Оптимизация визуализации аксонального транспорта эндогенного груза с помощью флуоресцентной микроскопии у живых Caenorhabditis elegans

Summary

В работе описана оптимизация параметров сбора данных флуоресцентной микроскопии для визуализации аксонального транспорта эндогенных меченых грузов с однонейронным разрешением у живой нематоды.

Abstract

Аксональный транспорт является необходимым условием для доставки аксональных белков от места их синтеза в теле нейронной клетки к месту их назначения в аксоне. Следовательно, потеря аксонального транспорта нарушает рост и функцию нейронов. Таким образом, изучение аксонального транспорта улучшает наше понимание биологии нейрональных клеток. С недавними улучшениями в редактировании генома CRISPR Cas9 эндогенная маркировка аксональных грузов стала доступной, что позволило выйти за рамки визуализации транспорта на основе эктопической экспрессии. Тем не менее, эндогенная маркировка часто происходит за счет низкой интенсивности сигнала и требует стратегий оптимизации для получения надежных данных. В данной статье мы описываем протокол оптимизации визуализации аксонального транспорта путем обсуждения параметров сбора данных и подхода к отбеливанию для улучшения сигнала эндогенного меченого груза на диффузном цитоплазматическом фоне. Мы применяем наш протокол для оптимизации визуализации предшественников синаптических везикул (SVP), меченных зеленым флуоресцентным белком (GFP), меченным RAB-3, чтобы показать, как тонкая настройка параметров сбора может улучшить анализ эндогенно меченого аксонального груза у Caenorhabditis elegans (C. elegans).

Introduction

На протяжении всей жизни нейроны полагаются на аксональный транспорт для доставки белков, липидов и других молекул из тела клетки к их конечному пункту назначения в аксоне. Следовательно, нарушение аксонального транспорта связано с потерей функции нейронов и часто участвует в патологии нейродегенеративных расстройств ^1,2. Следовательно, понимание механизмов, лежащих в основе аксонального транспорта, представляет большой интерес.

Несколько десятилетий исследований аксонального транспорта позволили получить много важных сведений о молекулярных механизмах, которые опосредуют этот транспорт, их составе, а также регуляторных механизмах. Дальний аксональный транспорт происходит на цитоскелете микротрубочек, который состоит из частично перекрывающихся полимеров микротрубочек, которые обычно ориентированы плюсовым концом наружу в аксонах³. Следовательно, антероградный транспорт опосредован моторными белками, которые идут к плюсовому концу микротрубочек, кинезинам, тогда как ретроградный транспорт зависит от мотора, направленного на минус конец. Несмотря на то, что многие аспекты транспорта были раскрыты, для многих аксональных белков до сих пор остается неясным, как они загружаются в транспортный механизм, как организованы отдельные транспортные пакеты и^{как регулируется этот} транспорт.

Аксональный транспорт первоначально изучался в экспериментах по радиоактивному мечению, в которых радиоактивно меченые аминокислоты вводились в соматический компартмент, где они включались в зарождающиеся эндогенные белки и могли быть прослежены с течением времени в аксональном компартменте с помощью авторадиографии⁴. Несмотря на то, что эксперименты по радиоактивному мечению позволили изучить аксональный транспорт эндогенных белков in vivo, они не позволяют напрямую следить за поведением отдельного груза для получения механистических идей⁴. Это ограничение было преодолено с помощью флуоресцентной микроскопии. Тем не менее, аксональный транспорт часто визуализируется не на эндогенных белках, а посредством экспрессии флуоресцентной меченой копии. Особенно для белков с низкой экспрессией, сверхэкспрессия обеспечивает более высокую интенсивность сигнала, что делает возможной визуализацию, предпочтительно с разрешением одного нейрона. Более того, эктопическая экспрессия флуоресцентного меченого белка обходит необходимость и проблемы редактирования генома. И наоборот, утверждалось, что поведение эктопически выраженного груза может отличаться от поведения эндогенного^груза5.

Недавние усовершенствования в редактировании генома сделали стратегии эндогенного мечения более доступными. Следовательно, более низкая интенсивность сигнала стала основным ограничением для изучения аксонального транспорта груза путем эктопической экспрессии, а не эндогенной маркировки. Тщательный анализ стратегии эндогенной маркировки в сочетании с оптимизацией условий приобретения может решить эту проблему.

Нематоды представляют собой отличную исследовательскую модель для изучения аксонального транспорта in vivo благодаря их прозрачности и простоте в генетических манипуляциях. В этом протоколе мы описываем исследовательскую стратегию для визуализации аксонального транспорта эндогенных белков с разрешением одного нейрона у живых Caenorhabditis elegans. Мы визуализируем аксональный транспорт предшественников синаптических везикул с помощью штамма, созданного лабораторией Йоргенсена⁶, в котором везикула-ассоциированная RAB GTPase, RAB3, эндогенно помечена GFP в моторном нейроне DA9. Задаваясь вопросом о том, как небольшие изменения в различных параметрах регистрации и фотообесцвечивании могут улучшить визуализацию отдельных событий переноса, протокол дает идеи о том, как оптимизировать условия визуализации.

Protocol

Подробный протокол о том, как поддерживать и подготавливать нематод для визуализации живых клеток, см. в работе S.Niwa ⁷.

1. Генерация штамма червя

В дополнение к генерированию штаммов нематод, Генетический центр Caenorhabditis (CGC)⁸ содержит растущую коллекцию штаммов нематод с эндогенно флуоресцентно помеченными белками, которые можно получить непосредственно с их веб-страницы.

1. Выбор стратегии флуоресцентного мечения
   1. Используйте штамм нематоды MTS1161, который содержит аллель^rab-3(ox699) 6, для визуализации эндогенного GFP, меченного RAB-3, в моторном нейроне DA9 (штамм будет отложен в CGC). Чтобы визуализировать другие аксональные белки, сгенерируйте штамм нематоды с эндогенным меченым белком, используя протокол редактирования CRISPR Cas9 из Mello Lab⁹.
      Примечание: MTS1161 использует рекомбинационный подход для специфической маркировки RAB-3 клеткой эндогенно с помощью метки GFP⁶. Распространенный альтернативный подход основан на восстановлении расщепленного флуоресцентного белка, который рекомендуется для белков с особенно низкой экспрессией, поскольку он увеличивает число флуоресцентных копий на эндогенный белок за счет использования нескольких расщепленных флуоресцентных копий¹⁰. Количество копий может быть первоначально оценено на основе наборов данных транскриптома с веб-страницы CenGen (https://cengen.shinyapps.io/CengenApp/) ¹¹.
2. Выбор нейрона для визуализации аксонального транспорта
   1. В MTS1161 штамма визуализируйте RAB-3 в моторном нейроне DA9 (см. рис. 1). Для других аксональных грузов, особенно белков с низкой экспрессией, определите нейрон, в котором уровни экспрессии анализируемого белка являются самыми высокими, используя веб-страницу CenGen.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Проект CenGen (cengen.org) предоставляет отличный онлайн-ресурс для оценки уровней экспрессии белка, представляющего интерес во многих нейронах нематоды, на основе большого набора транскриптомных данных, охватывающего все 302 нейроны нервной системы C. elegans ^12,13.

2. Работа с червями и подготовка к визуализации

1. Поддерживайте нематод на лужайке из бактерий (штамм: OP50), посеянных на пластинах питательной среды для нематод при температуре 20 °C и выращенных до возраста 1 дня во взрослом возрасте для визуализации.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Измерение транспорта аксонов на определенной возрастной стадии важно, поскольку скорость переноса снижается с последовательным старением различных аксональных грузов, классов нейронов и организмов 14,15,16,17,18-Нематоды на личиночной стадии L4 или через 1 день взрослого возраста были использованы в большинстве работ и, таким образом, предлагают самые большие наборы данных для сравнения.
2. Подготовьте нематод к визуализации живых клеток: выполните все последующие шаги с помощью стереомикроскопа для визуализации и работы с червями.
   1. Перенесите нематод в каплю 0,5 мМ левамизола с помощью медиатора из платиновой проволоки и инкубируйте нематоды в течение 20 минут в капле.
   2. Осторожно внесите 10-20 нематод из капли левамизола в каплю среды М9 объемом 12 мкл на 10% агарозном (растворенном в среде М9) участке на предметном стекле с помощью пилки. Подробную процедуру изготовления 10% агарозного пластыря можно найти в протоколе S.Niwa⁷.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Достаточно установить небольшое количество нематод, так как только несколько животных будут изображены на одном слайде, прежде чем животные начнут страдать от гипоксии.
   3. Поместите крышку на каплю сверху (22 мм x 22 мм или 18 мм x 18 мм). Для переноса изображений в аксоне DA9 расположите аксон близко к защитному листу. Для этого поверните защитный лист на 45° после того, как поместите его поверх агаровой грядки, чтобы перевернуть животных на спину.
   4. Запечатайте пространство между защитным стеклом и предметным стеклом вязким гелем, таким как вазелин. Это предотвратит высыхание агарозного пятна, что может привести к тому, что нематоды выйдут за пределы поля визуализации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно обращаться с животными как можно мягче. Слишком высокие концентрации левамизола или физическое повреждение червя могут нарушить аксональный транспорт. Легкие подергивания хвоста во время сеанса визуализации являются хорошим признаком того, что животное остается в здоровом состоянии. Животные остаются здоровыми и даже могут восстановиться после сеанса визуализации.

3. Микроскопия живых клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Точные значения параметров сбора данных могут отличаться в зависимости от микроскопа. Однако тренды для каждого параметра сбора данных должны быть независимыми от используемого микроскопа. В этом протоколе использовался конфокальный микроскоп с вращающимся диском, который был оснащен отдельной лазерной линией для отбеливания (подробнее о микроскопе см. в Таблице материалов ). Зеленая флуоресценция возбуждалась лазером с длиной волны 488 нм, а излучение фильтровалось эмиссионным фильтром ET525/36. Отбеливание проводилось с помощью лазерной линии с длиной волны 488 нм.

1. Убедитесь, что температура в помещении или, если имеется ступень с регулируемой температурой, установлена на постоянную температуру. Для нематод установите температуру 20 °C.
2. Установите предметное стекло и используйте объектив с 4-20-кратным увеличением, чтобы найти нематод на предметном стекле и запомнить положение. Переключитесь на объектив с 63-кратным увеличением для получения изображений.
3. Сделайте один снимок, чтобы проверить первоначальные параметры захвата. Отслеживайте интенсивность сигнала в поле зрения с помощью гистограммы интенсивности программного обеспечения для сбора данных. Значения интенсивности должны охватывать нижнюю треть максимального сигнала, который может обнаружить камера. Избегайте насыщения пикселей. Увеличьте интенсивность возбуждающего лазера, если интенсивность сигнала слишком низкая.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте лазер слишком высокой интенсивности возбуждения, так как он отбеливает флуоресцентный белок во время покадровой съемки.
4. Измените параметр сбора данных и выполните следующие действия для оптимизации обнаружения флуоресцентного сигнала.
   1. Реализация этапа отбеливания: Отбеливайте область аксона, которая будет анализироваться, с помощью лазерной линии 488 нм (мощность: 15 мВт) для этапа отбеливания. Стремитесь к эффективности отбеливания не менее 90%. Определите эффективность отбеливания, сравнив интенсивность сигнала в области до и после этапа отбеливания.
      Примечание: Обесцвечивание усиливает сигнал движущихся частиц за счет понижения сигнала, исходящего от неподвижных частиц, а также сигнала, исходящего от цитоплазматической фракции белка на заднем плане. Мембранозный груз, такой как RAB-3 на предшественниках синаптических везикул, имеет низкую цитоплазматическую фракцию, поэтому этап отбеливания лишь незначительно улучшает сигнал транспортной упаковки на цитоплазматическом фоне (рис. 2A, D). Тем не менее, обесцвечивание улучшает отслеживание отдельных событий переноса на большие расстояния и позволяет количественно оценить время паузы (рис. 2A).
   2. Биннинг: Используйте биннинг 2 x 2 для повышения интенсивности сигнала отдельных событий переноса. При группировании массивы пикселей объединяются в один большой пиксель. Это снизит пространственное разрешение, но повысит интенсивность сигнала отдельных событий переноса и особенно полезно для тусклых частиц (рис. 2B, D).
   3. Время воздействия: Увеличьте время воздействия для повышения интенсивности сигнала. Увеличение времени экспозиции увеличивает интенсивность сигнала образца за счет получения более низкого временного разрешения для событий переноса. Для данного эксперимента используйте временное разрешение от 300 мс до 700 мс между последовательными временными точками (время экспозиции 100–500 мс), чтобы следить за отдельными событиями переноса RAB-3. (Рисунок 2C,D)
5. Покадровая запись: Сделайте таймлапс не менее 1-3 минут в зависимости от интенсивности сигнала белка, а также частоты отдельных транспортных событий. После того, как таймлапс был зафиксирован, перейдите к следующему животному. Изображения животных на предметном стекле не должны длиться более 30 минут, чтобы убедиться, что запечатленные животные находятся в здоровом состоянии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Легкие подергивания хвоста животного во время записи являются показателем того, что животное все еще живо.

4. Анализ данных аксонального транспорта

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте ImageJ/Fiji¹⁹ для последующих этапов анализа изображений. Фиджи может считывать данные с помощью всех распространенных пакетов программного обеспечения для микроскопии.

1. Генерация кимографа
   1. Импорт данных: Импорт файла данных интервальной съемки на Фиджи. В случае, если он не может импортировать данные на Фиджи, экспортируйте запись времени в виде файла tiff из программного пакета и загрузите его впоследствии на Фиджи.
   2. Коррекция смещения: проверьте, двигался ли или слегка дрейфовал сегмент животного/аксона во время получения изображения. Исправьте движение животных или дрифт, запустив плагин StackReg²⁰. При запуске плагина выберите трансформацию «Твердое тело ».
   3. Ручная генерация кимографа: Подробная пошаговая процедура представлена на рисунке 3. Используйте фильм с коррекцией дрейфа для создания кимографа. Используйте инструмент «Сегментированная линия» и отрегулируйте ширину линии в соответствии с диаметром аксона, дважды щелкнув левой кнопкой мыши по значку сегментированной линии, чтобы провести линию вдоль сегмента аксона, который будет анализироваться. Запустите плагин ImageJ/Fiji Kymoreslicewide, чтобы сгенерировать кимограф и использовать максимальное значение интенсивности по ширине линии в настройках параметров.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сохранение постоянства в направлении рисования линий (например, всегда проксимальнее дистального аксона или наоборот) упрощает трассировку направления движения в обратном направлении на кимографах.
2. Анализ транспортного параметра
   1. Рассчитайте транспортный параметр: номер события, скорость, длину прогона и продолжительность паузы из кимографа, следуя последующим шагам.
      1. Трассировка событий переноса в кимографе: Используйте инструмент «Прямая линия» для трассировки отдельных событий переноса на кимографе. Сохраняйте каждую строку в менеджере ROI и отслеживайте все события переноса в кимографе. Выберите следующие параметры измерения в ImageJ/Fiji: Площадь, Ограничивающий прямоугольник, Среднее значение серого, Диаметр Ферета.
      2. Вычислить параметр переноса: вставьте таблицу результатов в таблицу и используйте следующие столбцы разделов результатов для вычисления:
         Длина прогона: умножьте ширину (в пикселях) на разрешение камеры (например, x μм/pxl), чтобы определить длину прогона в μм.
         Velocity: Длина бега/Продолжительность бега. Чтобы определить продолжительность события движения в секундах, умножьте высоту (в пикселях) на время сбора данных между последовательными временными точками (например, x s/пиксель).
         Время паузы: продолжительность пробега между двумя последовательными движениями, скорость которых равна 0.
         Номер события: Общее количество событий может быть нормализовано на общую длину кимографа, чтобы определить количество событий в минуту и сегмент длины аксона. В свою очередь, события можно разделить на антероградные и ретроградные транспортные события. Чтобы определить направленность каждого события движения, используйте инструмент «Угол ферета». В кимографах, которые изначально были построены путем проведения сегментированной линии от проксимального к дистальному, а события антероградного переноса на кимографе направлены справа налево, угол Ферета < 90° будет указывать на антероградное событие, а >90° — на ретроградное событие, в противном случае все будет наоборот.

Results

Обзор модельной системы и методики измерений
Чтобы визуализировать аксональный транспорт предшественников синаптических везикул, мы проследили эндогенно меченый GFP RAB-3. Здесь мы используем недавно сгенерированный^{штамм 6} GFP::Flip-on::RAB-3, в котором экспрессия рекомбиназы Flippase под клеточно-специфическим промотором (glr-4p) помечает эндогенный RAB-3 в моторном нейроне DA9. DA9 представляет собой биполярный мотонейрон, клеточное тело которого расположено в задней части животного на вентральной стороне, близко к анальному отверстию (рис. 1А). Он содержит короткий дендрит, который проходит спереди вдоль вентрального нервного канатика, и длинный аксон, который проходит сзади, образует спайку, а затем проходит спереди вдоль дорсального нервного канатика, где он образует проходные синапсы, которые иннервируют дорсальную мышцу и нейрон VD 22,23,24. Визуализируем аксональный транспорт в асинаптической области; большинство событий переноса могут быть зафиксированы с помощью одной фокальной плоскости (рис. 1A). Начальный этап фотообесцвечивания осуществляется для уменьшения фона неподвижных везикул в этой области, которые часто имеют тенденцию к паузе в этой области (рисунок 1B). Покадровая видеосъемка записывается в течение 3 минут, а сигнал RAB-3 вдоль асинаптической области отображается на кимографе для извлечения отдельных транспортных событий (рис. 1C).

Настройка параметров сбора данных для оптимизации визуализации аксонального транспорта
Чтобы преодолеть низкую интенсивность сигнала многих эндогенно флуоресцентных меченых белков, необходимо оптимизировать параметры сбора данных микроскопом. Для надежной количественной оценки событий переноса интенсивность сигнала отдельных событий переноса должна быть как можно ярче на цитоплазматическом фоне или во время остановки неподвижного груза. Предшественники синаптических везикул часто останавливаются в асинаптической области в отчетливых бассейнах везикул, что препятствует обнаружению новых входящих везикул и затрудняет отслеживание их транспортных следов⁷.

Один начальный этап флуоресцентного отбеливания может значительно снизить сигнал флуоресценции, исходящий из бассейнов везикул, чтобы улучшить обнаружение движения новых входящих везикул (рис. 2A). Стадия обесцвечивания лишь незначительно усиливала сигнал перемещения везикул RAB-3 над интенсивностью цитоплазматического фона, вероятно, потому, что цитоплазматическая фракция RAB-3 очень низка (рис. 2D).

Использование биннинга обеспечивает дополнительный слой для улучшения сигнала на фоне отдельных транспортных событий за счет объединения массива пикселей в один пиксель. Биннинг 2 x 2 вдвое уменьшит пространственное разрешение (здесь со 108,33 нм/пиксель до 216,7 нм/пиксель), которое по-прежнему достаточно для трассировки отдельных транспортных частиц RAB-3 (рисунок 2B), но значительно улучшает интенсивность сигнала отдельных везикул (рисунок 2D). Если не требуется очень высокое пространственное разрешение, биннинг также может быть применен для визуализации многих других аксональных грузов.

Затем мы задались вопросом о том, как изменения во времени воздействия могут улучшить интенсивность сигнала при одиночных событиях переноса. Мы специально включили время экспозиции в анализ, чтобы также продемонстрировать, что время экспозиции до 500 мс с 700 мс между последующими временными точками визуализации по-прежнему обеспечивает временное разрешение, при котором можно отслеживать предшественники синаптических везикул (рис. 2C, D).

Генерация и анализ кимографов с помощью Фиджи
Чтобы создать кимограф и проанализировать отдельные события переноса, выполните действия, показанные на рисунке 3.

Рисунок 1: Обзор модельной системы для визуализации аксонального транспорта эндогенного флуоресцентного RAB-3. (A) Верхняя панель: Обзор нематоды с указанием задне-передней и вентрально-дорсальной оси. Моторный нейрон DA9 помечен синим цветом. Средняя панель: Увеличьте прямоугольную область, показанную на верхней панели, с указанной компартментализацией DA9. Синапсы en passant изображены зеленым цветом, * указывает на анус. Обратите внимание, что аксон продолжается в дорсальном нервном канатике до тех пор, пока не пройдет через вульву. Красным прямоугольником обозначена область асинаптической зоны. Нижняя панель: Конфокальное микроскопическое изображение эндогенного GFP, меченного RAB-3, в проксимальном аксоне в одной фокальной плоскости. Обратите внимание, что в асинаптической области есть везикулы с более длительной паузой RAB-3, хотя большинство сигнальных кластеров RAB-3 находятся в синаптической области. Асинаптическая область выделена в красный цвет. Масштаб: 20 мкм. (B) Репрезентативные изображения покадровой записи для визуализации транспорта аксонов. Для повышения прослеживаемости отдельных транспортных частиц над неподвижными частицами асинаптическая область первоначально подвергается фотообесцвечиванию. На нижних панелях в фиолетовой прямоугольной области показан пример события антероградного (оранжевая стрелка) и ретроградного (синяя стрелка) движения. Панели сверху вниз представляют последовательные временные точки. (C) Покадровая съемка в точке (B) была построена в виде кимографа (2D-представление зависимости времени от положения). Диагональные линии представляют события движения, в которых наклон указывает на скорость. Вертикальными линиями обозначены стационарные события. Фиолетовый прямоугольник представляет собой увеличенное изображение кимографа, чтобы выделить события переноса, которые также показаны на рисунке (B), а также проследить события антероградного (оранжевый) и ретроградного (синий) переноса. Пунктирными вертикальными линиями обозначены события паузы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Оптимизация этапов и параметров сбора для улучшения визуализации эндогенного аксонального груза. Эндогенные GFP::RAB-3 визуализировали в асинаптической зоне аксона DA9, получая изображения одной фокальной плоскости на микроскопе с конфокальным вращающимся диском. Кимографы были получены для визуализации отдельных транспортных событий в антероградном (справа налево) и ретроградном (слева направо) направлении (A-C). (A) Кимографы показывают события переноса RAB3 без (левые кимографы) или со встроенной стадией отбеливания. Обратите внимание, что шаг обесцвечивания улучшает визуализацию событий паузы (обозначены желтыми стрелками) между последовательными событиями переноса (оранжевые стрелки). (B) Реализация биннинга 2 x 2 помогает улучшить интенсивность сигнала слабых событий переноса RAB3. Изображения были получены с экспозицией 300 мс и с помощью (C) постепенное увеличение времени экспозиции (от 100 мс в крайнем левом углу до 500 мс в крайнем правом углу) помогает улучшить интенсивность сигнала отдельных транспортных событий. Изображения были получены при группировании 2 x 2 и с использованием начальной стадии фотообесцвечивания. Все кимографы отображают общую продолжительность 3 минуты и рисуются в одном и том же масштабе, поэтому кимографы с меньшим количеством точек времени сбора данных из-за более длительного промежутка времени между последовательными точками изображения имеют меньшую общую длину кимографа. (D) Количественная оценка интенсивности сигнала для каждого транспортного события после вычитания фоновой флуоресценции из кимографов в (A-C). Обратите внимание, что биннинг и этап фотоотбеливания были получены при времени экспозиции 300 мс. Статистическое сравнение с использованием n событий за 100 мс (n_{событий} = 27 у n_{животных} = 2), 200 мс (n_{событий} = 30 у n_{животных} = 2), 300 мс (n_{событий} = 88 у n_{животных} = 6), 500 мс (n_{событий} = 12 у n_{животных} = 1), 300 мс без биннинга (w.o.) биннинга (n_{событий} = 31 у n_{животных} = 3), 300 мс с биннингом (w ) биннингом (n_{событий} = 88 у n_{животных} = 6) и 300 мс, 2 x 2 контейнера с отбеливанием (n_{событий} = 88 в n_{животных} = 6) и без отбеливания. Каждая точка данных представляет интенсивность сигнала отдельного транспортного события RAB-3 после фонового вычитания (цитоплазмы аксона) в одной временной точке вдоль его трассы, которая была выбрана случайным образом. Время экспозиции сравнивали с помощью теста Краскела-Уоллиса с последующим множественным сравнением Данна, биннинг и фотообесцвечивание сравнивали с помощью парного теста Манна-Уитни. Полосы погрешностей указывают на стандартное отклонение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Пошаговая процедура создания кимографа и измерения отдельных событий переноса. (A) После загрузки видеозаписи на Фиджи, инструмент сегментированной линии используется для трассировки линии вдоль длины аксонального сегмента, который будет анализироваться. (B) Кимограф (правая панель) генерируется с помощью плагина Kymoreslicewide с параметрами, изображенными на левой панели. (C) Отдельные события переноса отслеживаются с помощью инструмента линейной линии и сохраняются в менеджере ROI. На правой панели отображаются настройки измерений, которые используются для создания таблицы результатов. (D) Результаты, приведенные в таблице, используются для расчета параметров перевозки. В полях указываются важные параметры, которые описаны в разделе протокола, посвященном методам. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Discussion

Ограничения метода и альтернативные методы
В этом протоколе мы оптимизировали параметры сбора данных для визуализации аксонального транспорта эндогенно меченого RAB-3, который связан с предшественниками синаптических везикул. Для визуализации RAB-3 мы использовали недавно опубликованный^{штамм 6} FLIP-on::GFP::RAB-3 и экспрессировали рекомбиназу Flippase под клеточно-специфическим промотором (glr-4p)²⁵. Эта стратегия позволяет нам маркировать RAB-3 одним флуорофором GFP. RAB-3 относительно легко визуализировать, потому что он высоко экспрессирован и сильно обогащен предшественниками синаптических везикул, так что отдельные транспортные события имеют яркую интенсивность сигнала на фоне низкого сигнала, который исходит от цитоплазматического фона. Для других аксональных белков могут потребоваться дополнительные стратегии оптимизации за пределами микроскопии, чтобы обеспечить визуализацию транспортных событий. Особенно для белков с низкой экспрессией, система split-GFP является отличной альтернативой. В этой системе GFP₁₁ встраивается в эндогенный локус интересующего белка, а GFP_1-10 экспрессируется из клеточного специфического промотора. Большим преимуществом этой системы является небольшой размер матрицы репарации ДНК (примерно 70 нуклеотидов), которая должна быть вставлена геномно, что делает гомологичной рекомбинацию более эффективной по сравнению с введением ORF всей флуоресцентной метки^26,27. Из-за своего небольшого размера множественные фрагменты GFP₁₁ могут быть вставлены в эндогенный белок, что увеличивает количество восстановленных флуорофоров GFP на белок и, таким образом, усиливает флуоресцентный сигнал эндогенного белка и, следовательно, транспортного пакета²⁸.

В дополнение к мечению белка с помощью метода расщепления GFP или GFP, могут быть использованы другие генетически кодируемые флуорофоры, которые имеют уникальные преимущества и недостатки в отношении их фотохимических свойств, которые^{были недавно} сравнены. Кроме того, химические флуорофоры с более фотостабильными свойствами могут быть использованы путем эндогенного мечения интересующего белка тегом^{HALO или SNAP 30}.

Особенно для цитоплазматических белков, которые в изобилии присутствуют по всему аксону, может потребоваться подход с условным мечением. Недавно мы визуализировали такой груз, эндогенный спектрин, с помощью флуоресцентной микроскопии с использованием временной маркировки для визуализации только новых синтезированных спектриновых белков. Для условной маркировки с разрешением одного нейрона мы объединили экспрессию рекомбиназы, вызванную тепловым шоком, с системой расщепления^{GFP 31}.

Если цель исследования направлена на понимание транспорта органелл, экспрессия белкового домена, который связан с органеллой, может обеспечить альтернативу эктопической экспрессии полноразмерного белка.

Критические шаги в протоколе
Тщательная подготовка для оптимизации визуализации белка на основе ожидаемых уровней экспрессии, а также выбор оптимальной стратегии мечения особенно важны для успешной визуализации эндогенных меченых белков. Уровни экспрессии большинства белков во многих нейронах можно оценить на основе набора данных транскриптомии из Cengen¹³. Ожидаемая низкая интенсивность сигнала транспортных событий для низкоэкспрессированных или цитоплазматических белков может быть улучшена путем присоединения нескольких копий флуорофора. Обратите внимание, однако, что при проведении любого эксперимента по мечению необходимо соблюдать осторожность, чтобы не нарушить функцию меченого белка. В случае, если существует известный фенотип для соответствующего мутанта, важно убедиться, что мечение не генерирует этот фенотип. В случаях, когда фенотип неизвестен, требуются альтернативные подходы, которые будут варьироваться в каждом конкретном случае.

Важнейшим этапом визуализации событий аксонального транспорта является состояние здоровья животного. С животными следует обращаться как можно бережнее как можно более бережно при подготовке изображения, а также во время визуализации (например, использование чистильщика вместо металлической проволоки для переноса парализованных животных, минимизация времени инкубации в парализующем агенте, минимизация времени визуализации во избежание фототоксичности).

Модификации и устранение неполадок
В то время как мы намерены оптимизировать визуализацию аксонального транспорта эндогенных белков, стратегии оптимизации параметров сбора также применимы к эктопическим экспрессированным белкам. Особенно если уровни эндогенной экспрессии слишком низки для визуализации транспортных событий, эктопическая экспрессия белка может обеспечить альтернативу.

В случае, если транспортные события не могут быть зарегистрированы, несмотря на сильную интенсивность сигнала эндогенного меченого белка, животные могут находиться в нездоровом состоянии. Эту проблему можно решить, подготавливая животных к микроскопии с помощью более щадящих процедур подготовки (например, сократив время инкубации парализующего агента). Кроме того, события переноса могут быть редкими, и 3-минутной видеозаписи может быть недостаточно для фиксации событий. Захват редких событий переноса может быть оптимизирован за счет увеличения продолжительности видеозаписи, увеличения количества изображенных животных или за счет визуализации животных на другой стадии развития, на которой события переноса могут быть более частыми.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539
Защитные накладки (22 мм x 22 мм, No1); Покровное стекло с золотой печатью	Thomas Scientific	6672A14
Levamisole	ChemCruz	sc-205730
Микроскоп: инвертированный микроскоп Nikon Ti2, скан-головка Yokogawa CSU-W1 SoRa, фотоаппарат Hamatsu Orca-Fusion BT sCMOS, масляный иммерсионный объектив Nikon CFI Plan Apo lambda 60x 1.4 NA, фотостимулирующий сканер Nikon на 488 нм с эмиссионным фильтром ET525/36	Конфокальный микроскоп
Nikon с вращающимся диском  NIS-элементы AR	Программное обеспечение Nikon		для Nikon Ti2
Простые предварительно очищенные микроскопические стекла	Thermo Scientific	420-004T
Nematode strain	Identifier	Source
rab-3(ox699[GFP::flip-on::rab-3]) (II); shyIs43(glr-4p::FLP-NLSx2; odr-1p::RFP) (II)	Park et al. (DOI: 10.1016/j.cub.2023.07.052)	MTS1161	Будет депонировано в CGC (https://cgc.umn.edu/)