Aplysia californica нейроны развиваются крупные конусы роста в культуре, отлично подходит для изображений с высоким разрешением роста подвижности конуса и руководство. Здесь мы приводим протокол вскрытия и покрытия нейронов Aplysia сумку клеток, а также для настройки камеры для живого изображения клетки.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Нейронные клеточные культуры из Aplysia для изображений с высоким разрешением роста конусов
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Нейронные конусы роста очень подвижные структуры на кончике аксоны, которые могут обнаружить руководством сигналы в окружающей среде и преобразовывать эту информацию в направленное движение к соответствующей клетки-мишени. Чтобы полностью понять, как руководство информация передается от поверхности клетки к основным динамическим цитоскелета сетей, нужно модель системы, пригодной для живого изображения ячейки динамики белков на высоких временным и пространственным разрешением. Типичные позвоночных конусы роста слишком малы, чтобы количественно проанализировать F-актина и микротрубочек динамику. Нейроны из морской заяц Aplysia californica в 5-10 раз больше, чем нейронов позвоночных, может быть легко хранить при комнатной температуре и очень надежный клеток для микроманипуляция и биофизических измерений. Их конусы роста очень определенных цитоплазматических регионах и хорошо описаны цитоскелета системы. Тела нейронов может быть microinjected с различными зондами для изучения роста подвижности конуса и руководство. В настоящее время протокол мы продемонстрируем процедуру вскрытия брюшной ганглий, культуре нейронов сумку клеток и создания изображений камера для живого изображения ячейки роста конусов.
Протокол
Решения
- L15-ASW культуре клеток среды (1л)
- 1 мешок L15 порошок
- добавить 800 мл H 2 O сверхчистых
- 400 мМ NaCl
- MgSO 4 27 ммоль
- MgCl 2 28 мМ
- L-глютамин 4 мМ
- Гентамицин 50 мкг / мл
- HEPES 5 мМ
- Отрегулируйте до рН 7,9
- Добавить по капле CaCl 2 9,3 мм (остановиться, если осадков)
- Добавить H 2 O сверхчистой до 1 л
- Проверьте осмолярность (950-1000 ммоль / кг) с осмометре (давление пара, Wescor # 5520)
- Фильтр 0,22 мкм использованием положительного единица давления фильтрации (фильтры: M....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Aplysia нейронов сумку ячейки обеспечивают бессывороточной нейронной системе культуры клеток с очень немногими без нервных клеток. Эти нейроны образуют очень большого роста конусов подходящий для решения ряда важных биологических ячейки вопросы. Нейронов сумка клетка может легко манипулировать и отображаемого при комнатной температуре в течение нескольких часов. С помощью флуоресцентной микроскопии Спекл (ФШМ), можно количественно анализировать различные параметры F-актин и полимеризации микротрубочек и транслокации динамики. Эти инструмент.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Благодарности
Мы хотели бы поблагодарить Райан Maneri (кулик-сорока Productions, LLC) для съемок нашего процедуры и Родни Макфейл (Отделение биологических наук, Purdue University) за помощь в редактировании видео вскрытия. Исследования в Suter лаборатории поддержана грантами NIH (R01 NS049233) и Bindley Bioscience центр в Университете Пердью в СУД
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии | |
|---|---|---|---|---|
| Стеклянные покровные стекла №1 22x22 mm | Инструмент | VWR international | 48366067 | |
| Стеклянные покровные стекла №1.5 22x22 mm | Инструмент | Corning | 2870-22 | |
| Чашки Петри 35 mm | Инструмент | Falcon BD | 353001 | |
| Фильтры для фильтрации среды | Инструмент | EMD Millipore | SVGV010RS | |
| Высоковакуумная смазка | Инструмент | Dow Corning | 1597418 | |
| Осмометр | Инструмент | Wescor | 5520 | |
| Пластиковые прокладки (шимсы) | Инструмент | Small Parts, Inc. | SHSP-200 | |
| Хлорид кальция | Реагент | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Гентамицин | Реагент | Invitrogen | 15750-060 | |
| HEPES | Реагент | Sigma-Aldrich | H4030 | |
| Среда L15 | Реагент | Invitrogen | 41300-039 | |
| L-глутамин | Реагент | Sigma-Aldrich | G8540 | |
| Хлорид магния | Реагент | Mallinckrodt Baker Inc. | 5958-04 | |
| Сульфат магния | Реагент | Mallinckrodt Baker Inc. | 6070-12 | |
| Поли-L-лизин (70-150 kD) | Реагент | Sigma-Aldrich | P6282 | |
| Хлорид натрия | Реагент | Mallinckrodt Baker Inc. | 7581 | |
| Нейтральная протеаза (Диспаза) | Реагент | Worthington Biochemical | LS02111 |
Ссылки
- Forscher, P., Kaczmarek, L. K., Buchanan, J. A., Stephen, S. J. Cyclic AMP induces changes in distribution and transport of organelles within growth cones of Aplysia bag cell neurons. J. Neurosci. 7, 3600-3611 (1987).
- Suter, D. M., Errante, L. D., Belotserkovsky, V., Forscher, P.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
