Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Выделение стромальных клеток из кроветворных органов

1.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/66231

⸱

26 января 2024 г.

 ,  ,  , 
1Center for Regenerative Medicine, Massachusetts General Hospital, 2Harvard Stem Cell Institute, 3Department of Stem Cell and Regenerative Biology, Harvard University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем протоколы, которые позволяют выделить стромальные клетки из костей мыши, костного мозга, тимуса и ткани тимуса человека, совместимые с мультиомикой одиночных клеток.

Аннотация

Секвенирование одиночных клеток позволило картировать гетерогенные клеточные популяции в строме кроветворных органов. Эти методологии обеспечивают линзу, через которую можно изучать ранее неразрешенную гетерогенность в равновесном состоянии, а также изменения в представлении типа клеток, вызванные внешними стрессами или во время старения. Здесь мы представляем пошаговые протоколы выделения высококачественных популяций стромальных клеток из мышиной и тимуса человека, а также мышиной кости и костного мозга. Клетки, выделенные с помощью этих протоколов, подходят для создания высококачественных наборов данных мультиомики для отдельных клеток. Здесь обсуждается влияние переваривания образцов, истощения гемопоэтической линии, анализа/сортировки FACS, а также то, как эти факторы влияют на совместимость с секвенированием одиночных клеток. С примерами профилей FACS, указывающих на успешную и неэффективную диссоциацию и выход стромальных клеток ниже по потоку в анализе после секвенирования, предоставляются узнаваемые указатели для пользователей. Учет специфических требований к стромальным клеткам имеет решающее значение для получения высококачественных и воспроизводимых результатов, которые могут продвинуть знания в этой области.

Введение

У здорового взрослого человека de novo производство клеток крови происходит в костном мозге и вилочковой железе. Стромальные клетки в этих участках необходимы для поддержания кроветворения, но строма составляет менее 1% ткани 1,2,3,4. Таким образом, получение чистых изолятов стромы, поддерживающих кроветворение, представляет собой значительную проблему, особенно для мультиомики одиночных клеток, которая требует целесообразной обработки для получения образцов высокого качества. Компоненты различных коктейлей для пищеварения могут мешать определенным этапам мультиомного анализа 5,6. Представленные здесь протоколы подробно описывают выделение широкого спектра стромальных клеток из тканей костного мозга и тимуса.

Нарушения стромальных составляющих как в костном мозге, так и в тимусе приводят к глубокому нарушению развития клеток крови и могут привести к злокачественным новообразованиям 7,8,9. Строма, поддерживающая кроветворение, повреждается после цитотоксического кондиционирования и трансплантации костного мозга, что приводит к снижению секреции цитокинов и факторов роста, поддерживающих гемопоэтические стволовые клетки и клетки-предшественники (ГСК)2,10,11. Кроме того, старение влияет на стромальные клетки костного мозга и тимуса, что, вероятно, способствует старению гемопоэтических фенотипов. Тимус является первым органом, который подвергается обширной возрастной инволюции. Жировая и фиброзная ткань начинают замещать поддерживающую строму Т-клеток уже в начале периода полового созревания 12,13. В костном мозге с возрастом увеличивается содержание адипоцитов, а сосудистые и эндостальные ниши значительно ремоделируются 14,15,16.

Чтобы изучить поддерживающую строму кроветворения при множественных стрессовых состояниях и в случае тимуса как человеческой, так и мышиной ткани, мы оптимизировали ранее опубликованные протоколы пищеварения 1,2,8,17,18. Эти протоколы обеспечивают эффективную и воспроизводимую изоляцию клеток и совместимы с секвенированием РНК одиночных клеток (scRNAseq) и другими типами мультиомики.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все работы с человеческими тканями проводились после одобрения Совета по внутреннему контролю Массачусетской больницы общего профиля (IRB). Все процедуры на животных проводились в соответствии с рекомендациями Комитета по уходу за животными и их использованию (IACUC) Массачусетской больницы общего профиля. В настоящем исследовании использовались мыши C57Bl/6 в возрасте 8-10 недель, а также самцы и самки. Животные были получены из коммерческого источника (см. Таблицу материалов).

1. Подготовка тимусовой ткани мыши

  1. Приготовьте следующие буферы и растворы.
    1. Среда 199 (M199) с 2% (v/v) фетальной бычьей сывороткой (FBS) (см. Таблицу материалов).
    2. Коктейль мышиной диссоциации: 0,5 В.В./мл Либераза ТМ и 6.3 Ед/мл ДНаза I в М199 + 2% FBS (см. Таблицу материалов).
    3. M199 с 2% (б/в) сывороточного альбумина крупного рогатого скота (BSA).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Среда, содержащая FBS, может быть заменена на BSA для улучшения качества РНК.
  2. Проведение рассечения мышиной тимуса
    1. Усыпьте мышь путем удушенияCO2 (в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами) и положите ее на спину. Намочите мех на груди, распылив 70% этанола, и приступайте к вскрытию грудной полости.
    2. Осторожно рассеките вилочковую железу, сделав сначала хирургическими ножницами поперечный разрез чуть ниже грудной клетки. Разрежьте ребра с каждой стороны мыши до ключицы. Затем разрежьте диафрагму так, чтобы грудная стенка могла быть освобождена. Поднимите ребра с помощью пары щипцов, чтобы обнажить грудную полость.
      1. Тимус — это белый желчнолистный орган, расположенный в верхней части полости, прямо над сердцем. Удерживайте вилочковую железу щипцами и аккуратно разрежьте соединительную ткань, которая удерживает тимус на месте. Рассеченную ткань тимуса поместить в лунку 6-луночного планшета с М199 + 2% FBS на льду.
        ПРИМЕЧАНИЕ: При работе со старыми или подвергшимися воздействию облучения мышами или мутантными штаммами с дефектами тимуса тимус может быть настолько мал, что для надежного иссечения органа требуется диссекционный микроскоп.
    3. С помощью диссекционного микроскопа удалите любые экстратимические ткани с помощью тупых щипцов и ножниц с микропружинами.
  3. Провести ферментативную диссоциацию ткани тимуса мыши (30 мин с шагом 10 мин)
    1. Поместите очищенный тимус в колпачок пробирки объемом 15 мл и мелко измельчите ткань стерильными хирургическими ножницами.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Измельчение ткани в колпачке трубки, которая будет использоваться для пищеварения, сводит к минимуму потерю ткани из-за переноса из одного контейнера в другой. Это очень важно при работе со старыми или подвергшимися воздействию радиации мышами или мутантными штаммами с дефектами тимуса. Небольшой размер тимуса в этих условиях обуславливает необходимость снижения потерь материала везде, где это возможно.
    2. Добавьте 2 мл коктейля для диссоциации мышей в 15 мл пробирки, прикрепите колпачок, содержащий кусочки тимуса, и переверните 5 раз, чтобы убедиться, что ткань снова суспендирована в диссоциативном коктейле.
    3. Чтобы предотвратить протекание, оберните крышку трубки парафиновой пленкой. Затем поместите трубку горизонтально на водяную баню при температуре 37 °C и встряхивайте со скоростью 250 об/мин. Выдерживать в течение 10 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Успех протокола сбраживания зависит от инкубации, проводимой при 37 °C и с перемешиванием. Описанный протокол был оптимизирован с помощью встряхивающей водяной бани. Если это невозможно, могут подойти другие подходы, которые позволяют перемешивать в условиях отопления, но мы рекомендуем сначала оптимизировать протокол для этих параметров.
    4. Поместите пробирку объемом 15 мл в штатив и дайте кусочкам ткани осесть. Осторожно извлеките надосадочную жидкость и пропустите ее через клеточное ситечко 70 мкм в ледяную пробирку объемом 50 мл.
    5. Повторите шаги 2-4 дважды, чтобы получить в общей сложности 3 раунда пищеварения. Ткань должна быть более или менее полностью диссоциирована к концу последней инкубации.
    6. Добавьте в собранную клеточную суспензию 20 мл М199 + 2% FBS. Отжим при 500 x g в течение 5 минут при 4 °C.
    7. Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте в соответствующем объеме M199 + 2% FBS. Затем приступаем к подсчету клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Объем M199 + 2% FBS для ресуспендирования будет зависеть от состояния тимуса. Для мышей в возрасте 6-10 недель мы рекомендуем повторно суспендировать ткань в 3-4 мл M199 + 2% FBS. Однако для экспериментов с использованием старых или радиационно обработанных тканей или мутантных штаммов с дефектами тимуса малый размер тимуса потребует меньших объемов в диапазоне от 0,1 до 1 мл.
    8. Подсчет клеток проводится, разбавляя клеточную суспензию в соотношении 1:2 в 0,4% (мас./об.) растворе трипанового синего. Загрузите элементы в гемоцитометр и посчитайте под светлопольным микроскопом. Подсчитайте неокрашенные клетки, чтобы определить количество живых клеток на миллилитр, и количество окрашенных в синий цвет клеток, чтобы оценить жизнеспособность образца.
  4. Выполнение флуоресцентно-активированной сортировки клеток стромы тимуса мыши
    1. Вращайте ячейки при 500 x g в течение 5 минут при 4 °C. Ресуспендируйте клетки в концентрации 5 x 10,7 клеток/мл в M199 + 2% FBS с добавлением 25 Ед/мл ингибитора протекторной РНКазы (см. Таблицу материалов).
    2. Добавьте мышиный Fc Block (см. Таблицу материалов) в концентрации 2 мкг/мл и инкубируйте в течение 10 мин при 4 °C.
    3. Окрашивайте клетки следующими антителами: CD45-PE/Cy7 (4 мкг/мл), Ter119-PE (4 мкг/мл), CD31-BUV737 (2 мкг/мл) и EpCam-BV711 (2 мкг/мл) (см. Таблицу материалов) в течение 30 мин при 4 °C.
    4. Промойте образцы в M199 + 2% BSA и уменьшите при 500 x g в течение 5 минут при 4 °C.
    5. Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в M199 + 2% BSA, содержащие краситель для жизнеспособности, такой как DAPI (0,5 мкг/мл) или 7-AAD (1 мкг/мл) (см. Таблицу материалов). Приступайте к выделению стромальных клеток тимуса с помощью FACS в соответствии с установленными протоколами19.

2. Подготовка ткани тимуса человека

  1. Приготовьте следующие буферы и растворы.
    1. Средний 199 (M199) с 2% (v/v) FBS.
    2. M199 с 1,5% (w/v) BSA.
    3. Коктейль диссоциации человека: 1 мг/мл коллагеназы в/в и 2 мг/мл диспазы и 6,3 ед/мл ДНКазы I в M199 +1,5% БСА (см. таблицу материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Последним этапом пищеварения при подготовке ткани тимуса человека является трипсин. Поэтому важно, чтобы все этапы до этого момента выполнялись в буфере, содержащем БСА, поскольку FBS будет ингибировать активность трипсина.
  2. Проведение изоляции ткани тимуса человека
    1. Поместите тимус человека (собранный в соответствии с ранее опубликованным методом19) в подходящий объем М199 + 1,5% БСА и храните его на льду до начала обработки.
    2. При работе с тканью тимуса человека обращайтесь с ней так, как если бы она была потенциально инфекционной, выполняя работу в капюшоне для культуры тканей и соблюдая стандартные меры предосторожности в соответствии с рекомендациями CDC20.
    3. Поместите салфетку в чашку Петри диаметром 10 см с 10 мл ледяного M199 + 1,5% BSA. С помощью стерильных щипцов и ножниц тщательно очистите внетимический жир или ткань, которые были повреждены при извлечении органа.
    4. С помощью хирургических ножниц и щипцов разрежьте тимус на1 см 3 кубика и с помощью поршня шприца объемом 10 мл аккуратно надавите на кусочки. Это приведет к высвобождению части развивающихся тимоцитов, тем самым уменьшая объем ткани, подлежащей перевариванию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сохраните высвобожденную гемопоэтическую фракцию, если необходим последующий анализ стадий развития тимоцитов. Однако не стоит сочетать эту фракцию с фракцией стромальных клеток, образующейся при ферментативном переваривании. Было замечено, что объединение двух фракций значительно увеличивает риск образования закупорки в клеточной суспензии, что в конечном итоге снижает выход стромальных клеток. Во время бережного раздавливания ткани теряется небольшое количество стромальных клеток.
  3. Провести ферментативную диссоциацию ткани тимуса человека (90 мин с шагом 30 мин)
    1. Перенесите примерно 5 мг слегка измельченных кусочков ткани тимуса в колпачок конической трубки объемом 50 мл. Затем разрежьте ткань тонко с помощью стерильных хирургических ножниц.
    2. Внесите 8 мл коктейля диссоциации человека в пробирку объемом 50 мл, прикрепите колпачок, содержащий измельченную ткань тимуса человека, а затем аккуратно переверните пробирку 5 раз, чтобы убедиться, что вся ткань смешалась с ферментным коктейлем.
    3. Зафиксируйте крышку трубки парафиновой пленкой, чтобы предотвратить протекание. Инкубируйте пробирку горизонтально на встряхивающей (250 об/мин) водяной бане при температуре 37 °C в течение 30 минут.
    4. Поместите пробирку объемом 50 мл в штатив и дайте кусочкам ткани тимуса человека осесть, прежде чем удалить надосадочную жидкость и пропустить ее через клеточное ситечко 70 мкм в новую пробирку объемом 50 мл, помещенную на лед.
    5. Повторите шаги 2.3.2-1.3.4 в общей сложности два раунда пищеварения с коктейлем диссоциации человека.
    6. После того, как второй раунд пищеварения будет завершен, добавьте еще 8 мл коктейля диссоциации человека к оставшимся тканям. Затем также пипеткой введите 2 мл 0,25% трипсина в пробирку для диссоциации тканей. Инкубировать еще 30 минут при температуре 37 °C, встряхивая при 250 об/мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Абсолютно необходимо, чтобы время переваривания человеческих тканей составляло не менее 90 минут, так как более короткое время инкубации приводит к резкому снижению выхода стромальных клеток.
    7. После завершения последней стадии инкубации объедините клеточную суспензию и оставшиеся фрагменты ткани с надосадочной жидкостью, собранной на предыдущих стадиях, пропустив через клеточное сетчатое фильтр размером 70 мкм. Добавьте в образец 3 мл FBS, чтобы прервать реакцию трипсина, и положите на лед.
    8. Перейдите к подсчету ячеек, как описано в шаге 1.3.
  4. Выполнение сортировки флуоресцентных активированных клеток стромы тимуса человека
    1. Раскрутите клеточную суспензию тимуса человека и ресуспендируйте в концентрации 5 x 107 клеток/мл в M199 + 2% FBS с добавлением 25 Ед/мл ингибитора протекторной РНКазы.
    2. Инкубировать с человеческим Fc-блоком (5 мкг/мл) (см. Таблицу материалов) в течение 10 мин при 4 °C.
    3. Окрашивание образца в течение 30 мин при температуре 4 °C с помощью CD45-BV711 (2,5 мкг/мл), CD235a-BV711 (2,5 мкг/мл), Lineage-cocktail-FITC (3,76 мкг/мл), CD66b-FITC (20 мкл/100 мкл), CD8-APC/Cy7 (5 мкл/100 мкл), CD4-BV605 (5 мкл/100 мкл образец), CD31-PE/Dazzle594 (10 мкг/мл) и EpCam-BV421 (2,5 мкг/мл) (см. Таблицу материалов).
    4. Промойте образцы в M199 + 1,5% BSA и уменьшите при 500 x g в течение 5 минут при 4 °C.
    5. Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в M199 + 1,5% BSA, содержащем краситель для жизнеспособности, такой как DAPI (0,5 мкг/мл) или 7-AAD (1 мкг/мл). Приступайте к выделению стромальных клеток тимуса с помощью FACS в соответствии с установленными протоколами19.

3. Подготовка костной ткани и костного мозга мыши

ПРИМЕЧАНИЕ: Фракции костей и костного мозга получают в двух отдельных реакциях пищеварения для получения максимальной чистоты стромальных клеток и оптимальной диссоциации тканей. После этапов разложения образцы могут быть объединены и отсортированы в один стромальный компартмент.

  1. Приготовьте следующие буферы и растворы.
    1. M199 с 2% (v/v) FBS.
    2. Коктейль диссоциации мышей B&M (костный и костный мозг): Stemxyme 2 мг/мл, Disspase 1 мг/мл и 10 U/мл DNase I (см. Таблицу материалов) в M199 +2% FBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте смесь для диссоциации B&M в свежем виде и держите смесь на льду до использования.
    3. M199 с 0,5% (w/v) BSA.
    4. Фосфатно-солевой буфер (PBS) с 0,5% (w/v) BSA.
    5. M199 с 2% (w/v) сывороточного альбумина крупного рогатого скота (BSA) и 2 мМ ЭДТА.
      Примечание: Среда, содержащая FBS, может быть заменена на BSA для улучшения качества РНК.
  2. Проведение отделения костного мозга у мышей
    1. Усыпьте мышь путем удушенияCO2 (в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами). Сбрызните 70% этанолом, чтобы намочить шерсть.
    2. Осторожно удалите бедренную кость, большеберцовую кость, таз и плечевую кость с каждой стороны и поместите их в лунку, содержащую M199 + 2% FBS на льду21,22.
    3. Удалите всю мышечную, связочную и хрящевую ткань с помощью салфеток, чтобы свести к минимуму повреждение кости и сохранить надкостничный слой. Поместите их в новую лунку с М199 + 2% FBS на льду.
    4. Используйте скальпель и разрежьте пластины роста длинных костей, чтобы удалить эпифиз, и поместите его в 10-сантиметровую посуду с M199 + 2% FBS на льду.
    5. Промойте костный мозг из костей до бледно-белого цвета. Используйте иглу 28 G и шприц объемом 10 мл, наполненный 10 мл M199 + 2% FBS, чтобы промыть костный мозг в пробирку объемом 15 мл на льду. Поместите промытую косточку в 10-сантиметровую посуду с эпифизом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Полное промывание костного мозга для полного разделения тканей приведет к лучшей подготовке образца.
  3. Провести ферментативную диссоциацию ткани костного мозга мыши (всего 30 мин с шагом 10 мин)
    1. Оставьте пробирку объемом 15 мл стоять вертикально на льду до тех пор, пока костный мозг не опустится на дно пробирки. Медленно удалите 10 мл M199 + 2% FBS с помощью пипетирования.
    2. Добавьте 4 мл диссоциативного коктейля B&M в пробирку объемом 15 мл и поставьте на водяную баню при температуре 37 °C (без встряхивания) на 10 минут.
    3. Через 5 минут трижды переверните трубку и поставьте ее обратно на водяную баню.
    4. По прошествии первых 10 минут убедитесь, что гранула находится на дне, и соберите надосадочную жидкость, фильтруя ее через сетчатое фильтр 70 мкм в ледяную пробирку объемом 50 мл. Добавьте 2 мл свежего диссоциативного коктейля B&M к оставшейся грануле BM и поставьте ее обратно на водяную баню.
    5. Диссоциируйте оставшиеся кусочки костного мозга с помощью энергичного пипетирования с помощью пипетки объемом 1 мл. Соберите всю полученную клеточную суспензию в ту же пробирку, что и на предыдущих этапах. Добавьте в собранную клеточную суспензию 20 мл M199 + 0,5% BSA + 2 mM EDTA.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На шаге 3.3.5 буфер, добавленный после окончательного расщепленного образца, содержит ЭДТА, который помогает ингибировать дальнейшую ферментативную активность.
  4. Выполняют истощение гемопоэтических клеток костного мозга мышиной ткани.
    1. Центрифугируйте ячейки при давлении 500 x g в течение 5 мин при 4 °C. Ресуспендировать в 500 мкл PBS + 0,5% БСА с антителами к биотину (5 мг/мл), нацеленными на CD45, Ter119, CD11b, Gr1, B220 и CD3 (см. Таблицу материалов). Переложите в трубочку с круглым дном и крышкой.
    2. Выдерживать на орбитальном шейкере в течение 10 минут при комнатной температуре в темноте.
    3. Тщательно перебейте магнитные шарики и добавьте в трубку 25 μл магнитных шариков.
    4. Выдерживать на орбитальном шейкере в течение 5 минут при комнатной температуре в темноте.
    5. Поместите пробирку в соответствующий магнит на 2-3 минуты и соберите надосадочную жидкость в свежую пробирку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После этого этапа костный мозг можно объединить или хранить отдельно от костной фракции. Если истощение линии прошло успешно, полученная клеточная суспензия должна быть лишена эритроцитов.
  5. Проводят ферментативную диссоциацию костной ткани мыши.
    1. Разбейте кости на более мелкие кусочки в чашке диаметром 10 см с плоским колпачком пробирки объемом 50 мл. Отфильтруйте надосадочную жидкость через клеточный фильтр 70 мкм, чтобы изолировать костные фрагменты внутри фильтра.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы для фрагментации костей можно использовать ступку и пестик. Этот вариант, однако, имеет тенденцию к образованию большего количества мусора и снижению жизнеспособности стромальных клеток, когда кость измельчена, а не сломана. Клетки стромы все еще прикреплены к кости и находятся в ней, и надосадочная жидкость, содержащая гемопоэтические клетки, должна быть отброшена.
    2. С помощью ножниц разрежьте костные отломки в клеточном ситечке. Это увеличит площадь поверхности для более эффективной ферментативной диссоциации. Промойте кость 5 мл M199 + 2% FBS.
    3. Поместите костную фракцию в 5 мл мышиной B&M диссоциации (см. Таблицу материалов), смешайте в новой пробирке объемом 50 мл.
    4. Чтобы предотвратить протекание, оберните крышку трубки парафиновой пленкой. Затем поместите трубку горизонтально на водяную баню при температуре 37 °C со скоростью 120 об/мин, встряхивая в течение 30 минут.
    5. После разложения добавьте 25 мл M199 + 0,5% BSA + 2 мМ ЭДТА и отфильтруйте надосадочную жидкость, содержащую стромальные клетки, через клеточное ситечко 70 мкм в ледяную пробирку объемом 50 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что образовавшиеся костные фрагменты заметно уменьшились в результате пищеварения. На шаге 3.5.5 буфер, добавленный после окончательного расщепленного образца, содержит ЭДТА, который помогает ингибировать дальнейшую ферментативную активность.
  6. Проведите флуоресцентную сортировку активированных клеток костной и костной стромы мышиного мозга.
    1. Вращайте ячейки при 500 x g в течение 5 минут при 4 °C.
    2. Ресуспендируют в мышином Fc Block в концентрации 10 мкг/мл в PBS + 0,5% BSA + 2 мМ ЭДТА и инкубируют в течение 10 мин при 4 °C.
    3. Окрашивают клетки (до 10 миллионов клеток/100 мкл общего объема окрашивания) следующими антителами: CD45-PE/Cy7 (1 мкг/мл), Ter119-PE/Cy7 (1 мкг/мл), CD31-BV421 (0,66 мкг/мл), CD140a-APC (2 мкг/мл), Sca1-AF700 (0,66 мкг/мл), CD51-PE (2 мкг/мл), CD105-PE/dazzle (2 мкг/мл) (см. Таблицу материалов).
    4. Оставьте Кальцеин-АМ для равновесия до комнатной температуры и повторно суспендируйте в 50 мкл ДМСО. Готовьте свежие продукты для каждого использования. После повторного суспензирования хранить при комнатной температуре. Предварительно разведите кальцеин в PBS (0,1 мг/мл) перед добавлением в уже ресуспендированный образец (20 мкг/мл) в коктейль окрашивания антител и инкубируйте в течение 20-30 мин при 4 °С в темноте.
    5. Промойте образцы в PBS + 0,5% BSA + 2 мМ ЭДТА и центрифугируйте при 500 x g в течение 5 минут при 4 °C.
    6. Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в PBS + 0,5% BSA + 2 мМ ЭДТА. Приступать к выделению стромальных клеток костного и костного мозга методом FACS в соответствии с установленными протоколами19.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Эти протоколы позволяют получить воспроизводимые разновидности стромальных клеток из тимуса и костного мозга, пригодные для проточного цитометрического анализа, а также для мультиомики одиночных клеток, такой как секвенирование scRNA. Мышиная ткань тимуса претерпевает значительное ремоделирование в ответ на стрессоры, такие как цитотоксическое кондиционирование, которое предшествует трансплантации костного мозга, или естественный процесс старения. Как следствие, клеточностность тимуса резко снижается в обоих этих условия...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Стромальные клетки в кроветворных органах имеют решающее значение для нормального производства крови, и нарушения стромы кроветворения могут привести к серьезным нарушениям поддержания кроветворения и реакции на стресс 9,23,24. Понимание гемопоэтических стромальных клеток имеет важное значение для понимания гематологических заболеваний 7,9,10,24 и для возможности разработки терапевтических

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

D.T.S. является директором и акционером компаний Agios Therapeutics и Editas Medicines; основателем, директором, акционером и членом научно-консультативного совета Magenta Therapeutics и LifeVault Bio, акционером и основателем Fate Therapeutics и Garuda Therapeutics, а также директором, основателем и акционером Clear Creek Bio, консультантом FOG Pharma, Inzen Therapeutics и VCanBio, а также получателем спонсорского финансирования исследований от Sumitomo Dianippon. Д.Т.С и К.Г. являются изобретателями патентных US20220143099A1.

Благодарности

Нам оказали экспертную техническую поддержку специалисты со стороны центра проточной цитометрии HSCI-CRM в Массачусетской больнице общего профиля и центра Bauer Core Facility в Гарвардском университете. Т.К. и К.Г. были поддержаны Шведским исследовательским советом, а К.М. — Немецким научно-исследовательским обществом. Мы благодарим Сергея Исаева и И-Сю Ли за помощь в анализе данных секвенирования РНК одиночных клеток.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,25% Трипсин-ЭДТАThermo Fisher Scientific25200-072
7AAD (7-аминоактиномицин D)BD Biosciences559925
Античеловеческий Линейный Коктейль 3-FITCBD Biosciences643510
Бычья сыворотка АльбуминМиллипор SigmaA9647
C57Bl/6 мышейДжексон664Самцы или самки, 8-12 недельная давность
Кальцеин Fisher Scientific65-0853-78
Коллагеназа IVMillipore SigmaC5138
Стерильные клеточные фильтры Corning, белый, размер ячеек: 70 & микро; mFisher Scientific08-771-2
Disspase IIThermo Fisher Scientific17105041
Dnase I SolutionThermo Fisher Scientific90083  2500 Ед/мл
мышиного стрептавидина Easysep RapidSpheres Изоляционный наборStemCell Technologies19860
Фетальная сыворотка крупного рогатого скотаGibcoA31605-01Квалифицированный One Shot
Human Fc BlockBD Biosciences564220
Liberase TM Millipore Sigma5401127001Research
Grade Medium 199Gibco12350
Мышь против человека CD235a-BV77BD Biosciences740785
Мышь против человека CD31-PE/Dazzle594Biolegend303130
Мышь против человека CD45-BV77Biolegend304050
Мышь против человека CD4-BV605BD Biosciences562658
Мышь античеловеческая CD66b-FITCBD Biosciences555724
Мышь античеловеческая CD8-APC/Cy7BD Biosciences557760
Мышь античеловеческая EpCam-BV421Biolegend324220
Протекторный ингибитор РНКазыMillipore Sigma3335402001
крыса антимышиная CD105-PE /dazzle594Biolegend120424
Крыса анти-мышь CD11b-БиотинBiolegend101204
Крыса антимышь CD140a-APCFisher Scientific17-1401-81
Крыса антимышь CD16/CD32 (мышиный блок BD Fc)BD Biosciences553142
Крыса антимышиный CD31-BUV737BD Biosciences612802
Крыса антимышиный CD31-BV421Biolegend102424
Крысиный антимышиный CD3-БиотинBiolegend100244
Крысиный антимышиный CD45.2-БиотинBiolegend109804
Крысиный антимышиный CD45-PE/Cy7Biolegend103114
Крысиный антимышиный CD45-PE/Cy7Biolegend103114
Крысиный антимышиный CD45-PE/Cy7Biolegend103114
Крысиный антимышиный CD45R/B220-БиотинBiolegend103204
Крысиный антимышиный CD51-PEBiolegend104106
Крысиный антимышиный EpCam-BV711BD Biosciences563134
Крысиный антимышиный Ly-6A/E(Sca-1)-AF700Biolegend108142
Крысиный антимышиный Ly-6G/Ly-6C(Gr1)-БиотинBiolegend 108404
Крысиный антимышиный Ter119-БиотинBiolegend116204
Крысиный антимышиный Ter119-PEBiolegend116208
Крысиный антимышиный Ter119-PE/Cy7Biolegend116222
Stemxyme LS004107Уортингтона
Биохимический

Ссылки

  1. Baryawno, N., et al. A cellular taxonomy of the bone marrow stroma in homeostasis and leukemia. Cell. 177 (7), 1915-1932 (2019).
  2. Severe, N., et al. Stress-induced changes in bone marrow stromal cell populations revealed through single-cell protein expression mapping. Cell Stem Cell. 25 (4), 570-583 (2019).
  3. Han, J., Zuniga-Pflucker, J. C. A 2020 view of thymus stromal cells in t cell development. J Immunol. 206 (2), 249-256 (2021).
  4. Park, J. E., et al. A cell atlas of human thymic development defines t cell repertoire formation. Science. 367 (6480), (2020).
  5. Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus rna-seq workflows. Genome Biol. 21 (1), 130(2020).
  6. Lischetti, U., et al. Dynamic thresholding and tissue dissociation optimization for cite-seq identifies differential surface protein abundance in metastatic melanoma. Commun Biol. 6 (1), 830(2023).
  7. Ding, L., Saunders, T. L., Enikolopov, G., Morrison, S. J. Endothelial and perivascular cells maintain haematopoietic stem cells. Nature. 481 (7382), 457-462 (2012).
  8. Mendez-Ferrer, S., et al. Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche. Nature. 466 (7308), 829-834 (2010).
  9. Raaijmakers, M. H., et al. progenitor dysfunction induces myelodysplasia and secondary leukaemia. Nature. 464 (7290), 852-857 (2010).
  10. Himburg, H. A., et al. Distinct bone marrow sources of pleiotrophin control hematopoietic stem cell maintenance and regeneration. Cell Stem Cell. 23 (3), 370-381 (2018).
  11. Zhou, B. O., et al. marrow adipocytes promote the regeneration of stem cells and haematopoiesis by secreting scf. Nat Cell Biol. 19 (8), 891-903 (2017).
  12. Steinmann, G. G. Changes in the human thymus during aging. Curr Top Pathol. 75, 43-88 (1986).
  13. Steinmann, G. G., Klaus, B., Muller-Hermelink, H. K. The involution of the ageing human thymic epithelium is independent of puberty. A morphometric study. Scand J Immunol. 22 (5), 563-575 (1985).
  14. Ambrosi, T. H., et al. Adipocyte accumulation in the bone marrow during obesity and aging impairs stem cell-based hematopoietic and bone regeneration. Cell Stem Cell. 20 (6), 771-784 (2017).
  15. Ho, Y. H., et al. Remodeling of bone marrow hematopoietic stem cell niches promotes myeloid cell expansion during premature or physiological aging. Cell Stem Cell. 25 (3), 407-418 (2019).
  16. Kusumbe, A. P., et al. Age-dependent modulation of vascular niches for haematopoietic stem cells. Nature. 532 (7599), 380-384 (2016).
  17. Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium. J Immunol Methods. 385 (1-2), 23-34 (2012).
  18. Stoeckle, C., et al. Isolation of myeloid dendritic cells and epithelial cells from human thymus. J Vis Exp. (79), e50951(2013).
  19. Gustafsson, K., Scadden, D. T. Isolation of thymus stromal cells from human and murine tissue. Methods Mol Biol. 2567, 191-201 (2023).
  20. Centers for disease control prevenetion (cdc) infection control. , Available from: Https://Www.Cdc.Gov/Infectioncontrol/Basics/Standard-Precautions.Html (2023).
  21. Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. J Vis Exp. (110), e53936(2016).
  22. Zhu, H., et al. A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse compact bone. Nat Protoc. 5 (3), 550-560 (2010).
  23. Calvi, L. M., et al. Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche. Nature. 425 (6960), 841-846 (2003).
  24. Kode, A., et al. Leukaemogenesis induced by an activating beta-catenin mutation in osteoblasts. Nature. 506 (7487), 240-244 (2014).
  25. Agarwal, P., et al. Mesenchymal niche-specific expression of cxcl12 controls quiescence of treatment-resistant leukemia stem cells. Cell Stem Cell. 24 (5), 769-784 (2019).
  26. Duarte, D., et al. Inhibition of endosteal vascular niche remodeling rescues hematopoietic stem cell loss in aml. Cell Stem Cell. 22 (1), 64-77 (2018).
  27. O'flanagan, C. H., et al. Dissociation of solid tumor tissues with cold active protease for single-cell rna-seq minimizes conserved collagenase-associated stress responses. Genome Biol. 20 (1), 210(2019).
  28. Stoeckius, M., et al. Cell hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics. Genome Biol. 19 (1), 224(2018).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Секвенирование единичных клетокдиссоциация тимусавыделение костного мозгафильтрация через клеточный фильтрразделение с помощью магнитных частицанализ FACSстромальные клетки мышигетерогенность клеточных популяций
Выделение стромальных клеток из кроветворных органов
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.