Методическая статья

Мониторинг уровня глюкозы в крови у потомства мышей после интрацитоплазматической инъекции сперматозоида

1.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/66212

⸱

17 мая 2024 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Shanghai-MOST Key Laboratory of Health and Disease Genomics, 2NHC Key Lab of Reproduction Regulation, 3Shanghai Institute for Biomedical and Pharmaceutical Technologies, 4International Peace Maternity and Child Health Hospital, 5School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University, 6Shanghai Key Laboratory of Embryo Original Diseases

В этой статье

Краткое содержание

В данной работе мы представляем протокол для создания мышиной модели интрацитоплазматической инъекции сперматозоида (ИКСИ) и переноса эмбрионов (ЭТ), что позволяет нам наблюдать возрастные изменения в метаболизме глюкозы, которые могут быть связаны с ИКСИ, что дает представление о его потенциальном долгосрочном влиянии на развитие человека.

Аннотация

Продолжительность человеческой жизни значительно длинна, в то время как мышиные модели могут моделировать всю продолжительность человеческой жизни за относительно короткий период, при этом один год жизни мыши примерно эквивалентен 40 человеческим годам. Интрацитоплазматическая инъекция сперматозоида (ИКСИ) является широко используемой вспомогательной репродуктивной технологией в клинической практике. Однако, учитывая его относительно недавнее появление около 30 лет назад, долгосрочное влияние этого метода на развитие человечества остается неясным. В этом исследовании мы разработали метод ИКСИ в сочетании с переносом эмбрионов (ЭТ) с использованием мышиной модели. Результаты показали, что нормальная сперматозоиды мышей после культивирования in vitro и последующего ИКСИ продемонстрировала уровень оплодотворения 89,57% и двухклеточный уровень 87,38%. После ET рождаемость потомства составляла примерно 42,50%. Кроме того, по мере старения мышей наблюдались колебания уровня метаболизма глюкозы, что может быть связано с применением техники ИКСИ. Эти результаты означают, что метод ИКСИ-ЭТ у мышей обеспечивает ценную платформу для оценки влияния аномалий сперматозоидов на развитие эмбриона и их долгосрочного воздействия на здоровье потомства, особенно в отношении метаболизма глюкозы. Это исследование дает важную информацию для дальнейших исследований потенциального влияния метода ИКСИ на развитие человека, подчеркивая необходимость глубокого изучения долгосрочных последствий этой технологии.

Введение

Вопросы рождаемости стали одним из основных вопросов медицины и социологии, особенно в современном обществе, где снижение коэффициента рождаемости и растущая серьезность распространенности и тяжести бесплодия приобрели видное значение. Вспомогательные репродуктивные технологии (ВРТ) предоставляют широкий спектр возможностей для решения этих проблем, при этом интрацитоплазматическая инъекция сперматозоида (ИКСИ) обычно используется в качестве терапевтического вмешательства.

С тех пор, как в 1992 году в Палермо была достигнута первая успешная беременность с помощью интрацитоплазматической инъекции сперматозоида (ИКСИ), ИКСИ стала ключевым методом вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ)1. Однако, учитывая, что ИКСИ используется в клинических условиях всего 30 лет, что является относительно коротким периодом по сравнению с продолжительностью человеческой жизни, долгосрочные эффекты ИКСИ, особенно на развитие потомства, не были широко исследованы и выяснены. В настоящее время мыши, характеризующиеся однородным генетическим фоном и более короткой продолжительностью жизни, стали широко используемой альтернативной моделью в медицинских исследованиях. Более того, мышиная модель может резюмировать всю продолжительность человеческой жизни в сжатых временных рамках, где один год у мышей примерно соответствует 40 годам у людей.

За последнее десятилетие в нескольких небольших исследованиях сообщалось, что люди, зачатые с помощью ИКСИ, могут подвергаться повышенному риску развития метаболических синдромов, таких как аномальный уровень сахара в крови, в более позднемвозрасте. Несмотря на то, что доказательства не являются окончательными, этот вывод, тем не менее, вызвал серьезную обеспокоенность в научном сообществе относительно долгосрочных последствий ИКСИ для здоровья. Эта ситуация подчеркивает настоятельную необходимость более тщательной оценки АРТ и ее долгосрочных последствий для здоровья. В частности, в свете ограничений и этических соображений исследований на людях, разработка животных моделей, которые могут точно повторить развитие человеческого потомства после ИКСИ, становится все более важной. В этом контексте мышиная модель ICSI-ET (Intracytoplasmic Sperm Injection-Embryo Transfer), благодаря своей способности имитировать ИКСИ человека и способствовать долгосрочному мониторингу результатов для здоровья потомства, стала эффективным инструментом для оценки потенциальных рисков для здоровья потомства от технологии ИКСИ5.

Данное исследование направлено на изучение влияния технологии ИКСИ-ЭТ на распространенный метаболический фенотип, а именно на метаболическое здоровье глюкозы у потомства, путем использования случайного мониторинга уровня глюкозы в крови, тестирования уровня глюкозы в крови натощак и тестов на толерантность к глюкозе для оценки метаболического состояния глюкозы у мышей. Случайный мониторинг уровня глюкозы в крови используется для фиксации естественных колебаний метаболизма глюкозы во время нормальной физиологической активности, в то время как тесты на уровень глюкозы в крови натощак и толерантность к глюкозе используются для оценки потенциальных преддиабетических состояний.

Протокол

Протокол ИКСИ-ЭТ, описанный ниже, соответствует руководящим принципам и был одобрен Этическим обзором животных Шанхайского института планирования семьи. Процедуры безопасности: Всегда надевайте соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ) при работе с химическими или биологическими материалами. Использование вытяжных шкафов: Выполняйте все процедуры, связанные с летучими химическими веществами или образованием аэрозоля, в сертифицированном вытяжном шкафу или шкафу биобезопасности. Для процедуры суперовуляции используйте самок мышей (6-8-недельный штамм B6D2F1).

1. ИКСИ у мышей

  1. Суперовуляция у мышей
    1. Введение внутрибрюшинной инъекции гонадотропина сыворотки крови беременной кобылы (PMSG) в дозе 7,5 МЕ на каждую мышь около 20:00 в первый день.
    2. Введите внутрибрюшинную инъекцию хорионического гонадотропина (ХГЧ) человека в дозе 7,5 МЕ на мышь около 20:00 (через 48 часов после инъекции ПМСГ) на третий день.
  2. Приготовьте среду HTF в 1 мл аликвот и оставьте их открытыми для ночного равновесия при 37 °C в инкубаторе с 5% содержаниемCO2 в тот же день инъекции ХГЧ самкам мышей.
  3. Приготовление капель оплодотворения ИКСИ
    1. В тот же день инъекции ХГЧ самкам мышей разделите крышку чашки для клеточных культур размером 50 х 9 мм на верхнюю и нижнюю половины. Используйте верхнюю половину для создания 4-6 капель по 5 мкл каждая, используя 10% поливинилпирролидон (ПВП) для размещения сперматозоидов. Используйте нижнюю половину, чтобы создать 8-10 капель по 5 мкл каждая, используя среду M2 для процедуры ИКСИ.
    2. Покройте средние капли PVP и M2 примерно 3 мл минерального масла (Рисунок 1).
  4. Приготовление блюд из культуры
    1. В тот же день инъекции ХГЧ самкам мышей равномерно дозируйте 12 капель среды КСОМ (MR-020P-D) объемом 20 мкл в чашке для клеточных культур размером 35 х 10 мм. Налейте капли примерно на 3 мл минерального масла.
  5. Забор спермы:
    1. Усыпьте самцов мышей при вывихе шейки матки примерно в 9:00 утра на четвертый день (через 13 часов после инъекции ХГЧ).
    2. Изолируйте хвост придатка яичка и тщательно очистите его, чтобы удалить жировую ткань и остатки крови, аккуратно промокнув стерильной марлей и прополоскав в предварительно подогретой среде HTF.
    3. Разрежьте придаток яичка, чтобы сперматозоиды могли свободно выплыть в среду HTF. Осторожно сожмите хвост с помощью щипцов, чтобы выпустить сперматозоиды, соберите их в предварительно уравновешенные трубки HTF и держите их открытыми в инкубаторе с температурой 37 °C, 5% CO2 для емкости сперматозоидов для дальнейшего использования.
  6. Забор ооцитов
    1. Усыпьте самок мышей, стимулированных для извлечения ооцитов путем вывиха шейки матки, около 9:30 утра на четвертый день. Осторожно сделайте разрез по средней линии кожи живота и мышечного слоя, чтобы обнажить брюшную полость.
    2. С помощью тонких щипцов аккуратно изолируйте ткань с обеих сторон яйцеводов, особенно из опухших областей ампулы, и перенесите ее в среду М2 в стерилизованную чашку для культуры. Повторяйте эту процедуру до тех пор, пока не будут собраны яйцеводы от всех обозначенных мышей.
    3. Под препарирующим микроскопом с помощью иглы шприца объемом 1 мл мягко проколотите прозрачный участок набухшей ампулы яйцевода, способствуя высвобождению кумулюс-ооцитарных комплексов (КОК) в среду.
    4. С помощью того же шприца осторожно соберите и переложите КОК в новую посуду, содержащую 100 мкл свежей среды М2. Повторяйте этот шаг до тех пор, пока все КОК не будут успешно перенесены из исходных сегментов яйцевода.
    5. Сотрите кровь и тканевые жидкости, а под препарирующим микроскопом разорвите ампулу яйцевода с помощью иглы 25 G, в результате чего произойдет выброс многочисленных КОК.
    6. Удалите яйцевод и фрагменты тканей, перенесите КОК в капли среды М2, содержащей гиалуронидазу (HY), и предварительно прогрейте их до 37 °C.
    7. После инкубации в течение примерно 5 минут проведите щадящее пипетирование, чтобы облегчить разделение кумулюсных клеток и ооцитов. Перенос ооцитов метафазы II (MII) из HY-содержащего раствора в свежую среду М2; затем выполните последовательный перенос в несколько капель среды М2.
    8. После 2-3 циклов промываний перенесите ооциты в капли питательной среды КСОМ и выдержите их в инкубаторе с температурой 37 °С, 5%СО2 для дальнейшего использования.
  7. Около 10:00 утра четвертого дня обработайте ультразвуком 100 мкл емкостного сперматозоида (см. шаг 1.5.2.) в течение 5 с, чтобы отделить головы от хвостов на частоте 46 кГц, с установкой мощности 50 Вт.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При ультразвуковой обработке спермы для усечения хвоста будьте осторожны, контролируя время, которое не должно превышать 5 с. Через несколько секунд после ультразвуковой обработки сперматозоиды можно наблюдать под перевернутым микроскопом; Прекращайте ультразвуковую обработку, когда примерно у половины сперматозоидов появляются усеченные хвосты.
  8. Процедура ИКСИ
    1. Для инъекции используйте имеющуюся в продаже иглу для микроманипуляций с плоским наконечником и внутренним диаметром 6 мкм, установленную под углом 25°. Заполните иглу рабочей жидкостью с заполненным участком длиной 0,5 см внутри иглы. Следите за тем, чтобы уровень жидкости достигал ~0,5 см.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживайте комнатную температуру на уровне 19 °C во время инъекции, чтобы избежать высоких температур, которые могут снизить выживаемость оплодотворенных ооцитов. Точность в достижении уровня жидкости 0,5 см имеет решающее значение для поддержания целостности процесса инъекции и обеспечения жизнеспособности ооцитов.
    2. Установите инъекционную иглу на правый рычаг микроманипулятора, надежно зафиксирован, затянув удерживающий колпачок. Установите имеющуюся в продаже пипетку для микроманипуляций с плоским наконечником, предназначенную для ооцитов мыши, на левую руку микроманипулятора и расположите иглу для инъекции и пипетку для удержания в поле зрения микроскопа.
    3. Добавьте 1 мкл обработанной ультразвуком спермы в каплю раствора ПВП с помощью пипетки.
    4. Поместите 20 ооцитов MII в каплю среды M2.
    5. С помощью инъекционной иглы отсасывайте 10-20 головок сперматозоидов в растворе ПВП. Затем переместите иглу для инъекции в каплю, содержащую ооциты.
    6. Непосредственно определите положение метафазного веретена в ооците под поляризационным микроскопом, чтобы убедиться, что веретенообразный аппарат не находится на стороне инъекции, при этом полярное тело обычно расположено либо в положении «12 часов», либо в положении «6 часов» относительно ориентации ооцита.
    7. Держите ооцит в контакте со дном чашки для посева. Отрегулируйте фокальную плоскость так, чтобы пеллюцидная зона ооцита и инъекционная игла находились в одной плоскости.
    8. При контакте инъекционной иглы с zona pellucida приложите небольшое отрицательное давление к игле для инъекций, втягивая часть zona pellucida.
    9. Одновременно активируйте пьезоимпульсы с установкой интенсивности 5 и частотой 1, эффективно создавая перфорацию в пеллюцидной зоне и пропуская иглу для инъекций.
    10. Введите инъекционную иглу в перивителлиновое пространство, прижимая головку сперматозоида к кончику иглы. Вводите инъекционную иглу в ооцит до тех пор, пока она не достигнет противоположной стороны пеллюцидной зоны.
    11. Используйте пьезоимпульсы, установленные на интенсивность 1 и частоту 1, для создания небольшой поры в плазматической мембране, обеспечивая введение головки сперматозоида в ооплазму с минимальным поступлением ПВП и оптимальным сохранением целостности ооцита.
    12. Повторите шаг 1.8.11 до тех пор, пока не будут введены все 20 ооцитов, после чего следует 15-минутная инкубация при 19 °C.
    13. Перенесите оставшиеся ооциты в среду КСОМ и поместите их в инкубатор. Наблюдайте за скоростью образования 2-клеточных, 4-клеточных, морул и бластоцист.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Следует контролировать время интрацитоплазматической инъекции одиночного сперматозоида (ИКСИ) в ооцит, стремясь завершить процедуру в течение 14-18 часов после инъекции ХГЧ.

2. Трансплантация маточных бластоцист мышей

  1. Подготовка вазэктомированных самцов мышей
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для исследования используйте самцов мышей ICR в возрасте 6-8 недель.
    1. Вызывают анестезию путем внутрибрюшинного введения 1,25% 2,2,2-трибромэтанола в дозировке 0,2 мл/10 г массы тела. Отсутствие какой-либо болевой реакции свидетельствует об успешной анестезии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на то, что текущий протокол не включает нанесение ветеринарной мази на глаза животных, находящихся под наркозом, это рекомендуется в качестве лучшей практики для предотвращения сухости глаз и обеспечения здоровья и комфорта животных во время процедур. На протяжении всего хирургического процесса и процесса восстановления все хирургические инструменты были стерилизованы перед использованием, а операционная область была подготовлена с использованием антисептических растворов для обеспечения чистой операционной среды.
    2. Чтобы защититься от потенциального стресса или травмы, размещайте мышей, перенесших операцию, по отдельности на начальном этапе восстановления.
    3. Вводите бупренорфин в дозировке 0,05 мг/кг массы тела для обеспечения оптимального облегчения боли.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы обеспечить благополучие мышей, внимательно следите за мышами в период восстановления и не оставляйте их без присмотра до тех пор, пока они не придут в сознание, достаточное для поддержания лежачего положения за грудиной.
    4. Подготовьте место операции в нижней части брюшной полости, выше яичек. Снимите шерсть и продезинфицируйте повидон-йодом. С помощью стерильных ножниц сделайте продольный разрез на 1 см по белой линии. Аккуратно удалите кровь стерильной, не содержащей пыли бумагой и приступайте к тупому рассечению мышц живота вдоль белой линии и доступа к брюшной полости.
    5. С помощью изогнутых щипцов аккуратно захватите и обнажите левое яичко и связанный с ним жировой пакет. Определите семявыносящий проток и аккуратно изолируйте его с помощью заостренных щипцов, создав сегмент 10 мм для манипуляций.
    6. Простерилизуйте изогнутые щипцы, удерживая их во внешнем пламени спиртовой лампы в течение нескольких секунд. Аккуратно возьмитесь за семявыносящий проток, в результате чего он становится плоским и белеет из-за прижигания. Создайте вторую точку прижигания на 3-5 мм дистальнее первой. С помощью стерильных хирургических ножниц иссекают сегмент семявыносящего протока между двумя точками прижигания.
    7. Внимательно осмотрите прижженные концы семявыносящих протоков, убедившись, что остался короткий, уплощенный, отбеленный сегмент. С помощью изогнутых щипцов аккуратно верните яичко и связанный с ним жировой пакет в брюшную полость.
    8. Повторите процедуру, описанную в пункте 2.1.6, с контралатеральной (правой) стороны.
    9. Закройте место операции с помощью швов, обычно накладывая один шов в мышечном слое и три шва на кожу. Обеспечьте правильное выравнивание хирургического разреза и продезинфицируйте повидон-йодом. Переложите животное на грелку для наблюдения, наблюдая в течение 10-15 минут, пока животное не придет в сознание. После извлечения верните животное в клетку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После операции вазэктомии мышам требуется 14-дневный период восстановления, за которым следует 1-недельный пробный эксперимент по спариванию.
    10. В течение этой недели непрерывно спаривайте вазэктомированных самцов с самками и наблюдайте за состоянием беременности всех самок с копулятивными пробками. Об успешном спаривании свидетельствует наличие желтовато-белой, блочной вагинальной пробки во влагалищном отверстии самки мыши.
      1. Соедините мышей между 16:00 и 18:00 в первый день и проверьте вагинальные пробки между 7:00 и 9:00 утра на второй день. Рассматривайте самок с вагинальными пробками как находящихся в псевдобеременном состоянии на 0,5 дня и используйте их для последующих экспериментов по переносу эмбрионов. Верните самок без вагинальных пробок в реципиентную группу.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Эти самки без вагинальных пробок могут продолжать использоваться для спаривания для подготовки псевдобеременных самок. Следите за тем, чтобы все закупоренные самки не забеременели; Только после этого вазэктомированные самцы могут быть использованы для формальных экспериментов.
      2. В то время как вазэктомированные самцы могут спариваться ежедневно, дайте 1 день отдыха между сеансами спаривания.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Основываясь на нашем опыте, самцы, подвергшиеся вазэктомии, могут поддерживать высокую частоту копулятивной пробки в течение более года. Тем не менее, вазэктомированные самцы, которые не могут вырабатывать копулятивные пробки у спаривающихся самок в течение 4-6 последовательных попыток, должны быть исключены из исследования.
  2. Подготовка псевдобеременных самок
    1. Создание псевдобеременных самок мышей путем скрещивания самок мышей ICR (в возрасте 7-10 недель, весом более 25 г) с вазэктомированными самцами мышей (в возрасте 3-6 месяцев) в соотношении 1:1.
      Примечание: Вазэктомированные самцы использовались для стимуляции шейки матки самок мышей, что приводило к активации желтого тела.
  3. Подготовка пипетки к переносу бластоцист
    1. Выньте из инкубатора эмбрионы, подлежащие пересадке, и перенесите их в каплю среды М2 при температуре 37 °С.
    2. С помощью пипетки для переноса можно отсасывать небольшой объем жидкости, набирать небольшое количество воздуха и отсасывать 6-10 эмбрионов. Наконец, вдохните еще один небольшой объем воздуха, чтобы закрыть пипетку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Длина жидкости в трансферной пипетке не должна превышать 0,5 см.
  4. Трансплантация матки (бластоцисты)
    1. Взвесить псевдобеременных самок мышей (через 2,5 дня после спаривания) и обезболить их внутрибрюшинным введением 1,25% 2,2,2-трибромэтанола в дозе 0,2 мл/10 г массы тела. Аккуратно прижмите ухо щипцами.
    2. После введения мышам анестезии и обеспечения асептики с помощью алкогольной дезинфекции сделайте продольный разрез по средней линии на брюшной полости. Используя свободную подкожную клетчатку, сместите разрез влево или вправо в соответствии с требованиями для трансплантации. С помощью небольших ножниц выполните тупое рассечение мышечного слоя брюшной стенки на ~0,5 см латеральнее поясничного отдела позвоночника для доступа к брюшной полости.
    3. С помощью атравматичных щипцов тщательно обнажить наружно яичники, яйцеводы, матку.
    4. С помощью кончика иглы шприца сделайте небольшой надрез на стенке матки под углом вверх ниже маточно-трубного соединения, избегая попадания кровеносных сосудов. Такой разрез обеспечивает доступ к полости матки; Аккуратно вставьте яйцевод на 2-3 мм через небольшое отверстие.
    5. Осторожно выдавите маленький пузырь воздуха на конце пипетки для переноса, осторожно наблюдая за пипеткой для переноса во время медленной инъекции эмбрионов. Как только будет подтверждено, что центральная часть питательной среды удалена, остановите процедуру и аккуратно извлеките переводную пипетку.
    6. Переместите яичники, яйцеводы и матку обратно в брюшную полость. Сшивайте мышечный слой и кожу отдельно. Положите мышей на грелку, пока они не оправятся от анестезии. Чтобы обеспечить хорошее самочувствие мышей, внимательно следите за мышами в период восстановления и не оставляйте их без присмотра до тех пор, пока они не придут в сознание, достаточное для поддержания лежачего положения на грудине.
  5. Наблюдение за беременностью
    1. После операции наблюдайте за мышами в течение 18-21 дня, чтобы контролировать количество рожденного потомства. В случае дистоции (тяжелых родов) проведите кесарево сечение. Позвольте новорожденным мышам воспитываться у кормящих матерей той же возрастной группы.

3. Случайный тест на уровень глюкозы в крови, уровень глюкозы в крови натощак и толерантность к глюкозе

  1. Отслеживание случайных уровней глюкозы в крови во время роста мышей
    1. С момента рождения мышей контролируйте случайный уровень глюкозы в крови каждые 4 недели в 9 утра после хорошей ночи кормления и веселья.
      1. Проколите кончик хвоста мыши, чтобы получить кровь из хвостовой вены.
      2. Первая капля крови имеет более высокое значение измерения сахара из-за наличия смешанной с ней тканевой жидкости. Поэтому аккуратно вытрите первую каплю крови с помощью чистой впитывающей бумаги.
      3. Измерьте уровень глюкозы в крови из второй капли (~4 μл) из хвостовой вены с помощью ручного глюкометра.
  2. Отслеживание изменений уровня глюкозы в крови натощак и толерантности к глюкозе во время развития мышей
    ПРИМЕЧАНИЕ: Учитывая, что время первого забора крови составляет 15 минут, всем мышам необходимо ввести инъекцию в течение 15 минут. Поскольку каждая инъекция мыши занимала 20-30 секунд, чтобы гарантировать, что инъекции будут завершены в течение этого времени, максимальное количество мышей, которое может быть использовано в каждом тесте, не может превышать 30.
    1. Проводите тесты на уровень глюкозы в крови натощак и толерантность к глюкозе каждые 4 недели после рождения у мышей натощак.
      1. В первый день подготовьте подстилку из свежей облученной стружки, чистые клетки, крышки и бутылки с водой. Пересадите мышей в свежую клетку без еды. Добавьте в клетки бирки «Не скармливать».
      2. Подготовьте достаточное количество 10% глюкозы для инъекций (стерильной и безпирогенной) и 1 мл шприцев.
      3. Убедитесь, что мыши в каждой группе голодают в течение 16 часов, с 17:00 дня 1 до 9:00 утра дня 2, но обеспечьте свободный доступ к воде. Измерьте уровень глюкозы в крови натощак, как описано в шагах 3.1.1.1-3.1.1.3, с помощью глюкометра.
    2. Взвесьте мышей и отметьте их хвосты, чтобы облегчить быструю идентификацию. Приготовьте шприцы с глюкозой из 10 мкл/г мышиного веса.
    3. С интервалом в 30 с введите 10 л/г глюкозы во внутрибрюшинную полость мыши.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Особое внимание здесь необходимо уделить технике инъекции, чтобы избежать неточного объема впрыска жидкости. Ключевыми моментами работы являются:
      1. Обездвижите мышь и зафиксируйте хвост одной рукой. Держите голову немного ниже ягодиц, чтобы органы в брюшной полости смещались в сторону головы, оставляя достаточно места для инъекций.
      2. Расположите иглу между средней линией и тазобедренной костью, введите ее через кожу под углом 45 градусов, затем осторожно направьте иглу вглубь брюшной полости, сохраняя ее параллельной поверхности кожи на ~0,5 см.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Обратите внимание на любое сопротивление во время инъекции, чтобы определить, не были ли случайно проколоты внутренние органы.
      3. Извергните шприц в брюшную полость.
      4. Запишите время начала инъекции и используйте таймер для управления скоростью инъекции. Установите таймер на 90 с для трех мышей, чтобы не терять время при работе с таймером.
    4. Измеряйте уровень глюкозы в крови из хвостовой вены через нужные промежутки времени (0 до введения глюкозы, 15, 30, 60, 90 и 120 минут после загрузки глюкозой).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Последующий анализ уровня глюкозы в крови также должен занимать 20-30 секунд для каждой мыши.
    5. После эксперимента верните мышей в домашние клетки, оборудованные едой и водой.

Результаты

В нашей лаборатории мы достигли уровня оплодотворения 89,57% и коэффициента оплодотворения 2 клеток 87,38% с использованием ИКСИ с каудальным сперматозоидом придатка яичка у мышей. Рождаемость потомства после ЭТ составляет примерно 42,50%. Примечательно, что все показатели оплодотворения, частоты 2-клеточной терапии и рождаемости потомства сопоставимы с уровнями, достигнутыми при АРТ у человека, что позволяет всесторонне моделировать различные стадии методов АРТ у мышей. Более подробная информация представлена в Таблице 1 и Таблице 2. Не было существенных колебаний случайных уровней глюкозы в крови между мышами, рожденными естественным путем, и мышами с ИКСИ в процессе роста и развития (рис. 2). Тем не менее, самцы мышей с ИКСИ демонстрировали постоянно высокие уровни глюкозы в крови натощак на протяжении всего эксперимента (рис. 3), что указывает на нарушение гомеостаза глюкозы в крови натощак. Интересно, что самки мышей ИКСИ не показали никаких изменений по сравнению с контрольной группой. При ГТТ уровень глюкозы в крови показал значительные изменения между самцами мышей с ИКСИ и контрольной группой (рис. 4), и у самок мышей такой разницы не было. Эти результаты свидетельствуют о том, что потомство, полученное с помощью технологии ИКСИ, может страдать от диабета, и исход был связан с полом. Несмотря на то, что у самок мышей не наблюдался фенотип диабета, фенотип избыточного веса как самцов, так и самок мышей ИКСИ был постоянным (рис. 5).

Используя описанный здесь протокол интрацитоплазматической инъекции сперматозоида (ИКСИ), мы достигли высоких показателей оплодотворения и развития эмбриона у мышей. В репрезентативном эксперименте 89,57% ооцитов были оплодотворены после ИКСИ, о чем свидетельствует образование двух пронуклеусов. Через 24 ч после ИКСИ 87,38% зигот развились до стадии 2-клеточного эмбриона. После переноса эмбрионов самкам-реципиентам рождаемость живых детенышей составила 42,50% (положительные результаты). Используя описанный здесь оптимизированный протокол интрацитоплазматической инъекции сперматозоида (ИКСИ), мы эффективно получили потомство из ооцитов и сперматозоидов мыши. Важно отметить, что тщательная характеристика животных, полученных из ИКСИ, выявила метаболические нарушения при отсутствии грубых дефектов развития.

По сравнению с контрольной группой, выведенной естественным путем, у самцов, но не самок мышей с ИКСИ наблюдалось нарушение гомеостаза глюкозы, о чем свидетельствовало повышенное содержание глюкозы в крови натощак (рис. 3) и снижение толерантности к глюкозе во внутрибрюшинных глюкозотолерантных тестах (рис. 4). Эти изменения могут быть вызваны недостатками перепрограммирования во время оплодотворения с помощью ИКСИ или тонкими генетическими/эпигенетическими аномалиями, возникшими во время манипуляций со спермой.

Кроме того, как самцы, так и самки мышей ИКСИ показали повышенную массу тела по сравнению с контрольной группой (рисунок 5), что свидетельствует о склонности к ожирению. В то время как метод ИКСИ у мышей надежно моделирует исходы ИКСИ человека, наблюдаемые метаболические фенотипы подчеркивают необходимость осторожной интерпретации результатов ИКСИ на животных моделях. Всесторонняя оценка роста, здоровья и поведения является обязательным условием для определения пригодности мышей ИКСИ для последующих приложений.

Взятые вместе, эти данные иллюстрируют полезность протокола ИКСИ у мышей для эффективного получения потомства для исследований, а также подчеркивают важность тщательной оценки фенотипических исходов у животных, полученных от ИКСИ. Метаболические аномалии, специфичные для пола, наблюдаемые в этом примере, подчеркивают необходимость тщательной интерпретации результатов мышиных моделей ИКСИ.

figure-results-1
Рисунок 1: Схема подготовки чашки к интрацитоплазматическому введению сперматозоида мышам. Крышка чашки для клеточных культур была разделена на верхнюю и нижнюю половины. Верхняя половина содержала капли 10% раствора поливинилпирролидона для размещения сперматозоидов. Нижняя половина содержала капли среды М2 для проведения процедуры ИКСИ. Все капли были покрыты минеральным маслом для предотвращения испарения. Такая конфигурация чашки позволяла осуществлять последовательный перенос сперматозоидов и ооцитов между каплями PVP и M2 для проведения процесса ИКСИ. Разделенные участки предотвращали смешивание сред во время процедуры. Сокращения: ИКСИ = интрацитоплазматическая инъекция сперматозоида; PVP = поливинилпирролидон. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Еженедельные случайные уровни глюкозы в крови у естественно выведенных мышей контрольной группы (n = 5) и мышей с ИКСИ (n = 5) во время постнатального развития. Уровень глюкозы в крови измеряли еженедельно после ночного голодания из хвостовой вены контрольной и ИКСИ мышей с помощью глюкометра. Данные представлены в виде среднего ± SEM. Статистическую значимость оценивали с помощью двустороннего ANOVA, нс, P > 0,05. Сокращения: SEM = стандартная ошибка среднего значения; ИКСИ = интрацитоплазматическая инъекция сперматозоида; ns = не значимый; NM = естественное спаривание. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: Еженедельный уровень глюкозы в крови натощак у естественно выведенных контрольных мышей (n = 7 для самцов, n = 7 для самок) и мышей, получавших ИКСИ (n = 7 для самцов, n = 7 для самок) в период постнатального развития. После ночного голодания уровень глюкозы в крови еженедельно измерялся из хвостовой вены контрольной группы натощак и мышей, получавших ИКСИ, с помощью глюкометра. Было замечено, что самцы мышей, получавших ИКСИ, но не самки, демонстрировали значительно повышенный уровень глюкозы в крови натощак по сравнению с контрольной группой соответствующего пола, начиная с 8-недельного возраста. ±Статистическая значимость оценивалась с помощью двустороннего ANOVA, нс, P > 0,05, ***P < 0,001,****P < 0,0001). Сокращения: SEM = стандартная ошибка среднего значения; ИКСИ = интрацитоплазматическая инъекция сперматозоида; ns = не значимый; NM = естественное спаривание. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-4
Рисунок 4: Внутрибрюшинный глюкозотолерантный тест у естественно выведенных контрольных мышей (n = 5) и самцов мужского пола, получавших ИКСИ (n = 5) в возрасте 16 недель. После ночного голодания мышам вводили внутрибрюшинную инъекцию глюкозы (2 г/кг массы тела). Затем уровень глюкозы в крови измерялся через 0, 30, 60 и 120 минут после инъекции. Самцы мышей, получавших ИКСИ, демонстрировали значительно более высокие уровни глюкозы в крови через 30, 60 и 120 минут во время IPGTT по сравнению с контрольной группой, выведенной естественным путем. Данные представлены в виде среднего значения ± SEM. Анализы проводились с использованием двустороннего ANOVA. нс, P > 0,05. *P < 0,05. Сокращения: IPGTT = Внутрибрюшинный глюкозотолерантный тест; SEM = стандартная ошибка среднего значения; ИКСИ = интрацитоплазматическая инъекция сперматозоида; ns = не значимый; NM = естественное спаривание. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-5
Рисунок 5: Отслеживание массы тела естественно выведенных контрольных мышей (n = 5 самцов, n = 5 самок) и мышей, получавших ИКСИ (n = 5 самцов, n = 5 самок) в возрасте от 4 до 20 недель. Еженедельные измерения показали, что как самцы, так и самки мышей, получавших ИКСИ, демонстрировали значительно увеличенную массу тела по сравнению с контрольной группой, начиная с 8-недельного возраста. Данные представлены в виде среднего значения ± SEM. Анализы проводились с использованием двустороннего ANOVA. Р < 0,001. Р < 0,0001. Сокращения: SEM = стандартная ошибка среднего значения; ИКСИ = интрацитоплазматическая инъекция сперматозоида; ns = не значимый; NM = естественное спаривание. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

ЯйцеклетокЗиготыНорма внесения удобрений (%)2-ячеечныйНорма 2-ячеек (%)4-8 ячеек4-8 клеточная норма (%)МорулаКурс МорулыБластоцистыСкорость бластоцисты
Сперматозоиды хвоста ICSI1908493.337690.487285.716982.146476.19
Сперматозоиды хвоста ICSI28072906286.115981.945373.614663.89
Сперматозоид ИКСИ3605083.334284377432642856
Итог23020689.5718087.3816881.5515474.7613866.99

Таблица 1: Исходы развития после ИКСИ у мышей. Сокращение: ИКСИ = интрацитоплазматическая инъекция сперматозоида.

Нет.Нет. перенесенных эмбрионовНет. родившихся (%)МужскойЖенскийРождаемость (%)
16330
26110
35202
48422
58211
67532
Итог401710742.5

Таблица 2: Исходы родов после трансплантации эмбрионов мышей методом ИКСИ через матку. Сокращение: ИКСИ = интрацитоплазматическая инъекция сперматозоида.

Обсуждение

В этом исследовании были интегрированы методы интрацитоплазматической инъекции сперматозоида (ИКСИ) и переноса эмбрионов (ЭТ) мышей, чтобы всесторонне обобщить вспомогательные репродуктивные технологии человека (ВРТ) и изучить влияние ИКСИ в сочетании с ЭТ на развитие потомства. Применение техники ИКСИ с нормальной спермой мыши дало высокую оплодотворенность (86,76%) и 2-клеточную частоту (88,48%). После ET рождаемость потомства мышей составила примерно 42,50%, что указывает на надежность технической платформы. Наиболее примечательным открытием этого исследования было возрастное колебание уровня метаболизма глюкозы у потомства ИКСИ, что может быть связано с применением техники ИКСИ6.

Наблюдаемые колебания уровня метаболизма глюкозы представляют собой замечательное открытие в этом исследовании. Этот вывод предполагает потенциальные долгосрочные последствия метода ИКСИ для здоровья потомства, в частности, в отношении метаболизма глюкозы. Чтобы выяснить причины этого явления, мы провели всестороннее исследование ключевых технических этапов, входящих в процедуру ИКСИ. Мы обнаружили, что контроль температуры микроинъекции (19 °C), продолжительности ультразвуковой резки (в пределах 5 с) и объема передаточной жидкости (<0,5 см) был важен для поддержания повышенной жизнеспособности эмбрионов и скорости имплантации. Контроль сифонного эффекта трансферной пипетки стал критически важным этапом для точного переноса эмбрионов. При подготовке пипетки для переноса обеспечение однородности диаметра пробирки является ключом к смягчению эффекта сифона и лучшему контролю движения жидкости внутри пробирки. Этот показатель играет важную роль в повышении успешности и точности переноса эмбрионов. Кроме того, предотвращение длительного культивирования in vitro и переполненности во время переноса эмбрионов также помогло улучшить компетентность в развитии. Используя оптимизированные протоколы, мы достигли уровня оплодотворения 86,76% и коэффициента рождаемости 42,50% после ЭТ, что говорит о том, что сама процедура ИКСИ сама по себе не ухудшает жизнеспособность. Таким образом, колебания метаболизма глюкозы были более правдоподобно связаны с тонкими внутриклеточными изменениями, вызванными процессом АРТ, а не с явным повреждением эмбриона.

В то время как АРТ широко признается безопасной, все больше данных указывают на то, что даже, казалось бы, нормальное потомство с АРТ может проявлять различные риски для здоровья в более позднем возрасте из-за неестественных репродуктивных характеристик и критических периодов вмешательства во время развития гамет и эмбрионов 5,8,9,10,11,12,13 . Наши результаты позволяют по-новому взглянуть на потенциальные метаболические эффекты АРТ и подчеркивают необходимость дальнейших исследований долгосрочного воздействия АРТ на здоровье потомства14.

Важно признать, что в этом исследовании использовалась мышиная модель; Следовательно, результаты не могут быть напрямую перенесены на людей. Тем не менее, учитывая существенные биологические параллели между мышами и людьми, эти результаты сохраняют значительную референтнуюзначимость. Кроме того, важно признать, что пациенты, перенесшие ИКСИ в клинической практике, часто имеют аномалии сперматозоидов. С другой стороны, в этом исследовании для процедур ИКСИ использовались нормальные мыши, таким образом, отсутствовали данные о потомстве ИКСИ от мышей с аномалиями сперматозоидов. Тем не менее, разумно ожидать, что аномалии сперматозоидов будут оказывать более глубокое влияние на долгосрочные эффекты метода ИКСИ. Таким образом, результаты этого исследования сохраняют заметную референтную ценность.

Еще одним ограничением нашего исследования является методологическое расхождение между нашей моделью на мышах и клинической практикой человека в области иммобилизации сперматозоидов. При клиническом применении ИКСИ обычной практикой является иммобилизация сперматозоидов человека путем физического разрушения хвоста с помощью микропипетки. Тем не менее, в наших экспериментах на мышиной модели мы использовали ультразвуковое обрезание хвоста для подготовки сперматозоидов — метод, обычно используемый при манипуляциях с эмбрионом мыши. Мы признаем, что такой подход может непреднамеренно привести к вариабельности и потенциальной систематической ошибке в модели, особенно с учетом возможного повреждения целостности и функции сперматозоидов ультразвуком. Это методологическое различие может ограничить прямую переводимость наших результатов. В нашей будущей работе мы планируем изучить использование микропипеток для разрушения хвостов сперматозоидов мышей. Эта корректировка направлена на то, чтобы свести к минимуму любое непреднамеренное воздействие на сперматозоиды и лучше воспроизвести условия и результаты, наблюдаемые при процедурах ИКСИ у человека. Мы стремимся постоянно совершенствовать нашу исследовательскую практику для повышения клинической значимости наших результатов.

Основываясь на вышеупомянутой технологической платформе, в будущих исследованиях мы будем продолжать изучать влияние метода ИКСИ на другие аспекты здоровья потомства, такие как здоровье сердечно-сосудистой системы и иммунной системы. Кроме того, долгосрочные последующие исследования также необходимы для всестороннего понимания долгосрочных последствий ИКСИ.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

Эта работа была поддержана Планом крупных проектов Специального фонда развития для Шанхайской национальной независимой инновационной демонстрационной зоны Чжанцзян (ZJ2022-ZD-006), Проектом целевого финансирования Шанхайской муниципальной комиссии по науке и технологиям (22DX1900400), Молодежной программой Шанхайской муниципальной комиссии по здравоохранению (20204Y0276). Национальный фонд естественных наук Китая (32070849).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1,25% авертин (2,2,2-трибромэтанол)Nanjing AibeiM2960для анестезии
Бактериологические чашки Петри 35 x 10 мм с плотной крышкой, кристаллический первичный полистирол, стерильныйBD353001
Бактериологические чашки Петри 50 x 9 мм с плотной крышкой, кристаллический первичный полистирол, стерильныйBD351006
Шкаф биобезопасностиESCOclass figure-materials-1 Асептические операции "Би Эс Си",изготовление питательных блюд, аликвотирование реагентов и т.д.
CO2 ИнкубаторThermo8000DHэмбриональных культур
OlympusSZX16Использование при переносе эмбрионов мышей
Fluorinert Fc-770SIGMAF3556Fluorinert FC-770 представляет собой термически стабильную полностью фторированную жидкость с высокой диэлектрической прочностью и удельным сопротивлением, используемую в качестве рабочей жидкости
ручным глюкометромRocheAccuChek performaBlood измерение уровня глюкозы
HTFMerckMR-070-DЖидкость для труб человека (HTF) EmbryoMax (1x), жидкость, предназначенная для использования при ЭКО на мышах, доступна в формате 50 мл и была оптимизирована и проверена для культивирования эмбрионов.
Гидравлический микроинъекторEppendorfCellTram 4r Oil, 5196000030Для инъекции спермы
Инвертированный микроскопNikonTI2-UМикроманипуляция для наблюдения хост
KSOMMerck MR-020P-D(1x), Порошок, без фенола красного, 5 x 10 мл
M2MerckMR-015-DEmbryoMax M2 Medium (1x), жидкий, с
микроманипуляторомNARISHIGENTX-N4Манипулятор для микроманипуляций
минеральное масло Минеральное масло SIGMAM8410подходит для использования в качестве защитного слоя для контроля испарения и перекрестного загрязнения в различных областях молекулярной биологии.
Игольчатый резакNanjing AibeiSutter MF-800Использование для изготовления игл для микроманипуляций
Needle PullerNanjing AibeiSutter модель p-100Использование для изготовления игл для микроманипуляций
Piezo Drill Trip Mouce ICSIEppendorf5195000.087Применение иглы для инъекций ИКСИ.
Пьезоэлектрический микроманипулятор (мембранный прерыватель)EppendorfEppendorf PiezoXpertИспользование микроимпульсов для разрушения пеллюцидной зоны и оолеммы ооцита
Пневматический микроинъекторEppendorfCellTram 4r Air, 5196000013Для фиксации ооцита
Готовый к применению хорионический гонадотропин человека (ХГЧ)Nanjing AibeiM2520Стерилизационный реагент, внутрибрюшинное введение. 50 МЕ/мл
Готовый к применению гонадотропин сыворотки беременной кобылы (PMSG)Nanjing AibeiM2620Стерилизационный реагент, внутрибрюшинное введение. 50 МЕ/мл
СтереомикроскопOlympusSZX7Забор ооцитов и наблюдение за развитием эмбриона
Микроскоп для рассечения Phenol Red

Ссылки

  1. Palermo, G., Joris, H., Devroey, P., Van Steirteghem, A. C. Pregnancies after intracytoplasmic injection of single spermatozoon into an oocyte. Lancet. 340 (8810), 17-18 (1992).
  2. Flurkey, K. M., Currer, J., Harrison, D. E. Vol. III Mouse models in aging research. Ch. 20. The mouse in biomedical research (second edition). Fox, J. G., et al. , Academic Press. Burlington. 637-672 (2007).
  3. Chen, M., Heilbronn, L. K. The health outcomes of human offspring conceived by assisted reproductive technologies (art). J Dev Orig Health Dis. 8 (4), 388-402 (2017).
  4. Heber, M. F., Ptak, G. E. The effects of assisted reproduction technologies on metabolic health and diseasedagger. Biol Reprod. 104 (4), 734-744 (2021).
  5. Ma, R. C. W., Ng, N. Y. H., Cheung, L. P. Assisted reproduction technology and long-term cardiometabolic health in the offspring. PLoS Med. 18 (9), e1003724(2021).
  6. De Waal, E., et al. The cumulative effect of assisted reproduction procedures on placental development and epigenetic perturbations in a mouse model. Hum Mol Genet. 24 (24), 6975-6985 (2015).
  7. Carlin, J., George, R., Reyes, T. M. Methyl donor supplementation blocks the adverse effects of maternal high fat diet on offspring physiology. PLoS One. 8 (5), e63549(2013).
  8. Hiraoka, K., et al. Piezo-icsi for human oocytes. J Vis Exp. (170), e60224(2021).
  9. Sullivan-Pyke, C. S., Senapati, S., Mainigi, M. A., Barnhart, K. T. In vitro fertilization and adverse obstetric and perinatal outcomes. Semin Perinatol. 41 (6), 345-353 (2017).
  10. Luke, B., et al. The risk of birth defects with conception by art. Hum Reprod. 36 (1), 116-129 (2021).
  11. Norrman, E., et al. Cardiovascular disease, obesity, and type 2 diabetes in children born after assisted reproductive technology: A population-based cohort study. PLoS Med. 18 (9), e1003723(2021).
  12. Goldsmith, S., Mcintyre, S., Badawi, N., Hansen, M. Cerebral palsy after assisted reproductive technology: A cohort study. Dev Med Child Neurol. 60 (1), 73-80 (2018).
  13. Hansen, M., et al. Intellectual disability in children conceived using assisted reproductive technology. Pediatrics. 142 (6), e20181269(2018).
  14. Chang, R. C., Wang, H., Bedi, Y., Golding, M. C. Preconception paternal alcohol exposure exerts sex-specific effects on offspring growth and long-term metabolic programming. Epigenetics Chromatin. 12 (1), 9(2019).
  15. Grasemann, C., et al. Parental diabetes: The akita mouse as a model of the effects of maternal and paternal hyperglycemia in wildtype offspring. PLoS One. 7 (11), e50210(2012).

Перепечатки и разрешения

Теги

Мониторинг глюкозы в кровитест на толерантность к глюкозеперенос эмбрионавспомогательные репродуктивные технологиикапацитация сперматозоидовметаболическое расстройствоглюкоза в крови натощакотслеживание массы тела
Мониторинг уровня глюкозы в крови у потомства мышей после интрацитоплазматической инъекции сперматозоида
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.