Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Методы культивирования in vitro для моделирования органогенеза печени, построения ассамблоидов и конструирования синтетических тканей с использованием клеточных линий человека

1.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/66229

⸱

18 апреля 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, University at Buffalo (State University of New York), 2Clinical and Translation Research Center (CTRC), University at Buffalo (State University of New York), 3Department of Chemical and Biological Engineering, University at Buffalo (State University of New York), 4Center for Cell, Gene and Tissue Engineering, University at Buffalo, State University of New York, 5Khufu Therapeutics, Inc.

В этой статье

Краткое содержание

Органоиды революционизируют персонализированное моделирование тканей для разработки органов, открытия лекарств и исследования заболеваний. Органоидная инженерия продвигается вперед в создании сложных синтетических тканей. Цель состоит в том, чтобы интегрировать морфогенез, ассамблоидную технологию и биоматрицы для развития тканевой инженерии. Этот протокол помогает в моделировании органогенеза печени и установлении рекомендаций по конструированию синтетических тканей.

Аннотация

Хроническое заболевание печени достигло масштабов эпидемии, затронув более 800 миллионов человек по всему миру. Современное лечение, ортотопическая трансплантация печени, имеет несколько ограничений. Перспективные решения появились в области регенеративной медицины печени, при этом значительный потенциал имеет органогенез печени. Ранний органогенез печени, происходящий между E8.5 и 11.5, включает в себя формирование эпителиально-мезенхимальных взаимодействий, приводящих к морфогенезу, образованию печеночного пуповины и коллективной миграции. Однако методов моделирования этого процесса in vitro не хватает. В данном исследовании представлен подробный ряд методов, позволяющих моделировать различные стадии и аспекты органогенеза печени с помощью клеточных линий человека. В одной из серий методов используется ассамблоидная технология с печеночными (HEP) и мезенхимальными (MES) сфероидами, реплицирующими ранние структуры, обнаруженные в органогенезе печени, моделирующими ранний морфогенез и демонстрирующими интерстициальную миграцию клеток, наблюдаемую in vivo. Эти инновационные ассамблоидные системы помогают идентифицировать факторы, влияющие на формирование и миграцию ассамблоидов. Системы культивирования сфероидов HEP также использовались для моделирования коллективной миграции и разветвленного морфогенеза. Мезенхимально-кондиционированные среды (М-КМ) играют важную роль в инициировании дозозависимой ветвящейся миграции. Было показано, что все представленные методы обладают высокой воспроизводимостью и высоким процентом успеха. Связывая эти события вместе, наша работа позволит воссоздать последовательные морфогенетические события для реверс-инжиниринга органогенеза in vitro и in vivo.

Введение

Миграция клеток печени играет важную роль в органогенезе печени, заболеваниях и клеточной терапии. Во время органогенеза печени (Е8,5-9,0, мышь) вентральный предпеченочный эпителий передней кишки начинает экспрессировать гены печени за счет индуктивных сигналов, исходящих от окружающей мезенхимы и сердца. При E9.0 эпителий передней кишки утолщается по мере того, как клетки переходят от кубовидной к псевдостратифицированной столбчатой морфологии, образуя дивертикул печени1,2. На этой критической стадии дивертикул печени состоит всего из ~1500 клеток. Затем печеночная энтодерма, выстилающая дивертикул печени, утолщается, расслаивается и образует тяжи мигрирующих гепатобластов (HBs). Эти HBs мигрируют вместе с эндотелиальными клетками и мезенхимальными клетками, разветвляясь в окружающую мезенхимальную ткань, инициируя трехмерную коллективную миграцию клеток, чтобы сформировать класс почек печени3,4. На самом деле, на этой стадии клетки коллективно претерпевают (1) совместную миграцию, или движение вместе с другими типами клеток, (2) разветвленный морфогенез или образование ветвящихся трубчатых структур, и (3) интерстициальную миграцию, или миграцию поверх или между другими клетками. К E11.5 миграция прекращается, и формируется примитивная печень, расширяющаяся в 103 раза3. Миграция клеток печени также может потребоваться на более поздних стадиях органогенеза печени, так как экспрессия HBs плода крысы показала признаки высокой регуляции генов, связанных с 3D-коллективной миграцией клеток, морфогенезом и ремоделированием внеклеточного матрикса5. В дополнение к своей роли в раннем органогенезе печени, 3D-коллективная миграция неразрывно связана с локальным распространением и метастазированием прогрессирующей гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК), что в конечном итоге приводит к ухудшению прогноза и повышению резистентности к лечению6. Взрослые и фетальные гепатоциты также используют коллективную миграцию при перемещении из селезенки внутрь печени во время репопуляции печени. Исследования визуализации in vivo показали, что трансплантированные гепатоциты попадают в воротную вену, а затем в капилляры в течение нескольких часов, мигрируя через синусоиды печени и через ткань печени7,8,9. Наконец, недавние исследования показывают, что мигрирующие HBs возникают во время регенерации печени мыши и человека, с некоторыми доказательствами перемещения в sheets10. В целом, коллективная миграция печени, способная к нескольким режимам морфогенеза, играет важную роль в органогенезе, раке, клеточной терапии гепатоцитарами и регенерации печени.

Многочисленные генетические исследования изучали молекулярные пути, лежащие в основе коллективной миграции клеток 3D печени. Эти исследования показывают, что отсутствие печеночных тяжей препятствует образованию печени, подчеркивая необходимость формирования печеночного пуповины и их взаимодействия с поддерживающими клетками для формирования печени1,11,12,13. Эти исследования также показывают, что рост печени инициируется различными факторами, включая FGF-2, секретируемый сердечной мезодермой, BMP4, секретируемый окружающей мезенхимой, HGF и взаимодействия эндотелиальных клеток. Кроме того, факторы транскрипции, связанные с миграцией, включая HEX, PROX1 и TBX3, играют решающую роль2,14. В заключение следует отметить, что генетические исследования свидетельствуют о том, что передача сигналов растворимым фактором, приводящая к экспрессии факторов транскрипции, стимулирует миграцию, передачу сигналов и молекулярные взаимодействия между HBs и окружающей их мезенхимой.

В то время как миграция клеток в раннем органогенезе печени была широко исследована, текущие исследования миграции печени in vitro часто используют 2D-анализы с использованием высокомигрирующих клеток ГЦК наряду с моделями опухолей in vivo15. Эти исследования позволили получить представление о нескольких факторах, влияющих на миграцию печени, в том числе TGFβ-116, c-Myc17, YAP18, goosecoid19, actopaxin20, и miRNAs21,22,23. Несмотря на значительный прогресс, достигнутый в понимании молекулярных механизмов 3D-миграции печеночных клеток, явные различия между 2D и 3D клеточными миграциями позволяют предположить, что двухмерные анализы обладают присущими им ограничениями. Более того, в этих моделях часто отсутствуют типы мезенхимальных клеток, которые необходимы как для миграции, так и для роста. Несмотря на то, что был достигнут прогресс в разработке 3D-моделей миграции печени, которые интегрируют поддерживающую мезенхиму, эти модели в первую очередь делают акцент на совместной миграции, а не на исследовании различных способов коллективной миграции.

Способность создавать ткани из сфероидов с помощью различных процессов самосборки и морфогенеза облегчает научное исследование синтетических тканей. Эти ткани широко применяются в разработке и скрининге лекарств, моделировании заболеваний, терапии и других биомедицинских и биотехнологических приложениях. Приведены методологические детали нескольких 3D систем культивирования in vitro, разработанных для демонстрации различных режимов 3D коллективной миграции печени. Эти системы включают (1) сосфероидную культуру со сфероидами HEP и MES в матриксе, (2) каплю сфероидального матрикса HEP, культивированную с помощью M-CM, (3) смешанные сфероиды HEP-MES и (4) сфероидную матрицу HEP, культивируемую с высокой плотностью клеток MES. Эти системы позволяют надежно моделировать коллективную миграцию печени в 3D-среде, тем самым улучшая наше понимание молекулярных и клеточных процессов, лежащих в основе органогенеза печени, рака и терапии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Подробная информация о реагентах и оборудовании, использованном в исследовании, указана в таблице материалов. Сокращения, используемые в этой статье, определены в Дополнительном файле 1.

1. Приготовление 1% раствора агарозы с низким электроэндосмосом (EEO)

  1. Взвесьте 2,5 г порошка агарозы с низким содержанием EEO и переложите его в стакан.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что стакан как минимум в два раза больше желаемого объема, чтобы вместить пузыри во время приготовления раствора.
  2. С помощью мерного цилиндра отмерьте 250 мл дистиллированной воды и налейте ее в стакан, стремясь к конечной концентрации (w/v) 1%.
  3. Закройте отверстие стакана полиэтиленовой пленкой, оставив небольшое отверстие для вентиляции. Нагрейте стакан в микроволновке в течение 30 секунд.
  4. Осторожно снимите стакан и перемешайте содержимое. Повторяйте этот процесс каждые 30 с до полного растворения.
    ВНИМАНИЕ: Обращайтесь со стеклянной посудой в микроволновой печи осторожно, используя подходящие перчатки. Внимательно следите за раствором, чтобы не допустить перегрева или выкипания.
  5. Как только будет получен однородный раствор, достаньте стакан из микроволновой печи. Аккуратно взболтайте раствор перед тем, как переложить его в предварительно простерилизованную бутылку. Отавтоклавируйте раствор и храните раствор агарозы при комнатной температуре (RT) до готовности к использованию.

2. Покрытие 96-луночного планшета

ПРИМЕЧАНИЕ: 384-луночные сверхнизко прикрепленные сфероидные микропластины могут быть использованы в этих и дальнейших экспериментах.

  1. Ослабьте крышку флакона, содержащего стерильный 1% раствор агарозы. Прогрейте раствор в микроволновой печи с интервалом в 30 с до перехода в жидкую фазу; Затем затяните колпачок <бр/> ВНИМАНИЕ: Обращайтесь со стеклянной посудой в микроволновой печи осторожно, используя подходящие перчатки. Внимательно следите за раствором, чтобы не допустить перегрева или выкипания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте эти шаги под стерильным тканевым культуральным ламинарным колпаком.
  2. Перенесите 55-65 мкл 1% раствора агарозы на лунку, чтобы покрыть 96-луночный тканевый планшет и немедленно поверните планшет.
  3. После того, как 1% раствор агарозы будет перенесен в нужное количество лунок, поместите пластины в холодильник с температурой 4 °C на 20-30 минут, чтобы агароза затвердела. Перед использованием доведите пластину до комнатной температуры (Рисунок 1A).

3. Получение сфероидов HEP

  1. Культивируйте клетки HepG2-WT в колбе T-75 с использованием готовой питательной среды (cDMEM), состоящей из модифицированной орлиной среды Dulbecco (DMEM) с добавлением 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота (FBS) и 1% пенициллин-стрептомицина (Pen-Strep). Поддерживайте в клеточной культуре температуру 37 °C и 5%CO2, ежедневно меняя питательную среду.
  2. По достижении 80% конфлюенции промойте клетки 1x фосфатно-солевым буфером (PBS) и выбросьте промывку. Добавьте в колбу 5 мл 0,05% Трипсина-ЭДТА и инкубируйте при 37 °C и 5%CO2 в течение 5-10 минут.
  3. Добавьте равное количество кДМ и смойте клетки с колбы. После отделения клеток переложите смесь в стерильную коническую центрифужную пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте клеточную суспензию при плотности 300 x g в течение 5 минут при RT.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы центрифугирования, описанные в этом протоколе, были выполнены при комнатной температуре (RT). Тем не менее, эти процедуры центрифугирования можно проводить в качестве альтернативы при низких температурах.
  4. Повторно суспендируйте клеточную суспензию в свежей cDMEM и подсчитайте клетки, чтобы определить конечную концентрацию в клетках/мл (Рисунок 1B).
  5. Мечение клеток на основе красителя
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это необязательный шаг.
    1. Перелейте желаемое количество клеточной суспензии в стерильную коническую центрифужную пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте клеточную суспензию при 300 x g в течение 5 минут.
    2. Повторно суспендируйте клеточную гранулу в бессывороточной питательной среде для достижения конечной концентрации 1,0 x 106 клеток/мл. Добавьте 5 мкл флуоресцентного раствора для мечения клеток на мл клеточной суспензии и инкубируйте клеточную суспензию при 37 °C и 5%CO2 при вращении в течение 20 мин.<бр/> ПРИМЕЧАНИЕ: Бессывороточная питательная среда - DMEM, дополненная только 1% пен-стрептококком. Отрегулируйте время инкубации для равномерного окрашивания в зависимости от плотности клеточной суспензии.
    3. После завершения инкубации центрифугируйте клеточную суспензию при давлении 450 x g в течение 5 минут и повторно суспендируйте клеточную гранулу в свежем cDMEM. Повторите этот процесс стирки еще два раза (Рисунок 1C).
  6. Сфероидальная формация
    1. Суспендируйте клетки в свежем cDMEM до достижения конечной концентрации 5,0 x 104 клеток/мл в зависимости от количества клеток. Хорошо перемешайте клеточную суспензию и перелейте 100 мкл клеточной суспензии на лунку на 96-луночный планшет с агарозным покрытием.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Плотность суспензии ячеек установлена таким образом, чтобы достичь 5000 клеток на лунку в 96-луночном планшете с агарозным покрытием. Для использования 384-луночных планшетов клетки суспензируют в конечной концентрации 2,0 x 105 клеток/мл, и 50 мкл клеточной суспензии переносят на лунку для достижения концентрации 10 000 клеток на лунку.
    2. Центрифугируйте планшет при 340 x g в течение 10 минут и инкубируйте при 37 °C и 5%CO2 в течение 5-9 дней (Рисунок 1D).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Меняйте питательную среду через день после покрытия, аккуратно удаляя 50% cDMEM и заменяя ее. HEP-сфероиды подходят для модели сборки HEP-MES или модели M-CM.

4. Получение сфероидов MES

  1. Культивируйте клетки HFF/MRC-5 в колбе T-175 с использованием cDMEM, состоящего из DMEM, дополненного 10% FBS и 1% Pen-Strep. Поддерживайте клеточную культуру при температуре 37 °C и 5%CO2, меняя среду через день.
  2. По достижении 80% конфлюенции выполните промывку ячеек 1x PBS и выбросьте промывку. Добавьте в колбу 5 мл 0,25% Trypsin-EDTA и инкубируйте при 37 °C и 5%CO2 в течение 5-10 минут.
  3. Добавьте равное количество кДМ и смойте клетки с колбы. После отделения клеток переложите смесь в стерильную коническую центрифужную пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте клеточную суспензию при плотности 300 x g в течение 5 минут.
  4. Повторно суспендируйте клеточную суспензию в свежей cDMEM и подсчитайте клетки, чтобы определить конечную концентрацию в клетках/мл (Рисунок 1B).
  5. Мечение клеток красителем
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это необязательный шаг.
    1. Перелейте желаемое количество клеточной суспензии в стерильную коническую центрифужную пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте клеточную суспензию при 300 x g в течение 5 минут.
    2. Повторно суспендируйте клеточную гранулу в бессывороточной питательной среде для достижения конечной концентрации 1,0 x 106 клеток/мл. Добавьте 5 мкл флуоресцентного раствора для мечения клеток на мл клеточной суспензии и инкубируйте клеточную суспензию при 37 °C и 5%CO2 при вращении в течение 20 мин.<бр/> ПРИМЕЧАНИЕ: Бессывороточная питательная среда - DMEM, дополненная только 1% пен-стрептококком. Отрегулируйте время инкубации для равномерного окрашивания в зависимости от плотности клеточной суспензии.
    3. После завершения инкубации центрифугируйте клеточную суспензию при давлении 450 x g в течение 5 минут и повторно суспендируйте клеточную гранулу в свежем cDMEM. Повторите этот процесс стирки еще два раза (Рисунок 1C).
  6. Сфероидальная формация
    1. Суспендируйте клетки в свежем cDMEM до достижения конечной концентрации 1,0 x 105 клеток/мл в зависимости от количества клеток. Хорошо перемешайте клеточную суспензию и перелейте 100 мкл клеточной суспензии на лунку на 96-луночный планшет с агарозным покрытием.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Плотность суспензии ячеек настроена на достижение плотности 10 000 клеток на лунку в 96-луночном планшете с агарозным покрытием.
    2. Центрифугируйте планшет при 340 x g в течение 10 минут и инкубируйте при 37 °C и 5%CO2 в течение 5-9 дней (Рисунок 1D).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Меняйте питательную среду через день после покрытия, аккуратно удаляя 50% cDMEM и заменяя ее. Сфероиды MES подходят для модели сборки HEP-MES.

5. Образование сборки HEP-MES

ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к шагу 3 и шагу 4 для формирования HEP (Рисунок 2A) и сфероидов MES (Рисунок 2B).

  1. Соберите сфероиды HFF/MRC-5 по отдельности с помощью пипетки с 96-луночного планшета. Переложите их в стерильную коническую центрифужную пробирку объемом 15 мл, содержащую свежий cDMEM. Дайте сфероидам отстояться в пробирке в течение 5 минут, а затем аккуратно промойте теплым cDMEM.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте процесс полоскания аккуратно и осторожно.
  2. Аккуратно перенесите один сфероид HFF/MRC-5 с помощью пипетки в лунку, содержащую сфероид HepG2-WT. Добавьте ледяной фактор роста с пониженным (GFR) Matrigel (MG) или коллаген крысиного хвоста (CG) в соотношении 1:1 и 1:5 и инкубируйте при 37 °C при 5%CO2 в течение 3 часов (Рисунок 2C).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Разморозьте MG на ночь на льду в холодильнике при температуре от 2 °C до 8 °C. При работе с MG необходимо использовать предварительно охлажденные пипетки, наконечники и пробирки, так как при этом при температуре выше 10 °C образуется гель.
  3. После инкубации добавьте в каждую лунку по 75 мкл свежего cDMEM и инкубируйте при 37 °C при 5%CO2 в течение 2-3 дней.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Меняйте питательную среду через день после покрытия, аккуратно удаляя 50% cDMEM и заменяя ее. Ассамблоиды по-прежнему будут формироваться без смены среды в течение 3-4 дней. Формирование ассамблоида HEP-MES может происходить и без использования матрицы.

6. Образование сфероидальных капель HEP

ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к шагу 3 для формирования сфероидов HEP (Рисунок 3A). Для суспендирования сфероидов HEP в каплях можно использовать два различных материала. Эти два метода представлены ниже.

  1. Капли GFR MG
    1. Соберите сфероиды HepG2-WT по отдельности с помощью пипетки из 96-луночного планшета, позволив им оседать в стерильной конической центрифуге объемом 15 мл на льду.
    2. В отдельной стерильной конической центрифужной пробирке объемом 15 мл смешайте 1 мл ледяного GFR MG и охлаждающей контрольной питательной среды в соотношении 1:1. Отсадите среду с помощью пипетки из пробирки объемом 15 мл, содержащей сфероиды HepG2-WT, и поместите ее на лед.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Разморозьте MG на ночь на льду в холодильнике при температуре от 2 °C до 8 °C. При работе с MG убедитесь, что пипетки, наконечники и пробирки предварительно охлаждены, так как при этом при температуре выше 10 °C образуется гель.
    3. Добавьте раствор MG к сфероидам HepG2-WT, обеспечив равномерное распределение сфероидов внутри раствора MG.
    4. С помощью пипетки объемом 200 мкл соберите объем 15 мкл одного сфероида в растворе MG и медленно засейте его в чашку Петри диаметром 60 мм (Рисунок 3B).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если в одной капле засеяно более одного сфероида, удалите и повторно засейте должным образом. При необходимости сфероиды перемещаются, чтобы убедиться, что они находятся в центре капли. Для оптимального посева сфероидов рассмотрите возможность использования обратного пипетирования, чтобы свести к минимуму образование пузырьков воздуха.
  2. Крысиный хвост CG капли
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вся подготовка к компьютерной графике должна проводиться на льду.
    1. Соберите сфероиды HepG2-WT по отдельности с помощью пипетки из 96-луночного планшета, позволив им оседать в стерильной конической центрифужной пробирке объемом 15 мл на льду (рисунок 3B).
    2. В микроцентрифужную пробирку добавьте 358,8 мкл деионизированной воды, 100 мкл 10x PBS, 12,1 мкл 1 N NaOH и 529,1 мкл стокового CG крысиного хвоста для общего объема 1 мл<бр/> ПРИМЕЧАНИЕ: Стоковая CG крысиного хвоста всегда должна быть добавлена в конце.
    3. Добавьте раствор компьютерной графики к сфероидам HepG2-WT, обеспечивая равномерное распределение сфероидов внутри раствора компьютерной графики.
    4. С помощью пипетки объемом 200 мкл соберите объем 15 мкл одного сфероида в растворе компьютерной графики и медленно засейте его на чашку Петри диаметром 60 мм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если в одной капле засеяно более одного сфероида, удалите и повторно засейте должным образом. Сфероиды перемещаются таким образом, чтобы они находились в центре капли. Для оптимального посева сфероидов рассмотрите возможность использования обратного пипетирования, чтобы свести к минимуму образование пузырьков воздуха.
  3. Инкубируйте капли при температуре 37 °C и 5%CO2 в течение 60 минут перед добавлением питательной среды.
  4. Медленно добавьте 5 мл желаемой питательной среды в чашку Петри и инкубируйте при 37 °C, а также 5%CO2 со сменой питательной среды каждые три дня (Рисунок 3C).
    Примечание: M-CM использовали в анализе образования капель HEP.

7. Приготовление M-CM

  1. Соберите клетки HFF/MRC-5 и засейте их в колбу, обработанную культурой тканей T-75, с плотностью посева 5 000 клеток/см2 и инкубируйте колбу при 37 °C и 5%CO2 в течение 72 ч в 15 мл cDMEM.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следите за колбой в течение этого периода, чтобы обеспечить оптимальное здоровье клеток.
  2. После 72-часовой инкубации соберите M-CM в стерильную коническую центрифужную пробирку объемом 15 мл. Центрифугируйте M-CM при давлении 290 x g в течение 5 минут для удаления мусора и отфильтруйте с помощью фильтра 0,2 мкм для стерилизации (Рисунок 4A).
  3. Разбавьте M-CM полной питательной средой в соотношении разведения от 1:1 до 1:7 и добавьте к желаемому опыту (Рисунок 4B).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте M-CM в анализе образования капель HEP.

8. Формирование смешанного сфероида HEP-MES

ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к шагам 3.1-3.5. для приготовления суспензии клеток HepG2-WT и шагам 4.1-4.5 для приготовления суспензии клеток HFF/MRC-5.

  1. Суспензируйте клетки HepG2-WT в свежем cDMEM для достижения конечной концентрации 1,0 x 105 клеток/мл для каждой клеточной суспензии.
  2. Суспензируйте клетки HFF/MRC-5 в свежей cDMEM до достижения конечной концентрации 1,0 x 105 клеток/мл для каждой клеточной суспензии.
  3. Перенесите суспензии клеток HepG2-WT и HFF/MRC-5 в стерильную коническую центрифужную пробирку объемом 15 мл в соотношении 1:1 для получения конечной концентрации 2,0 x 105 клеток/мл. Тщательно перемешайте клеточную суспензию и переложите 100 мкл клеточной суспензии на лунку на 96-луночный планшет с агарозным покрытием.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Плотность суспензии ячеек установлена таким образом, чтобы получить 20 000 клеток на лунку в 96-луночном планшете с агарозным покрытием.
  4. Центрифугируйте планшет при 340 x g в течение 10 минут и инкубируйте при 37 °C и 5%CO2 в течение 1-2 дней (Рисунок 5C).
  5. Добавление фибриновых гидрогелей
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это необязательный этап, который выполняется через 72 часа после нанесения покрытия на смешанные сфероиды HEP-MES.
    1. В стерильной конической центрифужной пробирке объемом 15 мл смешайте фибриноген (3,25 мг/мл) и тромбин (12,5 ЕД/мл) в соотношении 4:1 для образования фибрина и положите пробирку на лед.
  6. Перенесите фибрин в каждую лунку с помощью предварительно существующего смешанного сфероида в соотношении 1:1 с текущим cDMEM в лунке. Инкубируйте планшет при 37 °C и 5%CO2 в течение 30 минут.
  7. После инкубации добавьте 75 μL свежего cDMEM в каждую лунку и инкубируйте при 37 °C при 5%CO2 в течение 1-2 дней.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Меняйте питательную среду через день после покрытия, аккуратно удаляя 50% cDMEM и заменяя ее.

9. Миграционная модель MES высокой плотности

ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к шагу 3 для получения сфероида HepG2-WT (Рисунок 6A) и шагам 4.1-4.5 для получения суспензии клеток HFF/MRC-5 (Рисунок 6B).

  1. Суспензируйте клетки HFF/MRC-5 в свежем cDMEM до достижения конечной концентрации 6,0 x 105 клеток/мл и поместите их на лед.
  2. Смешайте суспензию клеток HFF/MRC-5 и ледяной MG/CG в соотношении 1:1 (Рисунок 6C).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Плотность суспензии ячеек установлена таким образом, чтобы получить 30 000 клеток на лунку в 96-луночном планшете с агарозным покрытием. Разморозьте MG на ночь на льду в холодильнике при температуре от 2 °C до 8 °C. При работе с MG убедитесь, что пипетки, наконечники и пробирки предварительно охлаждены, так как при этом при температуре выше 10 °C образуется гель.
  3. Перенесите 100 мкл раствора HFF/MRC-5 и MG с помощью пипетки в лунку, содержащую сфероид HepG2-WT. Инкубируйте планшет при 37 °C и 5%CO2 в течение 30 минут.
  4. После инкубации добавьте по 75 мкл свежего cDMEM в каждую лунку и инкубируйте при 37 °C при 5%CO2 в течение 12 дней.

10. Статистический анализ

  1. Просматривайте и анализируйте данные, собранные с помощью Microsoft Excel или любого статистического/графического программного обеспечения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для статистической оценки между двумя группами был проведен t-критерий Стьюдента (тип II с двумя хвостами), и p-значения, равные или меньшие 0,05, были признаны имеющими статистическую значимость и определенными в тексте и подписях к рисункам/рисункам.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Растет интерес к синтетическим тканям для различных биомедицинских приложений, таких как моделирование заболеваний, поиск новых лекарственных средств и тканевая инженерия (Рисунок 7). В этой области органоиды, сфероиды и клетки, полученные из плюрипотентных стволовых клеток человека (hPSC), трансформируются в более синтетические, сложные и крупные ткани. Эта трансформация включает применение принципов морфогенеза, использование таких инструментов, как микрофабрикация, и интеграцию биоматриц,...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Настоящий протокол включает в себя несколько методов культивирования как простых, так и сложных ассамблоидов, а также методы индуцирования трехмерной коллективной миграции клеток в раннем органогенезе печени24,25. Изложенные протоколы выделяют несколько критически важных этапов, при этом формирование сфероидов является центральным аспектом всех методологий. Микролунки (96 или 384 лунки) используются либо с неадгезивными пластинами, либо с пластинами с агарозным п...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

NP является основателем Khufu Therapeutics, компании по разработке органоидов, которая разрабатывает методы лечения острых и хронических заболеваний печени.

Благодарности

Авторы хотели бы выразить искреннюю благодарность Огечи Огоке и Усаме Юсефу за их неоценимый вклад в данные, использованные в этой статье. NP был поддержан стартовыми фондами UB CBE, стипендией Марка Даймонда, Научным C024316 стволовых клеток штата Нью-Йорк, Центром стволовых клеток в регенеративной медицине UB (ScIRM), Центром клеточной, генной и тканевой инженерии Университета в Буффало (CGTE).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
384-луночный черный/прозрачный круглое дно сверхнизкое вложение сфероид микропластинаCorning3830
96-wl пластина для культивирования клеток плоская,TC,STRL,1/pk,100/CSЛабораторные продукты Продажи701001
агарозаSigma-AldrichA0576Низкое EEO
Axiovision Программное обеспечениеZEISSверсия 4
Чашка для клеточных культур, 60 мм, TC, STRL, 20/шт, 500 / CSПродажа лабораторных продуктов705001
колба для клеточных культур, 175 см и 2 см, Vent, TC, STRL, 5 / pk, 40 / CSЛабораторная продукция Продажа709003
колба для клеточных культур, 75 см и 2 см, Vent, TC, STRL, 5 / pk, 100 / CSЛабораторная продукция Продажа708003
центрифужные пробирки, 15mL, PP, STRL, град, 50 / BG, 500 / CSЛабораторная продукция ПродажаL226010
Коллаген I, Крысиный хвост, 100 мгCorning354236
DMEM, с высоким содержанием глюкозы, добавка GlutaMAX, пируватThermoFisher Scientific10569010
EVOS Флуоресцентный, фазово-контрастный микроскопEVOSAMEFC4300R1 360 x 1 024 пикселей с плотностью 1 024 пикселей
, сертифицированныйThermoFisher Scientific26140079
СШАФибриноген из плазмы крови человекаSigma-AldrichF4883-500MG500 мг
Hep G2 [HEPG2]ATCCHB-8065
HERAcell vios 160iThermoFisher Scientific51033557
HFF-1ATCCSCRC-1041
ImageJIJ1.46r; базальная
мембрана https://imagej.net/ij/ Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Матрица, без LDEV, 10 млCorning354230
MRC-5ATCCCCL-171
MSCGMT Мезенхимальные стволовые клетки человека BulletKitLonzaPT-3001
Пенициллин-стрептомицин (10 000 Ед/мл)ThermoFisher Scientific15140122
Тромбин из плазмы человекаSigma-AldrichT6884-100UN100 единиц
Трипсин-ЭДТА (0,05%), фенол красныйThermoFisher Scientific25300062
Трипсин-ЭДТА (0,25%), фенолкрасный ThermoFisher Scientific25200072
Vybrant DiD Решение для мечения клетокThermoFisherScientific V22887
Vybrant DiI Решение для мечения клетокThermoFisher ScientificV22885
Vybrant DiO для мечения клеток РешениеThermoFisher ScientificV22886
Флуоресцентный микроскоп Zeiss AxioZEISSSE64, плотность 1,344 & 1,024 пикселей

Ссылки

  1. Bort, R., Signore, M., Tremblay, K., Martinez Barbera, J. P., Zaret, K. S. Hex homeobox gene controls the transition of the endoderm to a pseudostratified, cell emergent epithelium for liver bud development. Dev Biol. 290 (1), 44-56 (2006).
  2. Gualdi, R., et al. Hepatic specification of the gut endoderm in vitro: Cell signaling and transcriptional control. Genes Dev. 10 (13), 1670-1682 (1996).
  3. Ogoke, O., et al. Spatiotemporal imaging and analysis of mouse and human liver bud morphogenesis. Dev Dyn. 251 (4), 662-686 (2022).
  4. Ogoke, O., Oluwole, J., Parashurama, N. Bioengineering considerations in liver regenerative medicine. J Biol Eng. 11, 46(2017).
  5. Petkov, P. M., Kim, K., Sandhu, J., Shafritz, D. A., Dabeva, M. D. Identification of differentially expressed genes in epithelial stem/progenitor cells of fetal rat liver. Genomics. 68 (2), 197-209 (2000).
  6. Yang, M. H., et al. Comprehensive analysis of the independent effect of twist and snail in promoting metastasis of hepatocellular carcinoma. Hepatology. 50 (5), 1464-1474 (2009).
  7. Gupta, S., et al. Entry and integration of transplanted hepatocytes in rat liver plates occur by disruption of hepatic sinusoidal endothelium. Hepatology. 29 (2), 509-519 (1999).
  8. Koenig, S., Stoesser, C., Krause, P., Becker, H., Markus, P. M. Liver repopulation after hepatocellular transplantation: Integration and interaction of transplanted hepatocytes in the host. Cell Transplant. 14 (1), 31-40 (2005).
  9. Rajvanshi, P., Kerr, A., Bhargava, K. K., Burk, R. D., Gupta, S. Studies of liver repopulation using the dipeptidyl peptidase iv-deficient rat and other rodent recipients: Cell size and structure relationships regulate capacity for increased transplanted hepatocyte mass in the liver lobule. Hepatology. 23 (3), 482-496 (1996).
  10. Matchett, K., et al. Multimodal decoding of human liver regeneration. bioRxiv. , 10.1101/2023.02.24.529873 2023.2002.2024.529873 (2023).
  11. Matsumoto, K., Yoshitomi, H., Rossant, J., Zaret, K. S. Liver organogenesis promoted by endothelial cells prior to vascular function. Science. 294 (5542), 559-563 (2001).
  12. Sosa-Pineda, B., Wigle, J. T., Oliver, G. Hepatocyte migration during liver development requires prox1. Nat Genet. 25 (3), 254-255 (2000).
  13. Suzuki, A., Sekiya, S., Büscher, D., Izpisúa Belmonte, J. C., Taniguchi, H. Tbx3 controls the fate of hepatic progenitor cells in liver development by suppressing p19ARF expression. Development. 135 (9), 1589-1595 (2008).
  14. Rossi, J. M., Dunn, N. R., Hogan, B. L., Zaret, K. S. Distinct mesodermal signals, including BMPs from the septum transversum mesenchyme, are required in combination for hepatogenesis from the endoderm. Genes Dev. 15 (15), 1998-2009 (2001).
  15. Ng, L., et al. Suppression of actopaxin impairs hepatocellular carcinoma metastasis through modulation of cell migration and invasion. Hepatology. 58 (2), 667-679 (2013).
  16. Fransvea, E., Angelotti, U., Antonaci, S., Giannelli, G. Blocking transforming growth factor-beta up-regulates e-cadherin and reduces migration and invasion of hepatocellular carcinoma cells. Hepatology. 47 (5), 1557-1566 (2008).
  17. Zhao, Y., et al. RNAi silencing of c-myc inhibits cell migration, invasion, and proliferation in hepg2 human hepatocellular carcinoma cell line: C-myc silencing in hepatocellular carcinoma cell. Cancer Cell Int. 13 (1), 23(2013).
  18. Fitamant, J., et al. Yap inhibition restores hepatocyte differentiation in advanced HCC, leading to tumor regression. Cell Rep. 10 (10), 1692-1707 (2015).
  19. Xue, T. C., et al. Goosecoid promotes the metastasis of hepatocellular carcinoma by modulating the epithelial-mesenchymal transition. PLoS One. 9 (10), e109695(2014).
  20. Biname, F., Lassus, P., Hibner, U. Transforming growth factor beta controls the directional migration of hepatocyte cohorts by modulating their adhesion to fibronectin. Mol Biol Cell. 19 (3), 945-956 (2008).
  21. Chen, J. S., et al. MiR-338-3p inhibits epithelial-mesenchymal transition and metastasis in hepatocellular carcinoma cells. Oncotarget. 8 (42), 71418-71429 (2017).
  22. Yang, C., et al. MiR-1301 inhibits hepatocellular carcinoma cell migration, invasion, and angiogenesis by decreasing Wnt/beta-catenin signaling through targeting BCL9. Cell Death Dis. 8 (8), e2999(2017).
  23. Zeng, Y. B., et al. MiRNA-135a promotes hepatocellular carcinoma cell migration and invasion by targeting forkhead box o1. Cancer Cell Int. 16, 63(2016).
  24. Ogoke, O., et al. Dynamic changes in the niche and transcription trigger early murine and human pluripotent stem cell-derived liver organogenesis. bioRxiv. , 10.1101/2022.07.24.501313 (2023).
  25. Ogoke, O., et al. Modeling liver organogenesis by recreating three-dimensional collective cell migration: A role for TGF-beta pathway. Front Bioeng Biotechnol. 9, 621286(2021).
  26. Kanton, S., Pasca, S. P. Human assembloids. Development. 149 (20), dev201120 (2022).
  27. Bayley, H., Cazimoglu, I., Hoskin, C. E. G. Synthetic tissues. Emerg Top Life Sci. 3 (5), 615(2019).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Методы культивирования in vitro для моделирования органогенеза печени, построения ассамблоидов и конструирования синтетических тканей с использованием клеточных линий человека
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.