В этом протоколе описывается полуавтоматизированный способ повышения эффективности и возможностей обработки и криоконсервации спермы кораллов, находящихся под угрозой исчезновения, с целью обеспечения генетического разнообразия и поддержки усилий по восстановлению рифов.
Методическая статья
Полуавтоматизированный рабочий процесс криоконсервации спермы кораллов для поддержки биобанкинга и аквакультуры
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Коралловые рифы сталкиваются с кризисом, поскольку частота обесцвечивания, вызванного потеплением океана, увеличивается, что приводит к гибели кораллов на рифах по всему миру. Последующая утрата генетического разнообразия и биоразнообразия может снизить способность кораллов адаптироваться к изменяющемуся климату, поэтому усилия по сохранению существующего разнообразия имеют важное значение для максимального использования ресурсов, доступных для восстановления рифов сейчас и в будущем. Наиболее эффективным подходом к обеспечению безопасности генетики в долгосрочной перспективе является криоконсервация и биобанкинг, которые позволяют хранить живые образцы в замороженном виде при криогенных температурах в жидком азоте на неопределенный срок. Криоконсервация спермы кораллов возможна с 2012 года, но сезонный характер размножения кораллов означает, что деятельность биобанков ограничена всего несколькими ночами в году, когда происходит нерест. Таким образом, повышение эффективности процессов обработки спермы кораллов и криоконсервации имеет важное значение для максимального использования этих ограниченных возможностей биобанкинга. С этой целью мы поставили перед собой задачу оптимизировать процессы криоконсервации коралловой спермы, опираясь на существующие технологии и создав полуавтоматизированный подход к оптимизации оценки, обработки и криоконсервации коралловой спермы. Процесс, который сочетает в себе компьютерный анализ спермы, криовиальные штрих-коды и серию связанных автоматических таблиц данных для одновременного редактирования несколькими пользователями, повышает эффективность как обработки образцов, так и управления метаданными в полевых условиях. Благодаря интеграции с межсекторальными исследовательскими программами, такими как Программа восстановления рифов и адаптации в Австралии, криоконсервация может играть решающую роль в крупномасштабных программах восстановления рифов, способствуя генетическому управлению популяциями аквакультуры, поддерживая исследования по повышению термоустойчивости и предотвращая вымирание видов кораллов. Описанные процедуры будут использоваться практиками криоконсервации кораллов и биобанкинга на рифах по всему миру и послужат моделью для перехода технологий криоконсервации от исследовательских лабораторий к крупномасштабным приложениям.
Введение
Коралловые рифы во всем мире испытывают потерю коралловых видов, популяций и генетического разнообразия из-за потепления и закисления океана, вызванного изменением климата, что снижает жизнеспособность этих критически важных мест обитания и влияет на виды, которые они поддерживают. Наиболее эффективным подходом к обеспечению безопасности генетики в долгосрочной перспективе является криоконсервация и биобанкинг, которые позволяют хранить живые образцы в замороженном виде при криогенных температурах в жидком азотена неопределенный срок3. Разработка в 2012 году методов криоконсервации спермы кораллов4 впервые позволила создать биобанк генетики этих видов и привела к созданию первого биорепозитория для генетики кораллов в 2012году5. С тех пор этот протокол криоконсервациибыл усовершенствован и использован для обеспечения генетики более 50 видов кораллов во всем мире, причем 30 из этих видов происходят из Большого Барьерного рифа в Австралии7. Криоконсервированная коралловая сперма может генерировать здоровые кораллы, которые развиваются нормально и используются для облегчения экспериментов по ассистированному потоку геновв Австралии 8 и Карибском бассейне9. В то время как в настоящее время разрабатываются технологии, позволяющие криоконсервировать сложные типы тканей, такие как личинки10 и взрослые коралловые ткани11,12, криоконсервация коралловой спермы в настоящее время является наиболее распространенным доступным инструментом для рутинного биобанкинга генетики кораллов.
По мере того, как воздействие на популяции кораллов увеличивается, некоторые страны инициировали крупномасштабные программы по поддержке восстановления рифов и адаптации к ним (например, Программа восстановления и адаптации рифов [RRAP] в Австралии13) или по сохранению оставшихся популяций кораллов, находящихся под угрозой исчезновения (например, Florida Coral Rescue в США14). В контексте этих программ криоконсервацию можно рассматривать как технологию, способствующую проведению исследований и крупномасштабному производству кораллов в дополнение к сохранению существующего генетического разнообразия и предотвращению вымирания. Криоконсервация спермы может обеспечить больший контроль над размножением между популяциями, которые физически или временно разделены, и может позволить генетическому управлению маточного стада отбирать желаемые признаки, такие как термическая толерантностьили устойчивость к болезням. На сегодняшний день биобанкинг коралловой спермы осуществляется в относительно небольших масштабах вподдержку управления биоразнообразием7, поэтому потребуется некоторый уровень масштабирования, если такой биобанкинг хочет реализовать свой потенциал в рамках этих более крупных программ восстановления рифов. Как и в случае со всеми усилиями по восстановлению рифов, основанными на воспроизводстве кораллов, основным препятствием для увеличения усилий по биобанкингу является ограниченный период, в течение которого коралловые гаметы доступны, поскольку нерест у большинства рифообразующих видов совпадает с полнолунием в конце весны иначале лета, а это означает, что гаметы доступны для криоконсервации и биобанкинга только несколько ночей в году. Более того, в регионах, где происходит массовый нерест, например, на Большом Барьерном рифе, как правило, несколько видов нерестятся одновременно или с интервалом в несколько часов водну и ту же ночь. Таким образом, требуется усовершенствование пути криоконсервации спермы для увеличения масштаба и эффективности обработки для максимального увеличения емкости биобанка в течение этих коротких ежегодных нерестовых окон при одновременном обеспечении целостности образцов и связанных с ними метаданных.
Криоконсервация и биобанкинг спермы кораллов включают в себя несколько ключевых этапов, от сбора гамет во время нереста до поступления образцов в биорепозиторий и базу данных (рис. 1). Процесс начинается с отделения сперматозоидов от яйцеклеток (у гермафродитных видов) или сбора сперматозоидов из толщи воды (у гонохорных видов) с последующей оценкой подвижности и концентрации сперматозоидов. Затем сперматозоиды смешивают с криопротектором (конечная концентрация 10% v/v, диметилсульфоксид, ДМСО) в отфильтрованной морской воде (FSW) и охлаждают до −20 °C/мин в специально разработанном охлаждающем устройстве4. Ранние итерации этого процесса основывались на визуальной оценке подвижности и концентрации сперматозоидов с помощью фазово-контрастной микроскопии и подсчета гемоцитометров, печати и маркировки пробирок при обработке образцов для криоконсервации, ручном пипетировании образцов спермы в криовиалы и охлаждении на специально разработанном плавающем штативе16. Применение компьютерного анализа спермы (CASA)17 и разработка напечатанного на 3D-принтере охлаждающегоустройства повысили эффективность и надежность криоконсервации спермы кораллов, но процесс обработки образцов спермы остался в основном неизменным с момента его создания. Несмотря на то, что этот подход подходит для обработки образцов от умеренного числа колоний и видов в ночь нереста, для больших объемов и количества колоний (например, отдельных образцов от >10 колоний одновременно) существуют узкие места в пути криоконсервации, которые препятствуют своевременной обработке образцов (т.е. в течение 2 ч после высвобождения спермы) без ухудшения потенциала фертильности образца. Несмотря на то, что существуют крупномасштабные системы работы с жидкостями для криовалиальных камер (например, Thomas et al.18), они, как правило, предназначены для обработки больших партий (т.е. нескольких штативов криовиалов) и не подходят для транспортировки и использования в полевых условиях, поэтому они не являются экономически эффективными для данного применения. Таким образом, настоящее исследование было направлено на повышение эффективности криоконсервации спермы кораллов путем внедрения портативного, недорогого оборудования и методов автоматизации на ключевых этапах процесса обработки, чтобы максимизировать количество образцов, которые могут быть эффективно криоконсервированы в ночь нереста.
Протокол
Описанные здесь способы могут быть использованы для обработки и криоконсервации спермы как гермафродитных, так и гонохорных видов кораллов. Общее введение и учебник по нересту кораллов и сбору гамет для криоконсервации спермы для обоих репродуктивных режимов можно найти в Смитсоновском национальном зоопарке и Институте биологии охраны кораллов19. Описанные методы были разработаны в первую очередь с использованием гамет из колоний Acropora millepora , собранных в группе островов Кеппель в море Воппабурра и на рифе Дэвис в море Биндал на Большом Барьерном рифе в Австралии. Весь сбор и использование кораллов и гамет осуществлялись со свободного, предварительного и информированного согласия традиционных хранителей соответствующих стран моря. Реагенты и оборудование, использованные для данного исследования, перечислены в Таблице материалов.
1. Преднерестовая подготовка - проверка системы и приготовление раствора активации сперматозоидов и криодилюента
- Убедитесь, что сканер штрихкодов заряжен, активен и настроен на ввод данных электронной таблицы в качестве горизонтального ввода в ячейку. Обратитесь к руководству пользователя считывателя штрихкодов, чтобы настроить эту настройку.
- Приготовьте концентрированные стоковые растворы для активации сперматозоидов кораллов для CASA.
ПРИМЕЧАНИЕ: При работе с химическими веществами для приготовления раствора активации следует надевать одноразовые перчатки.- Приготовьте 30% исходный раствор бычьего сывороточного альбумина (БСА) (5 мл) путем растворения 1,5 г БСА в 4 мл стерильной очищенной воды для культуры тканей с помощью пробирки, установленной на 37 °С, или держа пробирку в сложенных ладонях, периодически осторожно поворачивая (не встряхивая флакон).
- После раствора доведите до конечного объема (5 мл) воду для тканевых культур, нанесите на пробирку дату и отметьте «30% BSA in H2O».
- Хранить в холодильнике (4 °C) до 2 недель.
- Приготовьте 60 мМ раствора кофеина (25 мл), растворив 0,2913 г кофеина в 24 мл фильтрованной морской воды (FSW).
- После попадания в раствор доведите до конечного объема (25 мл) с помощью FSW, пометьте пробирку датой и отметьте «60 mM кофеин в FSW».
- Хранить в холодильнике до 1 месяца.
ПРИМЕЧАНИЕ: Максимальная растворимость кофеина в FSW составляет примерно 71 мМ.
- Приготовьте рабочий раствор для активации сперматозоидов для образцов сперматозоидов в концентрации ~109 сперматозоидов/мл (0,9% БСА + 12 мМ кофеина в FSW).
- Для 10 мл рабочего раствора смешайте 2,0 мл 60 мл стокового раствора кофеина + 0,3 мл 30% стокового раствора BSA + 7,7 мл FSW.
- На пробирке должна быть указана дата и "рабочий раствор для активации сперматозоидов - 0,9% БСА + 12 мМ кофеина".
- Готовьте каждый день использования, храните при комнатной температуре (19-30 °C) и выбрасывайте неиспользованный раствор в конце дня.
- Готовят криопротекторные растворы (криодилюенты). Убедитесь, что при работе с криопротектором ДМСО надеты одноразовые перчатки.
ПРИМЕЧАНИЕ: FSW получают с различными концентрациями криопротекторов в зависимости от начальной концентрации сперматозоидов в образце и желаемой конечной концентрации криоконсервированных аликвот в сперматозоидах. При приготовлении криодилюента убедитесь, что FSW аликвотируется в пробирке объемом 50 мл до добавления ДМСО.- Соберите сырую морскую воду из системы резервуаров, в которых содержатся кораллы до нереста (соленость ~35 ppt).
- Фильтруйте сырую морскую воду с помощью бутылочной системы фильтрации, прикрепленной к вакуумному насосу с установленным непирогенным мембранным фильтром длиной 0,2 мкм.
- Для концентрации сперматозоидов ≥2 × 10–9 сперматозоидов/мл приготовьте 20% ДМСО в FSW, соединив 10 мл ДМСО + 40 мл FSW в пробирке объемом 50 мл.
- Для концентрации сперматозоидов <2 × 10–9 сперматозоидов/мл приготовьте 30% ДМСО в FSW, соединив 15 мл ДМСО + 35 мл FSW в пробирке объемом 50 мл.
- Наклейте на пробирку дату и концентрацию ДМСО, т.е. 30% ДМСО или 20% ДМСО.
- Готовьте каждый день использования, храните при комнатной температуре (19-30 °C) и выбрасывайте неиспользованный раствор в конце каждого дня.
ПРИМЕЧАНИЕ: Смешивание ДМСО и FSW создает экзотермическую реакцию, и криодилюент должен быть приготовлен задолго до использования, чтобы обеспечить охлаждение до комнатной температуры. FSW можно хранить при температуре 4 °C для приготовления криодилюента, чтобы уравновесить это выделение тепла.
- Подготовьте регистратор данных термопары.
- Чтобы измерить приблизительную скорость охлаждения каждого цикла криоконсервации, поместите криовиал, содержащий 10% ДМСО, в FSW с помощью зонда термопары, вставленного через крышку в слот для образцов штатива для криоконсервации рядом с образцами спермы.
- Чтобы сделать флакон с термопарой, проткните или расплавьте небольшое отверстие в крышке криовиала со штрих-кодом и вставьте через отверстие термопару К-типа или Т-типа. Опустите наконечник щупа термопары вниз до уровня, чтобы он находился в середине образца при заполнении флакона, удерживая наконечник зонда по центру флакона, чтобы избежать контакта с внутренней стенкой флакона. Закройте крышку и удерживайте щуп термопары на месте с помощью горячего клея.
- Надев одноразовые перчатки, заполните криовиальную форму со штрих-кодом объемом 10% ДМСО в FSW, равным объему образца спермы, подлежащего криоконсервации.
- Приготовьте свежий 10% ДМСО в FSW и ежедневно наполняйте флаконы с термопарами.
2. Подготовка и оценка спермы
- Для гермафродитных видов (например, видов Acropora ) соберите пучки гамет с поверхности воды с помощью пипетки для переноса объемом 3 мл и поместите их в маркированную пробирку объемом 50 мл в соотношении 5 мл пучков гамет на 5 мл морской воды (общий объем 10 мл).
- Для гонохорных видов соберите сперму из близкого ко рту полипа с помощью пипетки для переноса объемом 3 мл и поместите образец в пробирку с маркировкой объемом 50 мл, затем перейдите непосредственно к шагу 2.8.
ПРИМЕЧАНИЕ: Одноразовые перчатки не являются обязательными для сбора и обработки образцов гамет, но при желании их можно надевать. Руки следует тщательно мыть пресной водой или менять перчатки между каждым образцом гаметы, чтобы избежать перекрестного загрязнения. - Для гермафродитных видов взбалтывайте пучки сперматозоидов и яйцеклеток, осторожно вращая образец вручную до тех пор, пока пучки не разорвутся.
Примечание: Некоторые виды Montipora имеют токсин в яйцах, поэтому им необходимо позволить медленно распадаться с минимальным перемешиванием, чтобы избежать повреждения сперматозоидов. - Дайте образцу постоять 2 минуты в штативе для пробирок, чтобы яйцеклетки всплыли на поверхность и сперматозоиды осядли (яйцеклетки сформируют розово-коричневый слой на поверхности, и отдельные яйцеклетки будут видны; см. рисунок 1i).
- Чтобы отделить сперматозоиды и удалить загрязняющие яйцеклетки, осторожно отсасывайте сперматозоиды со дна пробирки с помощью чистой пипетки для переноса объемом 3 мл.
- Перенесите образец спермы в сетчатый фильтр для клеток размером 100 мкм, расположенный на новой стерильной центрифужной пробирке объемом 50 мл. Проба должна легко проходить через фильтр. Постукивайте по фильтру, чтобы стимулировать поток пробы, и при необходимости можно использовать чистую трансферную пипетку для сбора остатков проб с нижней стороны фильтра. Снимите фильтр, затем плотно закройте трубку, чтобы обеспечить воздухообмен.
- Пометьте отфильтрованный образец спермы идентификатором колонии ID и переместите образец на рабочую станцию для оценки спермы.
- Откройте файл автоматического технического описания биобанка кораллов (Дополнительный файл 1). На вкладке «Оценка сперматозоидов» введите метаданные колонии кораллов (столбцы A-H).
- Подготовьте сперму для оценки CASA.
- Хорошо перемешайте образец спермы и удалите аликвоту объемом 10 мкл в пустую микроцентрифужную пробирку объемом 1,8 мл.
- Немедленно добавьте 0,390 мл рабочего раствора для активации сперматозоидов по каплям в течение 10-20 с, аккуратно перемешивая сперму с раствором. Это дает коэффициент разведения 1:39 (сперма: раствор, v/v) (или коэффициент разбавления 40), что обеспечивает подходящую концентрацию для оценки CASA (~50 × 106/мл), если концентрация исходных сперматозоидов составляет ~2 × 109 сперматозоидов/мл. Переверните пробирку 5 раз и задерните крышку пробирки перед открытием, чтобы раствор осел на дне пробирки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация сперматозоидов для CASA должна быть в диапазоне 8-50 × 106/мл для точного отслеживания сперматозоидов17. При необходимости в аликвоту исходной спермы можно добавить дополнительный рабочий раствор для активации сперматозоидов для снижения концентрации. Пересчитайте степень разбавления и введите это значение в таблицу. В случаях, когда необходимо одновременно обрабатывать много образцов, в микроцентрифужные пробирки объемом 1,8 мл можно предварительно загрузить 0,390 мл рабочего раствора для активации спермы с добавлением непосредственно в него аликвоты образца спермы объемом 10 мкл, а затем хорошо перемешать, перевернув пробирку на 10× и щелкнув крышкой пробирки перед открытием.
- Оцените подвижность сперматозоидов и концентрацию активированного образца с помощью компьютерного анализа спермы (CASA), как описано в Zuchowicz et al.17 , поместив 4 мкл активированной суспензии сперматозоидов в счетную камеру Маклера20 или путем визуальной оценки и подсчета гемоцитометра с помощью фазово-контрастной микроскопии, как описано в Hagedorn et al.4.
ПРИМЕЧАНИЕ: Камеру Makler и покровное стекло необходимо тщательно очистить 70% этанолом, затем дистиллированной водой и протереть безворсовой салфеткой между образцами. - Введите коэффициент разбавления сперматозоидов, используемый для оценки CASA, и введите выходные данные CASA для концентрации сперматозоидов (миллион/мл), общей подвижности (%) и прогрессирующей подвижности (%) в автодаташитет.
ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительные метрики CASA, включая среднюю скорость пути (VAP), прямолинейную скорость (VSL) и криволинейную скорость (VCL), можно дополнительно включить в автоматическую таблицу данных или получить из сохраненных файлов CASA позже. - Запишите концентрацию сперматозоидов на отфильтрованной пробирке с образцом спермы и перенесите образец на рабочую станцию криоконсервации в том же порядке, в котором происходит разрыв и обработка пучка.
3. Разбавление сперматозоидов и уравновешивание криопротекторов
- На рабочей станции криоконсервации откройте тот же файл автоматической таблицы биобанков кораллов, который используется на рабочей станции оценки спермы, и выберите вкладку Криоконсервация . Проверьте этикетку пробирки с образцом спермы и определите соответствующую запись, проверив идентификатор колонии (столбец C). Если вы не обращаетесь к одному и тому же файлу автотаблицы одновременно между рабочими станциями, вручную введите данные в идентификатор колонии (столбец C) и концентрацию сперматозоидов (столбец F) в автоматическом техническом отеле.
- С помощью серологической пипетки измерьте объем образца спермы, втянув образец в пипетку и вытолкнув его обратно в ту же пробирку; введите значение в колонку Е.
- Проверьте автоматически рассчитанный столбец I для требуемой концентрации криопротектора и столбец H для объема добавляемого криодилюента (Таблица 1).
- Запустите таймер на 10 минут и с помощью серологической пипетки немедленно начните добавлять криодилюент по каплям, постоянно осторожно перемешивая образец, обеспечивая при этом надевание одноразовых перчаток для работы с ДМСО.
- Время добавления криодилюента запишите в колонку Р.
| Концентрация сперматозоидов | Криодилюент | Соотношение разведения (сперма:криодилюент) | Конечная концентрация ДМСО в образце спермы (%) |
| < 2 × 109/мл | 30% ДМСО в FSW | 2:1 | 10% |
| ≥ 2 × 109/мл | 20% ДМСО в FSW | 1:1 | 10% |
Таблица 1: Концентрация криодилюента и коэффициенты разбавления для криоконсервации спермы кораллов, основанные на оценке общей концентрации сперматозоидов в образце, подлежащем криоконсервации.
4. Криоконсервация спермы
- Прочтите столбец K, чтобы определить, сколько криовиалов нужно заполнить. Он автоматически рассчитывается на основе общего объема спермы и желаемого объема на флакон (в большинстве случаев 1 мл). В течение 10-минутного инкубационного периода выполните шаги с 4.2 по 4.6.
- Откупорьте стерильные криовиалы со штрих-кодом и установите крышки на чистую/стерильную поверхность.
- Необязательно: Напишите прогон # на каждом криовиале, используя перманентный маркер; Это может помочь в быстрой идентификации образцов для включения в биобанк.
- С помощью серологической пипетки и дозатора аликвотирования, настроенного на желаемый объем образца (1 мл), аликвотные образцы разливаются в незакрытые криовики со штрих-кодом и колпачки.
- Поместите одну пробирку с термопарой и все полные пробирки с образцами на пустую криостойку при комнатной температуре. Убедитесь, что поверхность со штрих-кодом на всех флаконах обращена наружу.
- При необходимости поместите дополнительные манекены, содержащие 10% ДМСО в FSW, в пустые места на криостойке, чтобы убедиться, что все места заняты.
- Введите номер прогона в автоматическое техническое описание (столбец U) и отсканируйте серийный номер криостойки (QR-код) в столбец V.
- Поместите курсор в нужную ячейку столбца Z и выполните сканирование в пробирке с термопарой, а затем все криовиальные пробирки, загруженные на стойку (колонка AA и далее). Не наклоняйте штатив на бок, чтобы проба не попала в резьбу флакона.
- Во время сканирования проверьте, что данные вводятся в правильную ячейку и что все криовиалы были отсканированы один раз.
- Отложите загруженные и отсканированные стеллажи на оставшийся период уравновешивания криопротектора и подготовьте охлаждающий сосуд к криоконсервации.
- Наполните охлаждающую емкость криорешетки жидким азотом до соответствующего заданного уровня, необходимого для охлаждения при температуре приблизительно −20 °C/мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Азот следует использовать только в хорошо проветриваемых помещениях, так как существует риск удушья. При работе с жидким азотом необходимо надевать обувь с закрытым носком, защитные очки/лицевые щитки и криоперчатки. Обратитесь к институциональным рекомендациям для получения конкретной информации о работе с жидким азотом и его использовании. - По истечении 10-минутного периода уравновешивания криопротектора подключите зонд термопары к регистратору данных и начните запись, затем аккуратно поместите полную криостойку в охлаждающий сосуд и накройте крышкой.
- Запишите время начала в столбец Q.
- После того, как пробирка с термопарой покажет на регистраторе данных температуру −80 °C или ниже, охладите образцы в жидком азоте, перенеся вставку криостойки в ванну с жидким азотом в отдельном сосуде, таком как полистирольная коробка.
- Извлеките криовиалы из стеллажа и перенесите их в сухой транспортер для транспортировки в биохранилище.
Результаты
Шаги, описанные в этом протоколе, основаны на оригинальных методах криоконсервации коралловой спермы, описанных Hagedorn et al.4 и последующем усовершенствовании Zuchowicz et al.6, обеспечивая ключевые улучшения для повышения эффективности обработки спермы для криоконсервации и биобанкинга. Использование криовиалов со штрих-кодами и автопипеттора с аликвотированием упрощает процедуру упаковки спермы, устраняя необходимость печатать и вручную маркировать криовиалы, а также снижает нагрузку при ручном пипетировании большого количества образцов. Важно отметить, что эти усовершенствования также сокращают время, необходимое для подготовки образцов для криоконсервации, примерно с 8-10 минут до менее чем 5 минут. Вместе с использованием CASA, эти усовершенствования сокращают количество персонала, необходимого для эффективного биобанкинга спермы кораллов, с 4 до 6 в оригинальных методах до всего двух человек, использующих текущий протокол. Кроме того, использование криовиалов со штрих-кодами означает, что каждая пробирка имеет уникальный идентификатор, поэтому каждую пробирку можно отслеживать в базе данных с более высоким разрешением, чем при предыдущем методе, с использованием этикеток, напечатанных партиями.
Полевые испытания протокола на двух нерестовых мероприятиях во время нерестового сезона на Большом Барьерном рифе 2022 года в Австралии привели к криоконсервации и биобанковскому хранению 389 образцов из 57 колоний 5 видов двумя операторами (один человек для CASA, один человек для криоконсервации), при этом еще один человек помогал в разбивании пучков и отделении сперматозоидов по мере необходимости. Во время нереста в ноябре 2022 года на острове Кономи (остров Северный Кеппел) в Квинсленде, Австралия, два оператора в течение 2 часов крионировали 150 образцов из 24 колоний Acropora millepora . Эффективная обработка и криоконсервация такого объема образцов из такого большого количества коралловых колоний стала возможной в первую очередь благодаря эффективности времени подготовки образцов и упрощенной передаче метаданных между рабочими станциями.
Дальнейшее тестирование рабочего процесса во время нереста в декабре 2023 года показало, что для спермы кораллов счетная камера Маклера обеспечивает более точные данные о подвижности и концентрации по сравнению с коммерчески доступными одноразовыми предметными стеклами с фиксированным покровным стеклопакетом, обычно используемыми с системами CASA. Счетная камера Маклера была валидирована для CASA с использованием коммерчески доступных латексных микрогранул в известной концентрации с объемом образца 4 мкл и стандартными настройками CASA17 , используемыми для коралловой спермы. Эти анализы показали стабильные подсчеты с низкой вариабельностью (44,5 ± 0,7 млн/мл), которые находились в пределах ожидаемого диапазона концентраций (46,0 ± 7,0 млн/мл), предоставленного производителем (рис. 2). Сравнение данных CASA для Acropora millepora, собранных с использованием счетной камеры Маклера и предметных стекол с фиксированным покровным стеклопакетом, показало значительную разницу в подсчетах концентраций сперматозоидов между двумя типами камер (P = 0,002; Рисунок 2), при этом предметные стекла камеры с фиксированным покровным стеклом регистрируют менее половины концентрации, определенной с помощью счетной камеры Маклера. Эта тенденция также наблюдалась в образцах спермы двух других видов кораллов (данные не показаны). Тестирование в декабре 2023 года также не выявило существенной разницы в концентрациях после размораживания общих, подвижных или постепенно подвижных сперматозоидов в образцах, криоконсервированных с использованием разведения 1:1 с 20% ДМСО или разведения 1:2 (сперма: криодилюент) с 30% ДМСО (Рисунок 3).
Рисунок 1: Рабочий процесс, используемый для полуавтоматической обработки спермы кораллов для криоконсервации, и примеры мобильного оборудования, используемого в полевых условиях. (A) Пучки коралловых гамет собираются в соотношении 5 мл пучков на 5 мл FSW и разбиваются на отдельные яйцеклетки и сперматозоиды (i). Метаданные колонии вносятся в автотаблицу данных (ii), а изолированный образец спермы оценивается с помощью компьютерного анализа спермы (CASA) (iii). Параметры качества спермы добавляются в автотаблицу для расчета добавления 20% или 30% ДМСО в FSW (iv), и разведенный образец аликвотируется в криовиалы со штрих-кодом (v). Криографические аппараты загружаются на криоштатив и сканируются в автотехническом описании (vi), а затем охлаждаются со скоростью от −20 °C/мин до −80 °C (vii). Затем образцы закаливаются в жидком азоте и передаются сухим грузам для транспортировки в Банк криоразнообразия Таронга (viii). (B) Пример станций CASA (слева) и криоконсервации (справа), установленных на удаленном полевом участке в классе Центра экологического образования «Кономие». (C) Пример лабораторной высокопроизводительной станции криоконсервации, созданной для работы нескольких криостелей в Национальном морском симуляторе Австралийского института морских наук. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 2: Сравнение двух различных вариантов предметных стекол для измерения концентрации сперматозоидов кораллов . (A) Сравнение измерений общей концентрации сперматозоидов у Acropora millepora (n = 3 особей) с использованием счетной камеры Маклера и коммерчески доступных стационарных предметных стекол. В столбцах указано среднее значение ± СЕМ; звездочки указывают на существенную разницу (P = 0,002). (B) Валидация счетной камеры Маклера с использованием коммерчески доступных латексных микрогранул в известной концентрации и стандартных настройках CASA для коралловой спермы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 3: Концентрации после размораживания общих, подвижных или прогрессивно подвижных сперматозоидов в криоконсервированных образцах. Сравнение после размораживания общих, подвижных и прогрессивно подвижных концентраций сперматозоидов с использованием 20% или 30% ДМСО в FSW для достижения конечной концентрации ДМСО в 10% для криоконсервации. Образцы от n = 3 особей были разделены на 2 аликвоты каждая, при этом одна аликвота была криоконсервирована с добавлением 20% ДМСО в соотношении 1:1, а вторая аликвота была разведена до <2 × 109/мл с использованием FSW для криоконсервации с добавлением 1:2 (сперма: криодилюент) 30% ДМСО. В столбцах указано среднее значение ± SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный файл 1: Файл автоматического технического описания биобанка Coral. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Обсуждение
Полуавтоматизированный процесс обработки, описанный в этом протоколе, позволяет эффективно обрабатывать и криоконсервировать сперму кораллов для получения генетики от видов, находящихся под угрозой исчезновения, и поддержки усилий по восстановлению и адаптации рифов. Мотивацией для разработки данного протокола послужило отсутствие существующих систем, отвечающих требованиям к пропускной способности криоконсервации коралловой спермы и использованию криоконсервации, поскольку высокопроизводительные системы обработки для криоконсервации спермы обычно основаны на упаковке образцов во французские соломинки объемом 0,25 мл или 0,5 мл21,22. Для сравнения, криовиалы обычно используются либо в небольших масштабах для обработки с низкой пропускной способностью (например, криоконсервация лабораторных образцов для исследований23,24), либо в высокопроизводительных системах обработки объемных образцов с использованием дорогостоящего непортативного оборудования (например, обработка клеточных культур для промышленности18,25). Мы также исследовали потенциал использования системы автоматического удаления кап для упрощения снятия и замены криовиальных колпачков, но системы были доступны только для отдельных криовиальных колпачков или для целых криовиальных стоек, поэтому они не представляли собой экономически эффективного решения. В настоящее время в мире существует несколько групп, которые используют протокол криоконсервации, разработанный Хагедорном и соавторами, для обеспечения генетического разнообразия кораллов, и важно, чтобы эта работа продолжала распространяться на большее количество рифов по всему миру. Таким образом, основным соображением при разработке настоящего протокола была необходимость использования экономически эффективных и доступных технологий, которые могли бы быть легко внедрены этими другими группами и которые не были бы непомерно дорогостоящими для новых групп, желающих начать криоконсервацию коралловой спермы.
Ключевым компонентом описанного протокола является улучшенная обработка образцов метаданных с помощью связанных электронных таблиц в Microsoft Excel. Ввод данных, как правило, прост, но следует отметить, что редактирование информации в автоматических таблицах должно выполняться только путем удаления и повторного ввода информации, так как быстрые функции (например, Ctrl + C, Ctrl + V) для редактирования данных потенциально могут повлиять на одновременный ввод данных другими пользователями и могут вызвать проблемы со связыванием данных между электронными таблицами. Важным компонентом метаданных является уникальный идентификатор (а именно идентификатор колонии), который связан с донорской колонией и прикрепляется к образцу на всех этапах пути обработки. Важно, чтобы пробирки с образцами были четко помечены идентификатором колонии во время сбора пучка, и чтобы эта информация была точно переписана на любых новых пробирках, в которые образец переносится во время подготовки (например, во время фильтрации для разделения яйцеклеток и сперматозоидов или для добавления криодилюента). Несмотря на то, что протокол обеспечивает автоматическую передачу информации о качестве образца от оператора CASA на рабочую станцию криоконсервации, проблемы могут возникать при плохом покрытии Интернета или Wi-Fi. При возникновении задержек при передаче данных рекомендуется, чтобы обе рабочие станции работали в автономном режиме и поддерживали отдельные автоматические даташиты, которые впоследствии можно согласовать. Ключевой информацией, требуемой оператором криоконсервации, является идентификатор колонии и концентрация образца, поэтому рекомендуется, чтобы оператор CASA записал концентрацию образца в пробирке с образцом в качестве резервной копии, чтобы гарантировать, что эта информация будет под рукой для подготовки к криоконсервации в случае задержки в загрузке или скачивании метаданных между компьютерами.
Выбор сканера штрих-кода и криовиалов со штрих-кодом, используемых для этого протокола, может варьироваться в зависимости от бюджета и доступности продукта; Тем не менее, есть некоторые ключевые элементы, которые следует учитывать при их выборе. Сканер штрих-кодов должен иметь возможность пользовательских настроек, в частности, возможность изменения спецификаций ввода данных и направления ввода данных. В автоматических даташитах, используемых для этого протокола, используется горизонтальный ввод, но в некоторых случаях (например, при вступлении в биобанк или для других лабораторных целей) может потребоваться вертикальный ввод, поэтому важно, чтобы эта функция была настраиваемой. Несмотря на то, что протокол может использоваться как с 1D, так и с 2D штрих-кодами, рекомендуется, чтобы выбранные криографические коды имели человекочитаемый компонент (например, 1D штрих-коды обычно включают уникальный номер), чтобы обеспечить перекрестную проверку ввода образца во время криоконсервации. В дополнение к вводу образцов, сканер штрих-кодов может использоваться для автоматизации ввода некоторых полей метаданных путем создания и распечатки QR-кодов для информации, которая повторяется в образцах (например, названия видов, даты и местоположения рифов) до начала нереста. Затем эту информацию можно быстро и легко ввести в автоматические спецификации путем сканирования с помощью сканера штрих-кодов. Кроме того, прикрепляя штрих-коды с серийными номерами к каждой криостойке и термопарному зонду, можно также связать каждый цикл криоконсервации с определенным набором оборудования в базе данных, что полезно для контроля качества и выявления компонентов, требующих ремонта или замены.
Ограничивающими факторами при обработке часто являются время, затраченное на ожидание распада пучков, и время, необходимое для фильтрации и отделения сперматозоидов от яйцеклеток до CASA и криоконсервации. По возможности рекомендуется обрабатывать образцы в том порядке, в котором пучки распадаются; Тем не менее, дальнейшее повышение эффективности может быть достигнуто за счет стратегического управления заказами на обработку образцов. Например, если на одну колонию приходится 5 или менее криодилюентов из-за малого объема образца (т.е. менее 3 мл сперматозоидов на колонию) или низкой концентрации сперматозоидов, требующей разведения криодилюентом в соотношении 2:1 (т.е. менее 2 × 109/мл), то лучше добавить криодилюент в два образца колонии одновременно, чтобы их можно было запустить вместе на одной криостойке (всего # доступных слотов = 11), вместо того, чтобы запускать их отдельно с манекенами, заполняющими пустые места. Кроме того, можно одновременно запускать несколько криоштативных аппаратов (для образцов объемом >6 мл) при условии, что все процессы могут быть завершены в течение 10-минутного времени уравновешивания криодилюента, что может еще больше увеличить производительность образца. Тем не менее, при использовании нескольких криостендов или объединении нескольких колоний на одном криостенде необходимо позаботиться о том, чтобы метаданные криоконсервации были назначены правильному образцу в автоматической даташите, особенно если образцы крионируются в порядке, отличном от их оценки CASA.
В дополнение к разработке полуавтоматизированного рабочего процесса, настоящее описание протокола также содержит два методологических сравнения, связанных с концентрацией сперматозоидов, которые направлены на улучшение анализа спермы и результатов криоконсервации. Как правило, сбор 5 мл пучков гамет на 5 мл морской воды (общий объем 10 мл) приведет к концентрации сперматозоидов на уровне или выше 2 × 109 клеток/мл, но бывают случаи, когда концентрация сперматозоидов может быть ниже из-за видовых различий или разрыва пучков во время сбора. Использование криодилюента ДМСО в более высокой концентрации (30% v/v) снижает количество разбавленных сперматозоидов, что помогает свести к минимуму колебания концентрации сперматозоидов в криовиальной камере от партии к партии. Важно отметить, что использование 30% ДМСО для достижения конечной концентрации ДМСО не влияет на параметры концентрации или подвижности после оттаивания, как показано репрезентативными данными на рисунке 3. Второе методологическое сравнение представляет собой альтернативу одноразовым предметным стеклам с фиксированным покровным стеклом, обычно используемым в CASA. Основная проблема с использованием коммерчески доступных предметных стекол для анализа спермы кораллов заключается в том, что они могут повлиять на точность оценки подвижности из-за прилипания сперматозоидов к покрытию предметного стекла. Использование решения для активации позволяет решить эту проблему во многих, но не во всех образцах, поэтому по-прежнему рекомендуется выполнять отдельный анализ CASA на подвижность с использованием простого предметного стекла для обеспечения надежности и согласованности. Использование счетной камеры Маклера устраняет необходимость анализа концентрации и подвижности по отдельности и потенциально повышает точность измерений концентрации (рис. 2), поэтому рекомендуется для использования с текущим протоколом. Учитывая это расхождение в измерениях концентрации, о которомсообщалось ранее, важно всегда записывать детали предметного стекла в базу данных вместе с данными о качестве спермы и, по возможности, быть последовательным в выборе типа используемого предметного стекла камеры, чтобы свести к минимуму вариации от партии к партии и обеспечить надежные расчеты соотношения сперматозоидов и яйцеклеток для оплодотворения.
Описанный в настоящем документе полуавтоматический процесс обеспечивает стандартизированный и эффективный путь криоконсервации и биохранения спермы из находящихся под угрозой исчезновения видов кораллов при сохранении биобезопасности и качества образца. Описанный протокол легко переносится и относительно недорог для реализации в программах по всему миру, которые работают над обеспечением существующего разнообразия кораллов с использованием криоконсервации, что будет иметь важное значение для предотвращения вымирания и максимизации ресурсов, доступных для усилий по восстановлению рифов сейчас и в будущем.
Раскрытие информации
Авторы сообщают, что нет никаких конкурирующих интересов, о которых можно было бы заявить.
Благодарности
Мы благодарим традиционных владельцев Кономие, народ воппабурра, за разрешение опробовать систему, описанную в этом документе, во время нереста на территории страны в ноябре 2022 года, а также Центр экологического образования Кономие за использование их объектов. Мы также хотели бы выразить признательность за поддержку сотрудникам и ученым Австралийского института морских наук, которые способствовали сбору и нересту колоний в рамках Национального морского симулятора. Эта работа была проведена в рамках подпрограммы «Криоконсервация» (RRAP-CP-01) в рамках Программы восстановления и адаптации рифов, партнерства между Фондом рифов правительства Австралии и Фондом Большого Барьерного рифа, при дополнительной поддержке Австралийского общества охраны природы таронга, Научной инициативы по сохранению таронга и других филантропов, поддерживающих Фонд Таронга.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Ovation ALI-Q 2 VS Контроллер пипеток - Аликвотирующий пипетка | Vistalab | 2100-1005 | Работа с жидкостями – измерение объема сперматозоидов, добавление криопротекторного раствора, аликвотирование образцов в криоциальные |
| пипетки объемом 5 мл (оптом) | Thermo Scientific | Nunc 170355 | Работа с жидкостями – измерение объема сперматозоидов, добавление раствора криопротектора, аликвотирование образцов в криовалиальные |
| пипетки 10 мл (объем) | Thermo Scientific | Nunc 170356 | Работа с жидкостями – измерение объема сперматозоидов, добавление раствора криопротектора, аликвотирование образцов в криопротектор |
| P2 0,2– 2 & микро; L пипетка | Gilson | F144054M | Приготовление растворов для активации спермы и работа с образцами спермы для оценки концентрации и подвижности |
| P10 1– 10 & микро; L пипетка | Gilson | F144055M | Приготовление растворов для активации сперматозоидов и работа с образцами спермы для оценки концентрации и подвижности |
| P20 2– 20 &микро; L пипетка | Gilson | F144056M | Приготовление растворов для активации сперматозоидов и работа с образцами спермы для оценки концентрации и подвижности |
| P200 20– 200 &микро; L пипетка | Gilson | F144058M | Приготовление растворов для активации сперматозоидов и работа с образцами спермы для оценки концентрации и подвижности |
| P1000 100– 1000 &микро; L пипетка | Gilson | F144059M | Приготовление растворов активации спермы и работа с образцами спермы для оценки концентрации и подвижности |
| Вакуумный насос | Millipore | WP6122050 | Подготовка фильтрованной морской воды для приготовления раствора |
| Многоразовая бутылочная фильтрующая система | Thermo | Scientific DS0320-5045 | Подготовка фильтрованной морской воды для приготовления |
| раствора0,22-&микро; M Фильтрующие диски, смешанные эфиры целлюлозы | Merck Millipore | GSWP04700 | Приготовление фильтрованной морской воды для приготовления раствора |
| Отфильтрованная морская вода | Н/Д | Базовая среда для активации сперматозоидов и криопротекторных растворов | |
| Диметилсульфоксид (ДМСО) | Sigma-Aldrich | D4540 | Криопротекторное вещество, используемое в конечной концентрации 10% v/v в фильтрованной морской воде для криоконсервации спермы |
| Кофеин | Sigma-Aldrich | C0750 | Используется для активации подвижности сперматозоидов |
| BSA фракция теплового шока | Sigma-Aldrich | A9647 | Используется для минимизации прилипания сперматозоидов к луночным слайдам CASA |
| 15-мл пробирки - штативные | Thermo Scientific | 339651 | Приготовление раствора для активации сперматозоидов |
| 50 мл в пробирках с решеткой | Thermo Scientific | 339653 | Для сбора пучков гамет и отфильтрованных образцов спермы |
| Передаточные пипетки | Thermo Scientific | Samco 202PK | Для помощи в сборе пучков гамет с поверхности воды |
| 100-&микро; m корзины с фильтром | Fisher Scientific | 22363549 | Для исключения яйцеклеток при разделении образца спермы |
| Eppendorf Штативы | Interpath | 511029 | Разведение и активация сперматозоидов для оценки концентрации и подвижности |
| Eppendorf 1,5-мл пробирка | Eppendorf | 30120086 | Разведение и активация сперматозоидов для оценки концентрации и подвижности |
| Стеклянные покровные стекла 18x18 мм | Марка | 4700 45 | Оценка концентрации и подвижности сперматозоидов с помощью фазовой микроскопии |
| Предметные стекла обыкновенного стекла, предварительно очищенные, 75x25 мм | Corning | 2947 | Оценка концентрации и подвижности сперматозоидов с помощью фазовой микроскопии |
| Гемоцитометр | Hausser Scientific | 1492 | Оценка концентрации и подвижности сперматозоидов с помощью фазовой микроскопии |
| Слайды CASA (Leja 20-µ m 4 камера, SC-20-01-04-B) | IMV Technologies | 025107 | Оценка концентрации и подвижности сперматозоидов с помощью компьютерного анализа спермы (CASA) |
| Камера подсчета сперматозоидов Makler (CASA) | ЭКОtore | SM-373 | Оценка концентрации и подвижности сперматозоидов с помощью компьютерного анализа спермы (CASA) |
| accu-bead® счетные бусины | Hamilton-Thorne | 710111 | Оценка концентрации и подвижности сперматозоидов с помощью Computer Assisted Sperm Analysis (CASA) |
| CASA system + ноутбук | Hamilton Thorne | Ceros II | Оценка концентрации и подвижности сперматозоидов с помощью Computer Assisted Sperm Analysis (CASA) |
| Защитные очки | Generic | – | Средства индивидуальной защиты для использования при работе с ДМСО и жидким азотом |
| Лабораторный халат | Длинный рукав, полной длины | ; | Индивидуальное защитное снаряжение для использования при работе с ДМСО и жидким азотом |
| Криоперчатки (пара) | Tempshield | Mid-Arm | Индивидуальное защитное приспособление для использования при работе с ДМСО и жидким азотом |
| Средние щипцы | Generic | – | Для извлечения криоконсервированных образцов из криостендов и манипуляций с образцами в жидком азоте |
| Сканер штрих-кодов (совместимый с 2D) | Zebra | DS2278 | Для считывания 1D и 2D штрихкодов на криовиалах для управления образцами |
| 2,0-мл флакон CryoStorage, внешняя нить, предварительно закрытый, 2D SafeCode (DataMatrix/ECC200), линейный и человекочитаемый | Eppendorf | 30079434 | Криовиальные коды со штрихкодами для криоконсервации образцов спермы |
| Криовиальный штатив | Simport | T315 | Стеллаж для хранения криовиалов, с фиксирующим основанием для снятия крышки и укупорки одной рукой |
| Морозильные стойки | Custom | – | Система криоконсервации, специально разработанная для коралловой спермы, с использованием напечатанных на 3D-принтере и легкодоступных компонентов. Список деталей и инструкции по сборке доступны в Zuchwicz et al., 2021 (doi:10.1016/j.cryobiol.2021.04.005) |
| Крышка решетки для заморозки | Custom | – | Система криоконсервации, специально разработанная для коралловой спермы, с использованием напечатанных на 3D-принтере и легкодоступных компонентов. Список деталей и инструкции по сборке доступны в Zuchwicz et al., 2021 (doi:10.1016/j.cryobiol.2021.04.005) |
| Термос для заморозки – 1,5 литра 18/8 вакуумный контейнер для пищевых продуктов с двойными стенками из нержавеющей стали | Isosteel | ВА-9683 | Система криоконсервации, специально разработанная для коралловой спермы, с использованием напечатанных на 3D-принтере и легкодоступных компонентов. Список деталей и инструкции по сборке доступны в Zuchwicz et al., 2021 (doi:10.1016/j.cryobiol.2021.04.005) |
| Лабораторные таймеры | Generic | – | Для определения времени уравновешивания криопротекторов перед криоконсервацией |
| Азотная ванна 9L | BelArt | M16807-9104 | Для закалки образцов во время криоконсервации и удержания образцов при сортировке и обработке |
| Регистратор данных термопары - многоканальный | Omega | HH520 | Мониторинг температуры во время криоконсервации для определения скорости замерзания и конечной точки |
| Термопара Зонд – Тип K | Omega | 5SC-TT-K-30-36 | Мониторинг температуры во время криоконсервации для определения скорости замерзания и конечной точки |
| Крио-ручки/цветные перманентные ручки | Staedtler Lumocolor | 318 | Опционально для маркировки криовиальных крышек для помощи в управлении образцами |
| Сухой транспортер - заряженный | Taylor Wharton | CXR100 или CX500 | Для переноса криоконсервированных образцов с поля/мест сбора в биорепозиторий для хранение |
Ссылки
- Eakin, C. M., Sweatman, H. P. A., Brainard, R. E. The 2014-2017 global-scale coral bleaching event: Insights and impacts. Coral Reefs. 38 (4), 539-545 (2019).
- Anthony, K., et al. New interventions are needed to save coral reefs. Nature Ecology & Evolution. 1 (10), 1-3 (2017).
- Wildt, D. E. Genome resource banking for wildlife research, management, and conservation. ILAR journal / National Research Council, Institute of Laboratory Animal Resources. 41 (4), 228-234 (2000).
- Hagedorn, M., et al. Preserving and using germplasm and dissociated embryonic cells for conserving Caribbean and Pacific coral. PLoS ONE. 7 (3), e33354(2012).
- Hagedorn, M., et al. First frozen repository for the Great Barrier Reef coral created. Cryobiology. 65 (2), 157-158 (2012).
- Zuchowicz, N., Daly, J., Lager, C., Williamson, O., Hagedorn, M. Freezing on the beach: A robust coral sperm cryopreservation design. Cryobiology. 101, 135-139 (2021).
- Hobbs, R. J., et al. A decade of coral biobanking science in Australia - transitioning into applied reef restoration. Frontiers in Marine Science. , 9(2022).
- Daly, J., et al. Cryopreservation can assist gene flow on the Great Barrier Reef. Coral Reefs. 41, 455-462 (2022).
- Hagedorn, M., et al. Assisted gene flow using cryopreserved sperm in critically endangered coral. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (38), e2110559118(2021).
- Daly, J., et al. Successful cryopreservation of coral larvae using vitrification and laser warming. Scientific Reports. 8, 1-10 (2018).
- Daly, J., et al. The first proof of concept demonstration of nanowarming in coral tissue. Advanced Sustainable Systems. , (2023).
- Powell-Palm, M. J., et al. Cryopreservation and revival of Hawaiian stony corals via isochoric vitrification. Nature Communications. 14, 4859(2023).
- Reef Restoration and Adaptation Program. , Available from: https://gbrrestoration.org (2023).
- Florida Coral Rescue. , Available from: https://myfwc.com/research/habitat/coral/disease/rescue (2023).
- Harrison, P. L. Coral reefs: An ecosystem in transition. , Chapter 6 59-85 (2011).
- Hagedorn, M., Carter, V. L. Cryobiology: Principles, species conservation and benefits for coral reefs. Reproduction, Fertility and Development. 28 (8), 1049(2016).
- Zuchowicz, N., et al. Assessing coral sperm motility. Scientific Reports. 11, 61(2021).
- Thomas, D. Evaluation of an automated cryovial dispensing system for cell banking. Genetic Engineering & Biotechnology News. 37 (17), 22-23 (2017).
- Coral cryopreservation training course. , Available from: https://nationalzoo.si.edu/center-for-species-survival/coral-cryopreservation-training-course (2023).
- Bailey, E., et al. Validation of sperm counting methods using limits of agreement. Journal of Andrology. 28 (3), 364-373 (2007).
- Hu, E., Yang, H., Tiersch, T. R. High-throughput cryopreservation of spermatozoa of blue catfish (Ictalurus furcatus): Establishment of an approach for commercial-scale processing. Cryobiology. 62 (1), 74-82 (2011).
- Pickett, B. W., Berndtson, W. E. Preservation of bovine spermatozoa by freezing in straws: A review. Journal of Dairy Science. 57 (11), 1287-1308 (1974).
- Westbrook, C. E., Daly, J., Bowen, B., Hagedorn, M. Cryopreservation of the collector urchin embryo, Tripneustes gratilla. Cryobiology. 15, 104865(2024).
- Maria, A. N., et al. Use of cryotubes for the cryopreservation of Tambaqui fish semen (Colossoma macropomum). Cryobiology. 70 (2), 109-114 (2015).
- Fuchs, Y. F., et al. Next-generation biobanking: Employing a robotic system for automated mononuclear cell isolation. Biopreservation & Biobanking. 21 (1), 106-110 (2023).
Перепечатки и разрешения
Теги
