Органоиды революционизируют персонализированное моделирование тканей для разработки органов, открытия лекарств и исследования заболеваний. Органоидная инженерия продвигается вперед в создании сложных синтетических тканей. Цель состоит в том, чтобы интегрировать морфогенез, ассамблоидную технологию и биоматрицы для развития тканевой инженерии. Этот протокол помогает в моделировании органогенеза печени и установлении рекомендаций по конструированию синтетических тканей.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Методы культивирования in vitro для моделирования органогенеза печени, построения ассамблоидов и конструирования синтетических тканей с использованием клеточных линий человека
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Хроническое заболевание печени достигло масштабов эпидемии, затронув более 800 миллионов человек по всему миру. Современное лечение, ортотопическая трансплантация печени, имеет несколько ограничений. Перспективные решения появились в области регенеративной медицины печени, при этом значительный потенциал имеет органогенез печени. Ранний органогенез печени, происходящий между E8.5 и 11.5, включает в себя формирование эпителиально-мезенхимальных взаимодействий, приводящих к морфогенезу, образованию печеночного пуповины и коллективной миграции. Однако методов моделирования этого процесса in vitro не хватает. В данном исследовании представлен подробный ряд методов, позволяющих моделировать различные стадии и аспекты органогенеза печени с помощью клеточных линий человека. В одной из серий методов используется ассамблоидная технология с печеночными (HEP) и мезенхимальными (MES) сфероидами, реплицирующими ранние структуры, обнаруженные в органогенезе печени, моделирующими ранний морфогенез и демонстрирующими интерстициальную миграцию клеток, наблюдаемую in vivo. Эти инновационные ассамблоидные системы помогают идентифицировать факторы, влияющие на формирование и миграцию ассамблоидов. Системы культивирования сфероидов HEP также использовались для моделирования коллективной миграции и разветвленного морфогенеза. Мезенхимально-кондиционированные среды (М-КМ) играют важную роль в инициировании дозозависимой ветвящейся миграции. Было показано, что все представленные методы обладают высокой воспроизводимостью и высоким процентом успеха. Связывая эти события вместе, наша работа позволит воссоздать последовательные морфогенетические события для реверс-инжиниринга органогенеза in vitro и in vivo.
Введение
Миграция клеток печени играет важную роль в органогенезе печени, заболеваниях и клеточной терапии. Во время органогенеза печени (Е8,5-9,0, мышь) вентральный предпеченочный эпителий передней кишки начинает экспрессировать гены печени за счет индуктивных сигналов, исходящих от окружающей мезенхимы и сердца. При E9.0 эпителий передней кишки утолщается по мере того, как клетки переходят от кубовидной к псевдостратифицированной столбчатой морфологии, образуя дивертикул печени1,2. На этой критической стадии дивертикул печени состоит всего из ~1500 клеток. Затем печеночная энтодерма, выстилающая дивертикул печени, у....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Подробная информация о реагентах и оборудовании, использованном в исследовании, указана в таблице материалов. Сокращения, используемые в этой статье, определены в Дополнительном файле 1.
1. Приготовление 1% раствора агарозы с низким электроэндосмосом (EEO)
- Взвесьте 2,5 г порошка агарозы с низким содержанием EEO и переложите его в стакан.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что стакан как минимум в два раза больше желаемого объема, чтобы вместить пузыри во время приготовления раствора. - С помощью мерного цилиндра отмерьте 250 мл дистиллированной воды и налейте ее в стакан, ст....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Растет интерес к синтетическим тканям для различных биомедицинских приложений, таких как моделирование заболеваний, поиск новых лекарственных средств и тканевая инженерия (Рисунок 7). В этой области органоиды, сфероиды и клетки, полученные из плюрипотентных стволовых клеток человека (hPSC), трансформируются в более синтетические, сложные и крупные ткани. Эта трансформация включает применение принципов морфогенеза, использование таких инструментов, как микрофабрикация, и интеграцию биоматриц,.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Настоящий протокол включает в себя несколько методов культивирования как простых, так и сложных ассамблоидов, а также методы индуцирования трехмерной коллективной миграции клеток в раннем органогенезе печени24,25. Изложенные протоколы выделяют несколько критически важных этапов, при этом формирование сфероидов является центральным аспектом всех методологий. Микролунки (96 или 384 лунки) используются либо с неадгезивными пластинами, либо с пластинами с агарозным п.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
NP является основателем Khufu Therapeutics, компании по разработке органоидов, которая разрабатывает методы лечения острых и хронических заболеваний печени.
Благодарности
Авторы хотели бы выразить искреннюю благодарность Огечи Огоке и Усаме Юсефу за их неоценимый вклад в данные, использованные в этой статье. NP был поддержан стартовыми фондами UB CBE, стипендией Марка Даймонда, Научным C024316 стволовых клеток штата Нью-Йорк, Центром стволовых клеток в регенеративной медицине UB (ScIRM), Центром клеточной, генной и тканевой инженерии Университета в Буффало (CGTE).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 384-луночный черный/прозрачный круглое дно сверхнизкое вложение сфероид микропластина | Corning | 3830 | |
| 96-wl пластина для культивирования клеток плоская,TC,STRL,1/pk,100/CS | Лабораторные продукты Продажи | 701001 | |
| агароза | Sigma-Aldrich | A0576 | Низкое EEO |
| Axiovision Программное обеспечение | ZEISS | версия 4 | |
| Чашка для клеточных культур, 60 мм, TC, STRL, 20/шт, 500 / CS | Продажа лабораторных продуктов | 705001 | |
| колба для клеточных культур, 175 см и 2 см, Vent, TC, STRL, 5 / pk, 40 / CS | Лабораторная продукция Продажа | 709003 | |
| колба для клеточных культур, 75 см и 2 см, Vent, TC, STRL, 5 / pk, 100 / CS | Лабораторная продукция Продажа | 708003 | |
| центрифужные пробирки, 15mL, PP, STRL, град, 50 / BG, 500 / CS | Лабораторная продукция Продажа | L226010 | |
| Коллаген I, Крысиный хвост, 100 мг | Corning | 354236 | |
| DMEM, с высоким содержанием глюкозы, добавка GlutaMAX, пируват | ThermoFisher Scientific | 10569010 | |
| EVOS Флуоресцентный, фазово-контрастный микроскоп | EVOS | AMEFC4300R | 1 360 x 1 024 пикселей с плотностью 1 024 пикселей |
| , сертифицированный | ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
| СШАФибриноген из плазмы крови человека | Sigma-Aldrich | F4883-500MG | 500 мг |
| Hep G2 [HEPG2] | ATCC | HB-8065 | |
| HERAcell vios 160i | ThermoFisher Scientific | 51033557 | |
| HFF-1 | ATCC | SCRC-1041 | |
| ImageJ | IJ1.46r; базальная | ||
| мембрана https://imagej.net/ij/ Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Матрица, без LDEV, 10 мл | Corning | 354230 | |
| MRC-5 | ATCC | CCL-171 | |
| MSCGMT Мезенхимальные стволовые клетки человека BulletKit | Lonza | PT-3001 | |
| Пенициллин-стрептомицин (10 000 Ед/мл) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| Тромбин из плазмы человека | Sigma-Aldrich | T6884-100UN | 100 единиц |
| Трипсин-ЭДТА (0,05%), фенол красный | ThermoFisher Scientific | 25300062 | |
| Трипсин-ЭДТА (0,25%), фенол | красный ThermoFisher Scientific | 25200072 | |
| Vybrant DiD Решение для мечения клеток | ThermoFisher | Scientific V22887 | |
| Vybrant DiI Решение для мечения клеток | ThermoFisher Scientific | V22885 | |
| Vybrant DiO для мечения клеток Решение | ThermoFisher Scientific | V22886 | |
| Флуоресцентный микроскоп Zeiss Axio | ZEISS | SE64, плотность 1,344 & 1,024 пикселей |
Ссылки
- Bort, R., Signore, M., Tremblay, K., Martinez Barbera, J. P., Zaret, K. S. Hex homeobox gene controls the transition of the endoderm to a pseudostratified, cell emergent epithelium for liver bud development. Dev Biol. 290 (1), 44-56 (2006).
- Gualdi, R., et al.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
