Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Мышиная модель прикорневого зажима левой легочной артерии при реперфузионном повреждении ишемии легких

2.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/66232

⸱

12 апреля 2024 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Cardiothoracic Surgery, Washington University, St. Louis

В этой статье

Уведомление об исправлении

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Краткое содержание

В протоколе изложен осуществимый, надежный и воспроизводимый метод пережатия левой легочной прикорневой мышцы, который может быть использован для изучения ишемии-реперфузионного повреждения легких на мышиных моделях.

Аннотация

Ишемическое реперфузионное повреждение (ИРИ) во время трансплантации легкого является основным фактором риска посттрансплантационных осложнений, включая первичную дисфункцию трансплантата, острое и хроническое отторжение и смертность. Усилия по изучению основ IRI привели к разработке надежной и воспроизводимой модели прикорневой фиксации левого легкого у мышей. Эта модель включает в себя хирургическую процедуру, выполняемую у анестезируемой и интубированной мыши. Выполняется левая торакотомия с последующей тщательной мобилизацией легких и рассечением левого легочного воротка. Прикорневой зажим включает в себя обратимое наложение швов на ворота легочной артерии с помощью узла, который останавливает артериальный приток, венозный отток и поток воздуха через левый основной стволовой бронх. Реперфузия инициируется тщательным снятием швов. В текущих исследованиях наша лаборатория использует 30 мин ишемии и 1 ч реперфузии для экспериментальной модели. Однако эти временные периоды могут быть изменены в зависимости от конкретного экспериментального вопроса. Непосредственно перед жертвоприношением можно получить газ артериальной крови из левого желудочка после 4-минутного периода пережатия правой прикорневой мышцы, чтобы убедиться, что полученные значения PaO2 относятся только к поврежденному левому легкому. Мы также описываем метод измерения экстравазации клеток с помощью проточной цитометрии, который включает внутривенное введение меченного флуорохромом антитела, специфичного для изучаемой клетки (клеток) перед жертвоприношением. Затем левое легкое может быть собрано для проточной цитометрии, замороженной или фиксированной, иммуногистохимии со встроенным парафином и количественной полимеразной цепной реакции. Этот метод прикорневого зажима позволяет детально изучить клеточные и молекулярные механизмы, лежащие в основе ИРИ. Репрезентативные результаты свидетельствуют о снижении оксигенации левого легкого и гистологических признаках повреждения легких после прикорневой пережатия. Эта техника может быть легко изучена и воспроизведена персоналом с опытом микрохирургии и без него, что приводит к надежным и стабильным результатам и служит широко используемой моделью для изучения ИРИ легких.

Введение

ИРИ при трансплантации органов является основным фактором риска развития первичной дисфункции трансплантата и последующих эпизодов отторжения трансплантата 1,2. Во время трансплантации время теплой ишемии определяется как период времени от перекрестного зажима донорской аорты до начала холодной перфузии и от извлечения органа изо льда до имплантации органа. Время хранения в холодильнике определяется как период времени от начала холодной перфузии до извлечения органа изо льда3. Теплая ишемия более вредна для последующей функции органов, чем холодовая ишемия 4,5,6, и ее основные механизмы требуют дальнейшего изучения в доклинических моделях. Кроме того, трансплантация органов от донора после сердечной смерти (DCD) связана с более длительным периодом теплой ишемии, чем традиционное донорство после смерти мозга (DBD)7. В то время как использование доноров DCD может расширить пул доноров и повысить использование легких, необходимы дальнейшие доклинические исследования для оценки влияния теплой ишемии на функцию легких после трансплантации. Ниже мы опишем модель теплого ИРИ у мышей через левый легочный прикорневой зажим.

За последние несколько лет было разработано и адаптировано несколько животных моделей прикорневой фиксации легких, которые могут включать использование атравматического микрососудистого зажима 8,9,10,11,12,13, жгута Румеля 14,15 или наложения швов16 в качестве прикорневого зажима. Суть прикорневого зажима заключается в том, что он должен быть обратимым и вызывать минимальное повреждение прикорневых структур или не вызывать их вовсе, чтобы можно было достичь реперфузии. В этой статье мы описываем нашу технику прикорневого зажима у мышей, которая включает в себя обратимое наложение швов на левую легочную артерию ворот с помощью узла. Этот метод окклюзирует приток легочной артерии, венозный отток и поток воздуха внутрь и наружу главного ствола бронха. Основное преимущество скользящего узла по сравнению с сосудистым зажимом, зажимом или жгутом заключается в том, что грудная клетка может быть закрыта в течение длительных периодов ишемии, тем самым сводя к минимуму неощутимые потери жидкости и тепла у мыши. Мы предоставляем протокол для получения надежных измерений газов артериальной крови (АГН) и для измерения экстравазации клеток после прикорневой пережатости.

Эта техника прикорневого зажима занимает важное место в более широком изучении трансплантации легких. По сравнению с моделями ортотопической трансплантации легких на мелких животных, техника прикорневого зажима может изолировать эффекты IRI без добавления хирургической травмы анастомотического или аллогенности. Кроме того, техника прикорневого зажима может быть освоена легче и быстрее, чем трансплантация легких у мыши. Фактически, с помощью техники прикорневого зажима за последнее десятилетие было выявлено несколько важных механизмов патогенеза ИРИ, таких как TLR4, оксидаза NADPH и аденозиновый рецептор A2A 14,18,19,20. В следующем протоколе мы представляем надежный, обучаемый и воспроизводимый метод прикорневого зажима в качестве инструмента для изучения ИРИ легких.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все исследования были одобрены Комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию в Медицинской школе Вашингтонского университета. Животные получали гуманный уход в соответствии с Руководством по уходу за лабораторными животными и их использованию,8-е издание21 , подготовленным Национальной академией наук и опубликованным Национальными институтами здравоохранения, и Принципами ухода за лабораторными животными, сформулированными Национальным обществом медицинских исследований.

1. Анестезия и интубация

  1. Выберите мышь весом не менее 25 г. Это будет способствовать более легкой интубации за счет большего отверстия между голосовыми связками.
  2. Внутрибрюшинно вводите мышке смесь кетамина (доза 100 мг/кг массы тела) и ксилазина (доза 10 мг/кг массы тела). Эту смесь следует загрузить в шприц объемом 1/2 куб. см с иглой 1/2 дюйма 29G. Подождите около 5 минут, пока кетамин начнет действовать - мышь не должна проявлять спонтанных движений и не реагирует на пощипывание пальца ноги, что подтверждает адекватную анестезию.
  3. Вводите бупренорфин (доза 0,05 мг/кг массы тела) подкожно перед операцией для дополнительного обезболивания.
  4. Нанесите немедикаментозную офтальмологическую мазь на оба глаза, чтобы избежать высыхания роговицы во время операции.
  5. Побрейте мышь машинкой для стрижки на левой груди и спине (см. рисунок 1A), распространяя ее на брюшную полость, если планируется лапаротомия (см. шаг 5.3).
  6. После того, как мышь будет обезболена, выполните интубацию с использованием предпочтительной интубационной установки, а оставшуюся часть процедуры под микроскопом на нагретом коврике при температуре ~37 °C (для поддержания нормотермии у мыши).
  7. После достижения адекватного обзора голосовых связок вставьте самодельный интродьюсер (см. дополнительный рисунок 1) с изгибом на конце в 1-дюймовый ангиокатетер 20G, который используется в качестве эндотрахеальной трубки (ЭТТ). Проведите кончик проводника, а затем ЭТТ между голосовыми связками и мимо них.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно визуализировать ЭТТ, проходящую через голосовые связки, чтобы избежать ложной интубации в пищевод. Следует соблюдать осторожность, чтобы избежать травмирования голосовых связок во время интубации (т.е. количество попыток интубации должно быть ограничено 5, а ЭТТ не должна быть расширена при наличии сопротивления).
  8. После установки ETT извлеките проводник и подключите ETT к аппарату искусственной вентиляции легких для мелких животных. Наблюдайте за симметричным подъемом грудной клетки, чтобы подтвердить правильность эндотрахеальной интубации. Настройки аппарата ИВЛ должны составлять 100-105 вдохов в минуту и доля вдыхаемого кислорода 100%. Дыхательный объем составляет 0,35 мл, положительное давление в конце выдоха – 1 см H2O.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что грудная клетка, а не брюшная полость, поднимается, так как случайная интубация пищевода приведет к смерти, если ее своевременно не скорректировать.
  9. После подтверждения того, что ETT находится в нужном положении, закрепите ETT полоской длиной 5 см из шелковой ленты толщиной 1 дюйм вокруг носа мыши, обеспечивая достаточный контакт с ETT и носом, чтобы ETT не выскользнул изо рта (см. Рисунок 1B-C).
  10. Для поддержания адекватной анестезии на протяжении всей операции вводите 1%-1,5% изофлуран в соответствии с потоком кислорода.

2. Торакотомия

  1. Расположите мышь в правильном боковом положении пролежня так, чтобы обе передние лапы были прикреплены к верхнему левому углу, правая задняя лапа — к нижнему левому углу, а левая задняя лапа — к нижнему правому углу (см. Рисунок 2G для тейпирования).
  2. Продезинфицируйте кожу над левой грудью не менее 3 чередующихся раундов повидон-йода с последующим нанесением 70% спирта.
  3. Выполните разрез над4-м межреберным пространством от передней подмышечной линии до задней подмышечной линии, используя ножницы для вскрытия вышележащей кожи (см. рисунок 2А). 4-е межреберье расположено примерно на 1 см ниже подмышечной впадины по среднеподмышечной линии.
  4. Чтобы свести к минимуму кровопотерю, коагулируйте видимые кровеносные сосуды в подкожном и мышечном слоях с помощью ручного ручки для прижигания.
  5. Резко разделите широчайшие мышцы спины и передние зубчатые мышцы с помощью ножниц по длине разреза кожи (см. рисунок 2В).
  6. С помощью тонко изогнутых щипцов осторожно поднимите4-е ребро (стараясь не повредить нижележащее легкое) и сделайте точечный надрез тонкими ножницами чуть выше5-го ребра, чтобы войти в4-е межреберье (см. Рисунок 2C). Выполняйте торакотомию выше5-го ребра, а не ниже4-го ребра, чтобы избежать повреждения межреберного сосудисто-нервного пучка.
  7. Как только отрицательное давление в плевральной полости будет потеряно и легкое оттянется от стенки грудной клетки, продлите торакотомию спереди и сзади в4-м межреберье чуть выше5-го ребра (см. Рисунок 2D-E). Вся длина разреза должна быть достаточной для обнажения всего легкого, обычно ~1 см.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Кровотечение из внутренней молочной артерии может произойти, если торакотомия слишком сильно распространена на кпереднюю часть - при обнаружении этого следует прижечь, чтобы избежать чрезмерной кровопотери.
  8. Примените два ребра ребра, чтобы расширить пространство ребер, обеспечив рабочее окно не менее 1см2 для адекватной визуализации (см. Рисунок 2F-G).

3. Применение прикорневого зажима

  1. С помощью двухконечных аппликаторов с ватным наконечником мобилизуйте левое легкое, подняв его головной и затем тупо разделив полупрозрачную нижнюю легочную связку (см. рисунок 3A-B).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если это сложно выполнить без разрыва легкого, нижнюю легочную связку также можно резко разделить с помощью тонких ножниц.
  2. Отразите легкое спереди, чтобы можно было визуализировать заднюю левую легочную ворота. Отрежьте кусок шелковой галстука 6-0 до ~10 см и поместите середину этой галстука сзади к воротам (см. Рисунок 3C).
  3. Затем переверните левое легкое кзади, чтобы положить поверх галстука, и потяните оба конца галстука спереди (см. рисунок 3D).
  4. Двумя свободными концами (А и В) галстука инструмента завяжите двусторонний узел с щипцами и изогнутым противомоскитным зажимом. Подробное описание см. в шагах 3.4.1 и 3.4.2. Теплое ишемическое время начинается с завязывания узла. Левое легкое больше не должно раздуваться при каждом вдохе аппарата ИВЛ после того, как узел завязан. Она должна стать бледно-белой, что означает прекращение перфузии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следует следить за тем, чтобы узел находился в середине воротника, избегая случайного защемления левого предсердия по центру и паренхимы легкого по бокам (см. Рисунок 3F).
    1. Держа зажим в доминирующей руке и щипцы в недоминантной руке, возьмитесь за конец А щипцами и один раз обмотайте середину А вокруг закрытого зажима (см. рисунок 3E).
    2. Возьмитесь зажимом за середину буквы B и потяните обеими руками, чтобы зажать узел. Не позволяйте концу буквы В протягиваться через узел, что может сделать узел необратимым. После завязывания узла у В должна быть петля, исходящая от узла, а у А должна быть прямая (см. рисунок 3F). Узел можно освободить, потянув за конец В.
  5. Подтвердите адекватную окклюзию бронха путем ручной окклюзии отводящей трубки от ЭТТ к аппарату искусственной вентиляции легких, что должно привести к тому, что левое легкое не будет раздуваться (см. рисунок 3G). Окклюзия сосудов предполагается при окклюзии бронхов с учетом повышенной коллапсируемости легочной артерии и вен по сравнению с хрящевым бронхом.
  6. После наложения прикорневого зажима закройте разрез кожи одним простым прерывистым швом с использованием нейлонового шва 6-0, чтобы свести к минимуму незаметные потери жидкости в период теплой ишемии.

4. Освобождение прикорневого зажима

  1. После желаемого периода теплой ишемии освободите узел, осторожно потянув за короткий свободный конец шелкового галстука (В из рисунка 3F и шага 3.4). Начните время реперфузии после отпускания узла.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После снятия уздечки вентиляция легких может быть подтверждена повторной ручной окклюзией оттока ЭТТ, что теперь должно вызвать расширение левого легкого. Опять же, перфузия подразумевается как раздувание легкого, однако она также может быть подтверждена розовым легким (см. рисунок 4A).
  2. В период реперфузии закройте грудную клетку в три слоя, чтобы свести к минимуму неощутимые потери. Сначала закройте пространство4-го ребра одним стежком нейлоновым швом 6-0, одним укусом чуть выше4-го ребра и одним укусом чуть выше6-го ребра (см. рисунок 4B-C). Свяжите это с максимальным раздуванием легких, чтобы свести к минимуму риск ятрогенного пневмоторакса (см. рисунок 4D-E).
  3. Далее закройте мышечный слой с помощью простого бегового стежка с нейлоновым швом 6-0.
  4. Наконец, закройте разрез кожи простым прерывистым швом с нейлоновым швом 6-0 (см. рисунок 4F). Избегайте наложения швов на кожу из-за риска того, что проснувшиеся животные могут ковыряться в их разрезе, что приведет к полному раскрытию раны.
  5. С этого момента легкое может быть непосредственно извлечено по истечении желаемого времени реперфузии. Если требуется оценка ABG, см. шаг 5. Если перед жертвоприношением требуется дополнительная внутривенная инъекция, см. шаг 6. Это терминальная операция.
  6. Если время реперфузии должно быть больше пары часов, выключите изофлуран, чтобы мышь могла проснуться от анестезии и провести экстубацию. Критерии экстубации включают подергивания с щипком и спонтанные вдохи и движения. Пробуждение мыши от кетаминовой и изофлурановой анестезии обычно занимает 30-45 минут. Это операция по выживанию.
    1. Для операции по выживанию введите 1 мл теплого физиологического раствора подкожно, чтобы компенсировать потерю жидкости во время операции. Вводите бупренорфин (доза 0,05 - 0,1 мг/кг массы тела) подкожно перед операцией для контроля боли. Повторяйте анестезию каждые 4-6 часов в течение как минимум 3 дней после операции. Рассмотрите возможность введения бупивакаиновой блокады вдоль разреза для дополнительного контроля боли.

5. Оценка ABG

ПРИМЕЧАНИЕ: Если требуется измерение АВГ, его лучше всего получить с помощью артериальной аспирации крови из левого желудочка. Чтобы убедиться, что АБГ отражает только функцию левого легкого, эта артериальная кровь должна быть получена примерно через 4 минуты после зажатия правого ворота22,23, в течение которого только левое легкое осуществляет оксигенацию и вентиляцию.

  1. Если мышь была выведена из наркоза после прикорневого зажима, повторно обезболите и интубируйте мышь в соответствии с шагом 1.
  2. Примерно за 15-20 минут до окончания желаемого времени реперфузии расположите мышь на спине, зафиксировав все четыре конечности лентой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следует выделить достаточно времени для выполнения следующих этапов до окончания реперфузии. Конкретное время вскрытия брюшной полости и грудной клетки будет варьироваться в зависимости от хирурга и его опыта.
  3. Выполните лапаротомию по средней линии от лобковой кости до мечевидной кости, разрезая ножницами кожу, а затем брюшную стенку вдоль белой линии (см. рисунок 5A-B).
  4. На мечевидной кости продлите лапаротомию влево и вправо до передней подмышечной линии, следуя изгибу самого нижнего ребра (см. Рисунок 5C).
  5. С брюшной полости разрежьте переднюю диафрагму по средней линии, чтобы войти в грудную клетку, стараясь не проникать слишком глубоко, чтобы не повредить сердце (см. рисунок 5D-E). Затем продлите разрез передней диафрагмы влево и вправо до передней подмышечной линии, вдоль самого нижнего ребра (см. белую пунктирную линию на рисунке 5D).
  6. Разделите двусторонние ребра вдоль передней подмышечной линии, простирающейся вверх к подмышечной впадине, чтобы создать торакотомию с раскладушкой. Затем отразите переднюю грудную стенку (грудину и двусторонние передние ребра) головной мозг, что позволяет полностью обнажить сердце и двусторонние легкие (см. белые пунктирные линии на рисунке 5F).
  7. Наложите зажим на переднюю стенку грудной клетки, которая перевернута на голову, чтобы облегчить втягивание. Отведите диафрагму вниз с помощью изогнутого москитного зажима по средней линии для улучшения визуализации грудной клетки (см. рисунок 5F).
  8. Чтобы полностью мобилизовать правое легкое (которое имеет 4 доли), верните добавочную долю, которая проходит за среднюю линию в левую грудную клетку, обратно в правую грудную клетку (см. рисунок 5G-H). К левой груди прилагается тонкая связка, прикрепляющая эту долю – разделите ее либо тупо аппликаторами с ватным наконечником, либо резко ножницами.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта добавочная доля пересекает среднюю линию позади нижней полой вены (IVC), поэтому необходимо соблюдать осторожность, чтобы не повредить IVC во время этого маневра.
  9. Как только все доли вернутся к правой груди, отразите все правое легкое спереди и поместите еще одну шелковую галстук 6-0 (обрезанную до ~10 см) позади правой груди. Затем замените правое легкое обратно в грудную клетку поверх галстука.
  10. Завяжите еще один узел вокруг правого ворота, используя ту же технику, что и в шаге 3.4, стараясь обхватить все четыре доли правого легкого. Этот шаг зажима правой прикорневой мышцы должен быть рассчитан примерно за 4 минуты до окончания реперфузии.
  11. Нанесите 1/2-дюймовую иглу 31G на туберкулиновый шприц объемом 1 куб. см примерно 200 мкл гепарина 1000 единиц/мл. Для этого наберите объем гепарина и несколько раз потяните поршень вперед и назад 3-4 раза, чтобы гепарин мог покрыть всю внутреннюю часть шприца. Это делается для минимизации риска свертывания аспирированной крови во время транспортировки с хирургической станции на аппарат ABG.
  12. Через 4 минуты после пережатия правой корточки аспирируйте артериальную кровь из левого желудочка в шприц, покрытый гепарином (см. рисунок 5I). Следите за тем, чтобы не допустить прокола межжелудочковой перегородки и непреднамеренной аспирации венозной крови правого желудочка. Существует четкая разница в цвете между более темным правым желудочком и более светлым левым желудочком (см. вставку рисунка 5I). Наклоните иглу к левой горловине. Для получения достаточного количества крови для проведения ABG (~150 μL) может потребоваться несколько проколов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В течение 4 минут зажима правой мышцы мыши могут начать проявлять агональное дыхание, которое предвещает надвигающуюся смерть. В этом случае артериальная кровь должна быть немедленно аспирирована до остановки сердца. Аспирация крови из небьющегося сердца невозможна.
  13. Запустите артериальную кровь на аппарате ABG, чтобы получить насыщение кислородом, парциальное давление кислорода, парциальное давление углекислого газа и другие измерения. Усыпьте мышь после сбора ABG и/или лечения антителами (см. шаг 6).

6. Внутривенное введение антител для измерения экстравазации клеток

Этот метод может быть использован для определения экстравазации клеток путем внутривенного введения антител, меченных флуорохромом, в НПВ перед жертвоприношением с последующим проведением проточного цитометрического анализа, как было опубликовано ранее18. Вкратце, внутрисосудистые нейтрофилы можно отличить от интерстициальных нейтрофилов с помощью нейтрофильно-специфических антител против Ly6G. Флуоресцеин-изотиоцианат-меченный (FITC-меченный) анти-Ly6G (клон 1A8) вводится внутривенно за 5 минут до жертвоприношения, который помечает циркулирующие внутрисосудистые нейтрофилы. Используемая концентрация антитела FITC-Ly6G составляет 100 нг, разведенных в 200 мкл фосфатно-солевого буфера. Затем, после приготовления суспензии одиночных клеток из левого легкого для проточной цитометрии, все нейтрофилы мечаются аллофикоцианином-меченным (APC-меченным) анти-Ly6G (клон 1A8). Таким образом, нейтрофилы APC-Ly6G+FITC-Ly6G+ являются внутрисосудистыми, в то время как APC-Ly6G+FITC-Ly6G- являются внесосудистыми или интерстициальными. Этот метод может быть адаптирован, например, к моноцитам с антителами к Ly6C, В-клеткам с антителами к CD19.

  1. Загрузите желаемое антитело в шприц объемом 3/10 куб. см с иглой 31G 5/16 дюйма, стараясь свести к минимуму количество пузырьков воздуха внутри шприца. Используйте его для внутривенного введения в НПВ на шаге 6.5.
  2. Выполняйте лапаротомию в соответствии с пунктами 5.3-5.4.
  3. После лапаротомии выполните правую медиальную висцеральную ротацию с помощью двух аппликаторов с заостренным ватным наконечником. У мышей это делается путем потрошения всей кишки слева от брюшной полости, что позволит хорошо видеть НПВ (см. рисунок 6А).
  4. Удалите жир над IVC тупыми аппликаторами с ватным наконечником.
  5. Введите раствор антитела в НПВ с помощью венепункции (см. рисунок 6B). После извлечения иглы немедленно надавите ватным тампоном на место венепункции до тех пор, пока она не станет кровоостанавливаемой (обычно около 2-3 минут).
  6. Верните выпотрошенный кишечник в брюшную полость над ватным тампоном, продолжая оказывать давление на НПВ (см. рисунок 6C).
  7. Выполните торакотомию раскладушки в соответствии с шагами 5.5-5.7 для забора левого легкого. Дайте антителам не менее 5 минут для системной циркуляции перед жертвоприношением и сбором урожая. Усыпьте мышь после сбора ABG и/или лечения антителами.

7. Гистологическое окрашивание (H&E)

  1. После фиксации формалином и парафинообразования левого легкого и разрезания до толщины 5 мкм депарафинизируйте предметное стекло в ксилоле (два промывки по 10 минут).
  2. Обезвоживайте при последовательных стирках этанолом: 2x 5 мин стирки со 100%, 1x 2 мин стирки с 95% и 1x 2 мин стирки с 70% этанолом. Затем промойте в деионизированной воде.
  3. Закрасьте предметное стекло гематоксилином на 2-4 минуты, затем промойте деионизированной водой в течение 5 минут или пока оно не станет прозрачным. Точная продолжительность окрашивания гематоксилином должна быть оптимизирована в соответствии с тканями и желаемой интенсивностью ядерного окрашивания.
  4. Стирать в определяющем растворе в течение 30 секунд для дифференциации пятен, затем стирать в воде в течение 2 минут. Постирать в формовочном растворе синего цвета в течение 30 с, затем постирать в воде в течение 2 минут.
  5. Еще больше обезвоживайте, погрузив в 95% этанол в 15 раз. Окрашивать в эозин в течение 1 мин.
  6. Обезвоживайте с помощью 2 мин промывки этанолом (2 мин), а затем 2 мин промывки ксилола (2 мин). Нанесите монтажный носитель и защитное покрытие.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

После пережатия левого прикорневого отверстия парциальное давление оксигенации в артериальной крови (PaO2), относящееся к левому легкому, составляет ~100 мм рт.ст., что значительно ниже по сравнению с ~500 мм рт.ст. после фиктивной торакотомии (рис. 7A, n = 6-7). Следует отметить, что фиктивная торакотомия была выполнена у мышей B6 с измерением ABG через 4 минуты после пережатия правой прикорневой мышцы, что представляет собой значения, приписываемые только левому легкому. Окрашив...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Мы описываем технику прикорневого зажима, которая включает в себя наложение узла на левом вороте, который окклюзирует легочную артерию и вены и бронх, чтобы вызвать теплую ишемию с последующей реперфузией. После прикорневой пережатости левое легкое может быть собрано для различных экспериментальных методов, таких как гистология, проточная цитометрия, объемное или одноклеточное секвенирование, а также количественная полимеразная цепная реакция. Кроме того, кровь и селезенка могут быть использованы для изучения системных э...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не сообщают о каких-либо соответствующих разоблачениях.

Благодарности

Эта работа не получила специального гранта от какого-либо финансирующего агентства в государственном, коммерческом или некоммерческом секторах.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
<сильно>Лекарства
10% раствор повидон-йодаAplicareNDC 52380-0126-2Для дезинфицирующего средства
Бупренорфин 1,3 мг/млFidelis Animal HealthNDC 86084-100-30Для обезболивания
CarprofenCronus PharmaNDC 69043-027-18Для обезболивания
Гепарин 1000 ед/млSagentNDC 25021-404-01Для получения артериальной крови
Изофлуран 1%-1,5%Sigma Aldrich26675-46-7Для анестезии
Кетамина гидрохлорид 100 мг/млVedcoNDC 50989-996-06Для анестезии
Puralube Vet глазная мазьMedi-Vet.com11897Для предотвращения высыхания глаз
Ксилазин 20 мг/млAkornNDC 59399-110-20Для обезболивания
Инструменты и инструменты
Argent High Temp Fine Tip Cacery PenMcKesson231Для коагуляции кровеносных сосудов
Изогнутый зажим для комаровFine Science Tools13009-12Для хирургической процедуры
Тонкие изогнутые щипцыFine Science Tools11274-20Для хирургических
процедура Тонкие ножницыFine Science Tools15040-11Для хирургической процедуры
Установка интубационного зажимаFine Science Tools18374-44, 18144-30Для вертикального удержания мыши за язык во время интубации. Смотрите дополнительный рисунок 1A. 
Магнитные реберные ретракторыFine Science Tools18200-01, 18200-10Для ретракотомии. Магнитный фиксатор и втягивающее устройство должны быть соединены микролатексной трубкой снизу.
Оптическое пластиковое волокно без оболочки, 500μ mEdmund Optics02-532Сделать интродьюсер для эндотрахеальной трубки. Смотрите дополнительный рисунок 1B. Это оптическое волокно длиной 1,5 дюйма должно иметь кусок шелковой ленты, прикрепленный к одному концу. Затем его можно использовать в качестве проводника для эндотрахеальной трубки. На конце интродьюсера должны быть слегка изогнуты.
Машинка для стрижки Power Pro UltraOster078400-020-001Для стрижки волос
НожницыFine Science Tools14370-22Для хирургической процедуры
Грелка для мелких животныхK& H Pet ProductsТермо-Пип ГрелкаДля поддержания нормотермии
Аппарат ИВЛ для мелких животныхАппарат Harvard55-0000Для вентиляции (телевизор 0,35 куб. см, PEEP 1 см H2O, RR 100-105/мин, FiO2 100%)
Микролатексная резиновая трубка Spearit (1/8 дюйма наружного диаметра, 1/16 дюйма внутреннего диаметра)Amazon.comhttps://www.amazon.com/Rubber-Tubing-CONTINUOUS-Select-Length/dp/B00H4MT7V0?th=1Для втягивания торакотомия
Профиль характеристик Анализатор газов крови для интенсивной терапииNova Biomedicalhttps://novabiomedical.com/prime-plus-critical-care-blood-gas-analyzer/index.php?gad=1&gclid=Cj0KCQjwmICoBhDx
ARIsABXkXlInZX--R3ezBkc304nS_GVGI9Z2T3Esr33
2aM8WGPiUVhicPQZ
Wj2AaAqhDEALw_wcB   		Для ретракотомии
Прямой зажимFine Science Tools13008-12Для хирургических процедур
Прямые щипцыFine Science Tools91113-10Для хирургических процедур
Хирургический микроскопWild Heerbruggбольше не производитсяДля интубации и хирургических процедур; рекомендуется замена на хирургические микроскопы Leica
Расходные материалы
½ cc шприц с ½ дюймовая игла 29GMcKesson942665Для внутрибрюшинного введения кетамина/ксилазина внутрибрюшинно
½ дюймовая игла 31G на туберкулиновый шприц объемом 1 ccMcKesson16-SNT1C2705Для аспирации артериальной крови из левого желудочка
1-дюймовый 20G-катетер для внутривенного введения TerumoSROX2025CAДля эндотрахеальной трубки (ЭТТ)
1-дюймовый шелк лентаDurapore3M ID 7100057168ленты ETT к носу и для фиксации конечностей
3/10 куб. см шприц с иглой 5/16 дюйма 31GMcKesson102-SN310C31516PДля введения антител в нижнюю полую вену
6-0 монофиламентный шов на игле P-10McKessonS697GXДля закрытия торакотомии, мышечного слоя и кожи
6-0 шелковый галстукХирургические специальностиSP102Для изготовления узла для прикорневого зажима
Заостренные ватные аппликаторыSolon56225Для манипуляций с легким и для тупого рассечения
Для прикрепления

Ссылки

  1. Bharat, A., et al. Immunological link between primary graft dysfunction and chronic lung allograft rejection. Ann Thorac Surg. 86 (1), 189-195 (2008).
  2. Daud, S. A. Impact of immediate primary lung allograft dysfunction on bronchiolitis obliterans syndrome. Am J Respir Crit Care Med. 175 (5), 507-513 (2007).
  3. Halazun, K. J., Al-Mukhtar, A., Aldouri, A., Willis, S., Ahmad, N. Warm ischemia in transplantation: search for a consensus definition. Transplant Proc. 39 (5), 1329-1331 (2007).
  4. Warnecke, G., et al. Warm or cold ischemia in animal models of lung ischemia-reperfusion injury: is there a difference . Thorac Cardiovasc Surg. 52 (3), 174-179 (2004).
  5. Hasenauer, A., et al. Effects of cold or warm ischemia and ex-vivo lung perfusion on the release of damage associated molecular patterns and inflammatory cytokines in experimental lung transplantation. J Heart Lung Transplant. 40 (9), 905-916 (2021).
  6. Iskender, I., et al. Effects of warm versus cold ischemic donor lung preservation on the underlying mechanisms of injuries during ischemia and reperfusion. Transplantation. 102 (5), 760-768 (2018).
  7. Santos, P., Teixeira, P. J. Z., Moraes Neto, D. M., Cypel, M. Donation after circulatory death and lung transplantation. J Bras Pneumol. 48 (2), e20210369(2022).
  8. Moskowitzova, K., et al. Mitochondrial transplantation enhances murine lung viability and recovery after ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 318 (1), L78-L88 (2020).
  9. Nakata, K., et al. Functional blockage of S100A8/A9 ameliorates ischemia-reperfusion injury in the lung. Bioengineering (Basel). 9 (11), 673(2022).
  10. Nakata, K., et al. Protective effects of anti-HMGB1 monoclonal antibody on lung ischemia reperfusion injury in mice. Biochem Biophys Res Commun. 573, 164-170 (2021).
  11. Wang, Q., Li, Y., Wu, C., Wang, T., Wu, M. Aquaporin-1 inhibition exacerbates ischemia-reperfusion-induced lung injury in mouse. Am J Med Sci. 365 (1), 84-92 (2023).
  12. Gielis, J. F., et al. A murine model of lung ischemia and reperfusion injury: tricks of the trade. J Surg Res. 194 (2), 659-666 (2015).
  13. Zhang, X., et al. Mitogen-activated protein kinases regulate HO-1 gene transcription after ischemia-reperfusion lung injury. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 283 (4), L815-L829 (2002).
  14. Sharma, A. K., et al. Adenosine A2A receptor activation on CD4+ T lymphocytes and neutrophils attenuates lung ischemia-reperfusion injury. J Thorac Cardiovasc Surg. 139 (2), 474-482 (2010).
  15. Yang, Z., Sharma, A. K., Linden, J., Kron, I. L., Laubach, V. E. CD4+ T lymphocytes mediate acute pulmonary ischemia-reperfusion injury. J Thorac Cardiovasc Surg. 137 (3), discussion 702 695-702 (2009).
  16. Sayah, D. M., et al. Neutrophil extracellular traps are pathogenic in primary graft dysfunction after lung transplantation. Am J Respir Crit Care Med. 191 (4), 455-463 (2015).
  17. Okazaki, M., et al. A mouse model of orthotopic vascularized aerated lung transplantation. Am J Transplant. 6 (7), 1672-1679 (2007).
  18. Hsiao, H. M. Spleen-derived classical monocytes mediate lung ischemia-reperfusion injury through IL-1beta. J Clin Invest. 128 (7), 2833-2847 (2018).
  19. Sharma, A. K., Mulloy, D. P., Le, L. T., Laubach, V. E. NADPH oxidase mediates synergistic effects of IL-17 and TNF-alpha on CXCL1 expression by epithelial cells after lung ischemia-reperfusion. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 306 (1), L69-L79 (2014).
  20. Zanotti, G., et al. Novel critical role of Toll-like receptor 4 in lung ischemia-reperfusion injury and edema. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 297 (297), L52-L63 (2009).
  21. National Research Council. Guide for the care and use of laboratory animals. , The National Academies Press. Washington, DC. (2011).
  22. Saito, M., et al. Pirfenidone alleviates lung ischemia-reperfusion injury in a rat model. J Thorac Cardiovasc Surg. 158 (1), 289-296 (2019).
  23. Tanaka, S., et al. Protective effects of Imatinib on ischemia/reperfusion injury in rat lung. Ann Thorac Surg. 102 (5), 1717-1724 (2016).
  24. Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (42), 18073-18078 (2010).
  25. Koletsis, E., et al. In situ cooling in a lung hilar clamping model of ischemia-reperfusion injury. Exp Biol Med (Maywood). 231 (8), 1410-1420 (2006).
  26. Hermsen, R., et al. Genomic landscape of rat strain and substrain variation. BMC Genomics. 16 (1), 357(2015).
  27. Beck, J. A., et al. Genealogies of mouse inbred strains. Nat Genet. 24 (1), 23-25 (2000).
  28. Liao, W. I., et al. A mouse model of orotracheal intubation and ventilated lung ischemia reperfusion surgery. J Vis Exp. (187), 64383(2022).
  29. Murata, T., Nakazawa, H., Mori, I., Ohta, Y., Yamabayashi, H. Reperfusion after a two-hour period of pulmonary artery occlusion causes pulmonary necrosis. Am Rev Respir Dis. 146 (4), 1048-1053 (1992).
  30. Ukita, R., et al. A large animal model for pulmonary hypertension and right ventricular failure: Left pulmonary artery ligation and progressive main pulmonary artery banding in sheep. J Vis Exp. (173), 62694(2021).
  31. Wang, Q., et al. Induction of right ventricular failure by pulmonary artery constriction and evaluation of right ventricular function in mice. J Vis Exp. (147), 59431(2019).
  32. Welbourn, C. R., et al. Pathophysiology of ischaemia reperfusion injury: central role of the neutrophil. Br J Surg. 78 (6), 651-655 (1991).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Исправление


Formal Correction: Erratum: Murine Left Pulmonary Hilar Clamp Model of Lung Ischemia Reperfusion Injury
Posted by JoVE Editors on 7/09/2024. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/66232

Больше статей

Пережатие легочного воротникаповреждение легких мышиэкстравазация нейтрофиловпривлечение В-клетокпроточная цитометрияпроцедура торакотомиигазовый состав артериальной кровимодель трансплантации легкого
Мышиная модель прикорневого зажима левой легочной артерии при реперфузионном повреждении ишемии легких
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.