Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Лабораторная и полевая культура личинок башмачка Crepidula fornicata

1.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/66208

⸱

5 января 2024 г.

1Department of Biology, Dickinson College

В этой статье

Краткое содержание

В статье представлены методы культивирования личинок брюхоногих моллюсков Crepidula fornicata в малообъемной лабораторной системе и в системе мезокосма окружающей среды и морской воды, которые могут быть развернуты в полевых условиях.

Аннотация

Брюхоногий моллюск Crepidula fornicata широко используется для изучения биологии, физиологии и экологии развития личинок. Выводковые личинки велигера этого вида собирали путем сифона на сито после естественного выпуска взрослыми особями, распределяли по культуре в плотности 200/л и скармливали Isochrysis galbana (штамм T-ISO) в концентрации 1 x 105 клеток/мл. Рост скорлупы и приобретение способности к метаморфозу были задокументированы у личинок братьев и сестер, выращенных в вентилируемых культурах объемом 800 мл, предназначенных для уравновешивания с окружающим воздухом или определенными атмосферными газовыми смесями. В отличие от этих лабораторных условий культивирования; Данные о росте и компетентности также были собраны для личинок, выращенных в проточном мезокосме морской воды объемом 15 л, расположенном в полевой популяции репродуктивных взрослых особей. Темпы роста и сроки метаморфической компетентности в лабораторных культурах были аналогичны тем, о которых сообщалось в ранее опубликованных исследованиях. Личинки, выращенные в полевых условиях, росли гораздо быстрее и метаморфизировались раньше, чем сообщалось о каких-либо лабораторных исследованиях. В совокупности эти методы подходят для изучения развития личинок в заранее определенных контролируемых условиях в лаборатории, а также в естественных условиях в полевых условиях.

Введение

Тапочка, Crepidula fornicata (Gastropoda: Calyptraeidae), широко представлена в современной и исторической исследовательской литературе из-за ее полезности в качестве модели развития и из-за ее широкого воздействия в качестве инвазивного вида. Она послужила основополагающим примером спирального развития в классическую эпоху экспериментальной эмбриологии1 и пережила возрождение интереса с применением современных инструментов визуализации и геномики для анализа механизмов раннего развития лофотрохозоидов 2,3. С другой стороны, другие исследования были сосредоточены на воздействии взрослых популяций этого экосистемного инженера в умеренной прибрежной морской среде, удаленной от его первоначального распространения в восточной частиСеверной Америки. В промежутке между эмбрионом и взрослой особью, личинки велигера этого вида были предметом многочисленных исследований развития личинок и экологии, особенно факторов, влияющих на рост и приобретение способности к метаморфозу, внутренних и внешних сигналов, опосредующих заселение личинок, и влияния личиночного опыта на производительность молоди 6,7,8,9,10,11 . Недавние исследования выявили устойчивость личинок и молоди C. fornicata к закислению океана, что является еще одним направлением продуктивного использования этого животного в научных исследованиях 12,13,14,15,16.

Преимущество C. fornicata для изучения биологии морских личинок заключается в том, что его относительно легко выращивать в лаборатории в естественной или искусственной морской воде на одножгутиковой диете жгутиконосца Isochrysis galbana. Методы культивирования были подробно описаны автором в более ранней печатной публикации, ориентированной наметоды17. Причины такого взноса двояки. Во-первых, рутинные физические маневры, связанные с созданием культур и заботой о них, концептуально очень просты, но их трудно правильно выполнить без практической или видеодемонстрации. Во-вторых, описаны два варианта ранее описанных методов культивирования, которые особенно подходят для лабораторных и полевых исследований реакций на стрессоры окружающей среды, такие как закисление океана, эвтрофикация и истощение кислорода. Первая из них представляет собой малообъемную (800 мл) культуральную систему, подходящую для манипулирования pH и растворенным кислородом в морской воде с помощью небольших объемов пузырьковых газов, а вторая представляет собой мезокосмическую систему большего объема (15 л), которая может быть размещена в полевых условиях и обеспечивает свободный обмен окружающей морской водой.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Рутинные маневры по созданию и поддержанию личиночных культур C. fornicata

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод начинается с галлона (3,8 л) банки морской воды, содержащей взрослых особей C. fornicata , которые только что выпустили выведенных личинок велигера. Взрослые особи могут быть собраны в полевых условиях или получены от поставщика, указанного в Таблице материалов. Взрослые особи — это протандровые гермафродиты, которые живут в брачных стаях с сидячими самками на дне стаи. Не разбивайте стопки для взрослых. Сезонность воспроизводства и методы подготовки взрослых особей к нересту вне сезона были описаны ранее17. Личинки лучше всего собирать в течение 2-3 часов после выпуска, когда они сильно геонегативны и будут концентрироваться у поверхности банки.

  1. Сделайте сито, отрезав дно от трехугольного одноразового пластикового стакана объемом 400 мл и приклеив панель из нейлоновой сетки 236 мкм. Для этой цели и особенно для строительства мезокосма (ниже) используйте клей-расплав, разработанный для хорошей адгезии к полиэтилену.
  2. Снимите аэрацию со взрослой банки и дайте ей постоять 15-20 минут, чтобы мусор остыл и личинки смогли легко выплыть на поверхность.
  3. Откачайте личинок через короткую (15-20 см) стеклянную трубку диаметром 5 мм, прикрепленную к концу мягкой пластиковой трубки для аквариума длиной 60-80 см, в сито, приготовленное выше, подвешенное в стеклянном стакане объемом 600 мл таким образом, чтобы избыток морской воды переполнял стеклянный стакан, в то время как личинки задерживались на сите. Держите дно сита под водой и избегайте выбрасывания личинок на берег.
  4. Ненадолго выньте сито из стакана и используйте бутылку с фильтрованной морской водой (FSW), чтобы промыть личинки в стеклянную миску с FSW, которая имеет удобный размер для манипуляций под маломощным препарирующим микроскопом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Личинки C. fornicata процветают в фильтрованной природной морской воде с соленостью около 30 ppt или искусственной морской воде Instant Ocean, полученной до 32 ppt, при 20-25 °C17,18. Фильтрация на уровне < 1 мкм достаточна для устранения обрастающих эпизоотических протистов, которые могут вызывать проблемы в лабораторных культурах.
  5. Вручную перенесите и подсчитайте нужное количество личинок в банку для культивирования с помощью пипетки Пастера. Для достижения наилучших результатов используйте 1 личинку/5 мл объема культуры для C. fornicata. Посчитайте личинки и избегайте соблазна оценить численность.
  6. Кормите личинок нужным рационом микроводорослей при начале культивирования и через день заменяйте микроводоросли при подмене воды для культивирования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Диета из 1 x 105 клеток/мл Isochrysis galbana (штамм T-ISO) является хорошей стандартной диетой, которая обеспечивает почти максимальные лабораторные темпы роста. Рацион питания и методы культивирования T-ISO приведены в одной из предыдущих публикаций17.
  7. Меняйте воду для культуры через день, высыпая содержимое культуры в сито внутри стакана, как в шаге 1.3 выше. Поднимите сито и используйте флакон с распылением FSW, чтобы промыть личинки в банке для культивирования свежего FSW с новым кормом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Наилучшей практикой является разделение любой стеклянной посуды, используемой для выращивания личинок, и избегание любого контакта этой стеклянной посуды с фиксаторами, растворимыми солями тяжелых металлов или моющими средствами. Обычную чистку лучше всего проводить с помощью пасты из пищевой соды (NaHCO3) и нейлоновой губки для чистки, в то время как минеральные отложения можно удалить с помощью умеренной кислотной стирки в белом уксусе или разбавленного HCl.

2. Строительство вентилируемых культур для личинок C. fornicata

ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуемая стеклянная банка (Таблица материалов) имеет полипропиленовую крышку, которая инертна к морской воде и имеет подходящую толщину для крепления входных отверстий трубки для потока вентиляционного газа.

  1. Просверлите два отверстия по 5 мм в крышке каждой банки для культуры (включая внутренний вкладыш крышки), каждое примерно в 1,5 см от края и напротив друг друга. (Сверло 13/64 дюйма дюймового дюйма или сверло стандарта ASME #7 ASME также сделает соответствующее отверстие с зазором).
  2. Установите адаптер нейлоновой трубки с резьбой 1/8 дюйма x 10-32 в каждое отверстие с помощью нейлоновой гайки 10-32 с заусенцем трубки на внешней поверхности крышки.
  3. Нанесите каплю силиконового резинового герметика для аквариума на отверстие резьбовой внутренней части одного из адаптеров трубки и протолкните полиэтиленовую трубку длиной 20 см длиной 20 мм (внешний диаметр) через отверстие изнутри так, чтобы она выступала на несколько мм за внешнее отверстие заусенца трубки.
  4. Теперь трубка будет иметь небольшую пробку из аквариумного герметика на конце, которая выступает через заусеницу трубки, но прозрачная трубка будет видна сразу за концом заусенца. Дайте герметику застыть, затем обрежьте выступающий конец полиэтиленовой трубки так, чтобы он был заподлицо с концом заусенца трубки.
  5. Заполните банку для культур FSW на расстоянии не менее 1 см от плеча в верхней части банки, закрутите крышку и прикрепите подачу вентиляционного воздуха или экспериментальной газовой смеси к штуцеру трубки, на котором находится полиэтиленовая вентиляционная трубка. Обрежьте длину вентиляционной трубки так, чтобы ее конец лежал аккуратно на дне банки.
  6. Отрегулируйте поток вентиляционного воздуха или газовой смеси, чтобы получить медленный поток пузырьков (Рисунок 1). Используйте аквариумный воздушный насос с общими для аквариума клапанами для подачи вентиляции окружающим воздухом или используйте регуляторы массового расхода для других экспериментальных атмосферных газовых смесей14.

3. Создание пригодной для развертывания в полевых условиях мезокосмической культуры для личинок C. fornicata

  1. Вырежьте 4 равномерно расположенных прямоугольных отверстия, каждое размером 25 см x 14,5 см, по бокам стандартного 7-галлонного полиэтиленового ведра. Расположите дно каждого отверстия примерно в 3,5 см от внутреннего дна ведра (рисунок 2A). Для этой цели идеально подходит ручная электрическая сабельная пила с мелкозубчатым лезвием. Сохраните вырезанные отходы и нарежьте их вдоль на полоски шириной 2 см с помощью настольной пилы.
  2. Вырежьте 4 панели из нейлоновой сетки 236 мкм, каждая размером не менее 30 см х 20 см, чтобы удобно перекрывать (не менее чем на 2 см) вырезные отверстия в ведре. Временно закрепите один край сетчатой панели над длинным краем ее выреза с помощью небольших пружинных зажимов или прищепок.
  3. Край сетчатой панели приклейте к отверстию ведра термоплавким клеем, который предназначен для полиэтилена. После того, как первый край будет закреплен, приклейте другие края, сохраняя натяжение, чтобы получить тугую поверхность на сетчатой панели.
  4. Обрежьте длину полос отходов ведра из шага 3.1, чтобы сделать армирующие полосы, чтобы аккуратно покрыть склеенный участок, где сетчатые панели перекрывают отверстия ведра. Прижмите каждую покрывающую полосу к месту с обильным количеством клея-расплава, быстро работая над тем, чтобы каждая полоса была на месте, прежде чем клей затвердеет.
  5. Закрепите конец каждой полосы с помощью нейлоновой заклепки, установленной с внешней стороны ведра. Обрежьте излишки клея и сетки с внешних краев усиливающих полос с помощью канцелярского бритвенного ножа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждой заклепки требуется направляющее отверстие 15/64 дюйма. Внутренние (глухие) части заклепок видны на внутренней стороне готового мезокосма на рисунке 2В.
  6. Разверните мезокосм в плавающей стойке, которая удерживает верхнюю часть ведра над водой (рисунок 2C). Плавающая стойка, которая показана, изготовлена из 30-сантиметровых сегментов 2-дюймовой трубы из ПВХ Schedule 40, сцементированных вместе с коленами и тройниками для создания герметичной конструкции, которая может удерживать ряд из 4 повторяющихся мезокосмов.
  7. В зависимости от местных условий, сетчатые панели могут загрязниться в течение 1-2 дней, что затруднит обмен морской воды через мезокосм. В той мере, в какой это происходит, перенесите личинки в свежий чистый мезокосм, вытащив загрязненный мезокосм на 2/3 из воды и многократно вычерпывая его со дна в свежий мезокосм с помощью кувшина объемом 2 л.
  8. Выполните 20-25 итераций для переноса большей части личинок, или до тех пор, пока личинки не перестанут наблюдаться в загрязненном мезокосме. Очистите загрязненные мезокосмы, аккуратно почистив сетчатые панели мягкой губкой, загруженной пастой из пищевой соды (NaHCO3) и промойте водопроводной водой.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Рост личинок и приобретение способности к метаморфозу измеряли в 4 одновременных репликациях культур объемом 800 мл, каждая из которых содержала 160 личинок, полученных из родственной партии личинок, которые вылупились из одной яичной массы и которых кормили Isochrysis galbana с плотностью 1 x 105 клеток/мл. pH составлял 7,9-8,0, температура 20-21 °C, соленость 30-31 ppt. Рост и метаморфоз также были определены с другой родственной партией личинок в одном испытании 15-литрового мезокосма, содержащего ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Несмотря на то, что личинки C. fornicata относительно легко поддаются культивированию по сравнению с другими планктотрофными морскими личинками, внимание к основам надлежащей практики культивирования по-прежнему имеет важное значение17,19. Здоровые личинки должны начать питаться сразу после вылупления. Это легко проверить на следующий день после вылупления, наблюдая за их полным кишечником, наполненным клетками водорослей, с помощью препарирующего микрос...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Нет никаких конфликтов интересов, о которых можно было бы сообщить.

Благодарности

Первоначальная разработка системы вентиляции в небольших объемах была частично поддержана Национальным научным фондом (CRI-OA-1416690 для Колледжа Дикинсона). Д-р Лорен Муллино любезно предоставила лабораторные помещения в Океанографическом институте Вудс-Хоул, где были собраны данные, представленные для этой системы (рис. 4).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Ведро, полиэтилен, 7 галлоновUS Пластик16916для мезокосма
<эм>Crepidula fornicataМорская биологическая лаборатория, Центр морских ресурсов760маточное маточное стадо
для взрослых Клей-расплав, Infinity Supertac 500Hotmelt.comINFINITY IM-SUPERTAC-500-12-1LBподходит для склеивания полиэтиленовой
банки Банка, стекло, 32 унции, с полипропиленовой крышкойUlineS-19316P-Wдля вентилируемых культур 800 мл
Nitex mesh, 236 &; mDynamic Aqua Supply Ltd.NTX236-136для мезокосма
Гайка, шестигранник, нейлон, 10-32 нитиHome Depot1004554441для крепления заусениц трубок
Заклепки, нейлоновые, глухие, диаметр 15/64", диапазон захвата 5/32"-5/16", упаковка из 8автозапчастей NAPABK 66528444 упаковки необходимы на мезокосм
Трубка заусеница 1/8" x 10-32 резьбаUS Пластик655932 потребности на банку
для культурыТрубка, полиэтилен, 2,08 мм ODFisherScientific 14-170-11Gдля вентиляции газового потока внутри банки для культуры
Трубка, Tygon, 1/8"x3/16"x1/32"US Plastic57810подходит для заусенцев для вентиляции культур

Ссылки

  1. Conklin, E. G. The embryology of Crepidula: a contribution to the cell lineage and early development of some marine gastropods. Gasteropods. , (1897).
  2. Henry, J. J., Collin, R., Perry, K. J. The slipper snail, Crepidula: an emerging lophotrochozoan model system. Biol Bull. 218 (3), 211-229 (2010).
  3. Lyons, D. C., Henry, J. Q. Slipper snail tales: how Crepidula fornicata and Crepidula atrasolea became model molluscs. Curr Top Dev Biol. 147, 375-399 (2022).
  4. Blanchard, M. Spread of the slipper limpet Crepidula fornicata (L. 1758) in Europe. Current state and consequences. ScientiaMarina. 61 (Suppl 2), 109-118 (1997).
  5. Beninger, P., Valdizan, A., Decottigies, P., Cognie, B. Field reproductive dynamics of the invasive slipper limpet, Crepidula fornicata. J Exp Mar Biol Ecol. 390 (2), 179-187 (2010).
  6. Pechenik, J. A. The relationship between temperature, growth rate, and duration of planktonic life for larvae of the gastropod Crepidula fornicata (L.). J Exp Mar Biol Ecol. 74 (3), 241-257 (1984).
  7. Pechenik, J. A. Latent effects: surprising consequences of embryonic and larval experience on life after metamorphosis. Evol Ecol Marine Invertebrate Larvae. , 208-225 (2018).
  8. Pechenik, J. A., Gee, C. C. Onset of metamorphic competence in larvae of the gastropod Crepidula fornicata (L.), judged by a natural and an artificial cue. J Exp Mar Biol Ecol. 167 (1), 59-72 (1993).
  9. Taris, M., Comtet, T., Viard, F. Inhibitory function of nitric oxide on the onset of metamorphosis in competent larvae of Crepidula fornicata: A transcriptional perspective. Mar Genomics. 2 (3-4), 161-167 (2009).
  10. Penniman, J. R., Doll, M. K., Pires, A. Neural correlates of settlement in veliger larvae of the gastropod, Crepidula fornicata. Invertebrate Biol. 132 (1), 14-26 (2013).
  11. Meyer-Kaiser, K. S. Carryover effects of brooding conditions on larvae in the slipper limpet Crepidula fornicata. Mar Ecol Prog Ser. 643, 87-97 (2020).
  12. Noisette, F., et al. Does encapsulation protect embryos from the effects of ocean acidification? The example of Crepidula fornicata. PLoS One. 9 (3), e93021(2014).
  13. Kriefall, N. G., Pechenik, J. A., Pires, A., Davies, S. W. Resilience of Atlantic slippersnail Crepidula fornicata larvae in the face of severe coastal acidification. Front in Mar Sci. 5, 312(2018).
  14. Bogan, S. N., McMahon, J. B., Pechenik, J. A., Pires, A. Legacy of multiple stressors: Responses of gastropod larvae and juveniles to ocean acidification and nutrition. Biol Bull. 236 (3), 159-173 (2019).
  15. Pechenik, J. A., et al. Impact of ocean acidification on growth, onset of competence, and perception of cues for metamorphosis in larvae of the slippershell snail, Crepidula fornicata. Mar Biol. 166, 128(2019).
  16. Reyes, C. L., et al. The marine gastropod Crepidula fornicata remains resilient to ocean acidification across two life history stages. Front Physiol. 12, 702864(2021).
  17. Pires, A. Artificial seawater culture of the gastropod Crepidula fornicata for studies of larval settlement and metamorphosis. In: Carroll, D., Stricker, S. (eds) Developmental biology of the sea urchin and other marine invertebrates. Methods Mol Biol. 1128, 35-44 (2014).
  18. Bashevkin, S. M., Pechenik, J. A. The interactive influence of temperature and salinity on larval and juvenile growth in the gastropod Crepidula fornicata (L.). J Exp Mar Biol Ecol. 470, 78-91 (2015).
  19. Strathmann, M. F. Reproduction and Development of Marine Invertebrates of the Northern Pacific Coast: Data and Methods for the Study of Eggs, Embryos, and Larvae. , University of Washington Press. (1987).
  20. Clark, H. R., Gobler, C. J. Diurnal fluctuations in CO2 and dissolved oxygen concentrations do not provide a refuge from hypoxia and acidification for early-life-stage bivalves. Mar Ecol Prog Ser. 558, 43114(2016).
  21. Gobler, C. J., Baumann, H. Hypoxia and acidification in ocean ecosystems: coupled dynamics and effects on marine life. Biol Lett. 12 (5), 20150976(2016).
  22. Pechenik, J. A., Hilbish, T. J., Eyster, L. S., Marshall, D. Relationship between larval and juvenile growth rates in two marine gastropods, Crepidula plana and C. fornicata. Mar Biol. 125, 119-127 (1996).
  23. Padilla, D. K., McCann, M. J., McCarty Glenn, M., Hooks, A. P., Shumway, S. E. Effect of food on metamorphic competence in the model system Crepidula fornicata. Biol Bull. 227 (3), 242-251 (2014).
  24. Wallace, R. B., Baumann, H., Grear, J. S., Aller, R. C., Gobler, C. J. Coastal ocean acidification: the other eutrophication problem. Estuarine, Coast Shelf Sci. 148, 1-13 (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Личинки Crepidula fornicataкультура личиноклабораторный мезокосмразвитие личинокметаморфическая компетенциярост раковиныфильтрованная морская водакормление микроводорослямиполевой мезокосмоседание личинок
Лабораторная и полевая культура личинок башмачка Crepidula fornicata
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.