. J. DNA-induced liquid phase condensation of cGAS activates innate immune signaling. Science. 361 (6403), 704-709 (2018).
  17. Zamudio, A. V., et al. Mediator condensates localize signaling factors to key cell identity genes. Molecular Cell. 76 (5), 753-766 (2019).
  18. Zhang, J. Z., et al. Phase separation of a PKA regulatory subunit controls cAMP compartmentation and oncogenic signaling. Cell. 182 (6), 1531-1544 (2020).
  19. Kovar, H. Dr. Jekyll and Mr. Hyde: The two faces of the FUS/EWS/TAF15 protein family. Sarcoma. 2011, e837474(2010).
  20. Linardic, C. M. PAX3-FOXO1 fusion gene in rhabdomyosarcoma. Cancer Letters. 270 (1), 10-18 (2008).
  21. Ahn, J. H., et al. Phase separation drives aberrant chromatin looping and cancer development. Nature. 595 (7868), 591-595 (2021).
  22. Wegmann, S., et al. Tau protein liquid-liquid phase separation can initiate tau aggregation. The EMBO Journal. 37 (7), e98049(2018).
  23. Friedman, M. J., et al. Polyglutamine domain modulates the TBP-TFIIB interaction: implications for its normal function and neurodegeneration. Nature Neuroscience. 10 (12), 1519-1528 (2007).
  24. Molliex, A., et al. Phase separation by low complexity domains promotes stress granule assembly and drives pathological fibrillization. Cell. 163 (1), 123-133 (2015).
  25. Murakami, T., et al. ALS/FTD mutation-induced phase transition of FUS liquid Droplets and reversible hydrogels into irreversible hydrogels impairs RNP granule function. Neuron. 88 (4), 678-690 (2015).
  26. Patel, A., et al. A liquid-to-solid phase transition of the ALS protein FUS accelerated by disease mutation. Cell. 162 (5), 1066-1077 (2015).
  27. Shin, Y., Brangwynne, C. P. Liquid phase condensation in cell physiology and disease. Science. 357 (6357), (2017).
  28. Kato, M., McKnight, S. L. A solid-state conceptualization of information transfer from gene to message to protein. Annual Review of Biochemistry. 87, 351-390 (2018).
  29. Li, P., et al. Phase transitions in the assembly of multivalent signalling proteins. Nature. 483 (7389), 336-340 (2012).
  30. Muzzopappa, F., et al. Detecting and quantifying liquid-liquid phase separation in living cells by model-free calibrated half-bleaching. Nature Communications. 13 (1), 7787(2022).
  31. Sprague, B. L., Müller, F., Pego, R. L., Bungay, P. M., Stavreva, D. A., McNally, J. G. Analysis of binding at a single spatially localized cluster of binding sites by fluorescence recovery after photobleaching. Biophysical Journal. 91 (4), 1169-1191 (2006).
  32. Taylor, N. O., Wei, M. -T., Stone, H. A., Brangwynne, C. P. Quantifying dynamics in phase-separated condensates using fluorescence recovery after photobleaching. Biophysical Journal. 117 (7), 1285-1300 (2019).
  33. Liu, Z., Lavis, L. D., Betzig, E. Imaging live-cell dynamics and structure at the single-molecule level. Molecular Cell. 58 (4), 644-659 (2015).
  34. Los, G. V., et al. HaloTag: A novel protein labeling technology for cell imaging and protein analysis. ACS Chemical Biology. 3 (6), 373-382 (2008).
  35. Grimm, J. B., et al. A general method to improve fluorophores using deuterated auxochromes. JACS Au. 1 (5), 690-696 (2021).
  36. Grimm, J. B., et al. photoactivatable fluorophores for single-molecule imaging. Nature Methods. 13 (12), 985-988 (2016).
  37. Hansen, A. S., Pustova, I., Cattoglio, C., Tjian, R., Darzacq, X. CTCF and cohesin regulate chromatin loop stability with distinct dynamics. eLife. 6, 25776(2017).
  38. Sergé, A., Bertaux, N., Rigneault, H., Marguet, D. Dynamic multiple-target tracing to probe spatiotemporal cartography of cell membranes. Nature Methods. 5 (8), 687-694 (2008).
  39. Normanno, D., et al. Probing the target search of DNA-binding proteins in mammalian cells using TetR as model searcher. Nature Communications. 6 (1), 7357(2015).
  40. Irgen-Gioro, S., Yoshida, S., Walling, V., Chong, S. Fixation can change the appearance of phase separation in living cells. eLife. 11, e79903(2022).
  41. Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells. Nature Methods. 5 (2), 159-161 (2008).
  42. Teves, S. S., An, L., Hansen, A. S., Xie, L., Darzacq, X., Tjian, R. A dynamic mode of mitotic bookmarking by transcription factors. eLife. 5, e22280(2016).
  43. Drosopoulos, W. C., Vierra, D. A., Kenworthy, C. A., Coleman, R. A., Schildkraut, C. L. Dynamic assembly and disassembly of the human DNA polymerase δ holoenzyme on the genome In vivo. Cell Reports. 30 (5), 1329(2020).
  44. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), New York, N.Y. 819-823 (2013).
  45. Yoshida, S. R., Maity, B. K., Chong, S. Visualizing protein localizations in fixed cells: Caveats and the underlying mechanisms. The Journal of Physical Chemistry B. 127 (19), 4165-4173 (2023).
  46. Gautier, A., et al. An engineered protein tag for multiprotein labeling in living cells. Chemistry & Biology. 15 (2), 128-136 (2008).
  47. Hipp, L., et al. Single-molecule imaging of the transcription factor SRF reveals prolonged chromatin-binding kinetics upon cell stimulation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (3), 880-889 (2019).
  48. Agarwal, H., Reisser, M., Wortmann, C., Gebhardt, J. C. M. Direct observation of cell-cycle-dependent interactions between CTCF and chromatin. Biophysical Journal. 112 (10), 2051-2055 (2017).
  49. Chen, L., Zhang, Z., Han, Q., Maity, B. K., Rodrigues, L., Zboril, E., Adhikari, R., Ko, S. H., Li, X., Yoshida, S. R., Xue, P., Smith, E., Xu, K., Wang, Q., Huang, T. H., Chong, S., Liu, Z. Hormone-induced enhancer assembly requires an optimal level of hormone receptor multivalent interactions. Molecular cell. 83 (19), 3438-3456 (2023).
  50. Garcia, D. A., et al. Power-law behavior of transcription factor dynamics at the single-molecule level implies a continuum affinity model. Nucleic Acids Research. 49 (12), 6605-6620 (2021).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Halo

Похожие статьи