Method Article

Обнаружение и количественная оценка ДНК вируса гепатита В в режиме реального времени на основе полимеразной цепной реакции

DOI:

10.3791/66249

⸱

December 15th, 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
13B BlackBio Biotech India Limited

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Обнаружение и количественная оценка ДНК вируса гепатита В (ВГВ) методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени является чувствительным и точным методом диагностики и мониторинга инфекции ВГВ. Здесь мы представляем протокол обнаружения ДНК ВГВ и измерения вирусной нагрузки в образце.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Вирус гепатита В (ВГВ) является одной из основных причин заболеваний печени во всем мире. Это может привести к острым или хроническим инфекциям, что делает людей очень восприимчивыми к смертельному циррозу и раку печени. Точное обнаружение и количественное определение ДНК ВГВ в крови имеют важное значение для диагностики и мониторинга инфекции ВГВ. Наиболее распространенным методом обнаружения ДНК ВГВ является ПЦР в реальном времени, которая может быть использована для обнаружения вируса и оценки вирусной нагрузки для мониторинга ответа на противовирусную терапию. В этой статье мы опишем подробный протокол обнаружения и количественного определения ДНК ВГВ в сыворотке или плазме крови человека с использованием набора для ПЦР в реальном времени с маркировкой IVD. В наборе используются праймеры и зонды, которые нацелены на высококонсервативную основную область генома ВГВ и могут точно количественно определить все генотипы ВГВ (A, B, C, D, E, F, G, H, I и J). Набор также включает в себя эндогенный внутренний контроль для мониторинга возможного ингибирования ПЦР. Этот анализ рассчитан на 40 циклов, а его пороговое значение составляет 38 Ct. Для количественного определения ДНК HBV в клинических образцах в комплекте с набором поставляется набор из 5 стандартов количественного определения. Стандарты содержат известные концентрации ДНК, специфичной для ВГВ, которые откалиброваны в соответствии с4-м Международным стандартом ВОЗ по ДНК ВГВ для теста на нуклеиновые кислоты (код NIBSC 10/266). Стандарты используются для проверки функциональности амплификации ДНК, специфичной для ВГВ, и для создания стандартной кривой, позволяющей количественно определить ДНК ВГВ в образце. С помощью набора для ПЦР была выявлена ДНК вируса гепатита В до 2,5 МЕ/мл. Высокая чувствительность и воспроизводимость набора делают его мощным инструментом в клинических лабораториях, помогая медицинским работникам эффективно диагностировать и лечить инфекции ВГВ.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Вирус гепатита В (HBV) представляет собой частично двухцепочечный ДНК-вирус из рода Orthohepadnavirus и семейства Hepadnaviridae 1. Он может спровоцировать хроническую инфекцию, которая сохраняется на протяжении всей жизни, потенциально приводя к циррозу печени и гепатоцеллюлярной карциноме 2,3,4. По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), в 2019 году население страны составляло 296 миллионов человек с хронической инфекцией гепатита В, икаждый год 1,5 миллиона человек заражались новыми инфекциями.

Идентификация и измерение ДНК ВГВ в образцах сыворотки или плазмы служат ценным методом для выявления лиц с текущей инфекцией гепатита В, оценки эффективности противовирусного лечения и прогнозирования вероятности успеха лечения 6,7,8,9,10,11. Высокая вирусная нагрузка связана с повышенным риском прогрессирования заболеваний печени, включая цирроз и рак печени12,13. Следовательно, точное измерение вирусной нагрузки имеет решающее значение для отслеживания прогрессирования инфекции ВГВ и принятия обоснованных решений о лечении.

Количественные ПЦР-анализы в реальном времени обладают более высокой чувствительностью, более широким динамическим диапазоном и более точным количественным определением ДНК ВГВ, чем традиционные методы ПЦР 14,15,16,17. На рынке доступно несколько коммерческих наборов молекулярной диагностики на основе ПЦР в реальном времени для количественного определения ДНК ВГВ в образцах сыворотки или плазмы. В этой статье мы подробно опишем рабочий процесс обнаружения и количественного определения ДНК вируса гепатита В в сыворотке или плазме крови человека с использованием коммерчески доступного набора для ПЦР в реальном времени с маркировкой IVD. Этот набор представляет собой широко используемый18,19, недорогой, но высокочувствительный анализ, и его эксплуатационные характеристики сопоставимы с другими коммерчески доступными наборами с маркировкой CE18. Помимо амплификации целевой области ВГВ, в набор также включен эндогенный ген внутреннего контроля для проверки качества образцов, качества выделенной ДНК, амплификации ПЦР и возможного ингибирования ПЦР.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом исследовании не участвовали люди или клинические образцы. Единственным использованным биологическим материалом был4-й Международный стандарт ВОЗ по ДНК ВГВ для анализа нуклеиновых кислот (код NIBSC 10/266). Настоящий стандарт является общедоступным справочным материалом, не содержащим никакой личной информации или идентифицируемых данных. Таким образом, для этого исследования не требовалось никакого этического одобрения.

1. Экстракция ДНК

  1. Извлечение вирусной ДНК из образца сыворотки или плазмы крови человека. Выделенную ДНК хранят при -20 °C до дальнейшего использования в ПЦР.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуемый объем сыворотки или плазмы для экстракции ДНК составляет 500 мкл, а объем элюирования - 50 мкл. В этом исследовании вирусная ДНК была выделена с помощью набора для экстракции вирусных нуклеиновых кислот (таблица материалов).

2. ПЦР в реальном времени

  1. Перед началом ПЦР разморозьте все реагенты (Таблица 1) набора для ПЦР в реальном времени при комнатной температуре (RT; 15-25 °C). После размораживания компоненты перемешивают импульсным вихрем в течение 10 с при умеренной скорости и центрифугируют при 8 000 × г в течение 15 с при RT. Храните все размороженные компоненты на охлаждающем блоке.
  2. Подготовка к реакции
    1. Приготовьте ПЦР-смесь в соответствии с таблицей 2. Рассчитайте объем добавляемых реагентов на основе количества образцов, стандартов и отсутствия контроля шаблона.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При приготовлении смеси для ПЦР следует добавить не менее 10% дополнительного объема каждого реагента (например, если требуется 10 реакций, рассчитайте для 11 реакций).
    2. Пипетку 15 мкл вышеуказанной ПЦР-смеси в каждую ПЦР-пробирку. Затем добавьте 15 мкл выделенного образца ДНК. Добавьте 15 мкл, по крайней мере, одного из стандартов для HBV (HBV Standard 1-5) в качестве положительного контроля (PC) для обнаружения ДНК HBV и 15 мкл воды, не содержащей нуклеаз для ПЦР, в качестве отрицательного контроля (NC). Чтобы создать стандартную кривую, необходимую для количественного определения ДНК ВГВ, используйте все 5 стандартов количественного определения, поставляемых с набором (Стандарт ВГВ 1-5) для каждого запуска ПЦР.
    3. Закройте пробирки, смешайте компоненты импульсным вихревым способом в течение 10 с при умеренной скорости и центрифугируйте при 8 000 × г в течение 15 с при RT перед тем, как перейти к термоциклеру. Убедитесь, что в реакционной смеси нет пузырьков, так как они могут помешать обнаружению флуоресценции.
  3. Настройка программы
    1. Запрограммируйте амплификатор, используя условия циклирования, как рекомендовано в таблице 3.
  4. Выбор канала/флуорофора
    1. Выберите флуоресцентные красители для широко используемых платформ ПЦР в реальном времени, как указано в таблице 4.
  5. Анализ данных
    1. После завершения прогона проанализируйте график усиления по линейной шкале.
    2. Установка порога
      1. Установите порог в пределах экспоненциальной фазы ПЦР-реакции. Рекомендуемые пороговые значения для комплекта приведены в таблице 5. Соблюдайте пороговое значение. После того, как оптимальный порог для анализа определен, используйте его последовательно для всех образцов для конкретного ПЦР-аппарата. Это поможет гарантировать, что результаты будут точными и воспроизводимыми.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Если пороговое значение установлено слишком низко, сигнал может быть ниже уровня шума, и значение Ct будет ненадежным. Если пороговое значение установлено слишком высоко, сигнал может находиться в фазе плато реакции, где усиление не так эффективно, а значение Ct может быть неточным.
    3. Отсечка
      1. Запустите комплект на 40 циклов усиления. Не рассматривайте возможность усиления сверх 38 циклов для любой интерпретации.
    4. Качественный анализ результата
      1. Используйте набор для качественного обнаружения ДНК ВГВ. Используйте Стандарт 2 в качестве ПК с ожидаемыми значениями Ct 20 ± 2 для HBV и 24 ± 3 для IC.
      2. Убедитесь, что ни один шаблонный элемент управления (NTC) не демонстрирует усиления как для HBV, так и для целей внутреннего контроля (IC). Если в реакции NTC происходит реакция амплификации, то, возможно, произошло загрязнение образца.
      3. Поскольку пороговое значение для анализа составляет 38, рассматривайте любую амплификацию до 38 Ct для мишени HBV как HBV-положительный образец. Когда все контрольные элементы удовлетворяют вышеуказанным требованиям, рассматривают образец, следуя интерпретациям, указанным в таблице 6.
    5. Количественный анализ результатов
      1. Используйте набор из 5 количественных стандартов известных концентраций для ДНК, специфичной для ВГВ, которые откалиброваны в соответствии с 4-м Международным стандартом ВОЗ для ДНК ВГВ для методов амплификации нуклеиновых кислот (NAT)20 (таблица 7).
      2. Используйте эти стандарты для создания стандартной кривой. Используйте стандартную кривую для количественного определения ДНК вируса гепатита В неизвестного образца.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение для ПЦР в режиме реального времени построит стандартную кривую, используя значения Ct, полученные для мишеней для HBV всех 5 стандартов, и их соответствующие концентрации в международных единицах на микролитр (МЕ/мкл).
      3. Интерпретируйте значения для неизвестных образцов только в том случае, если наклон стандартов находится в диапазоне от -3,1 до -3,6, значение R2 находится в диапазоне от 0,99 до 1,0, эффективность ПЦР находится в диапазоне от 90% до 110% (0,9-1,1) и отсутствует амплификация в отрицательном контроле.
      4. Программное обеспечение рассчитает концентрацию каждого HBV-положительного образца в международных единицах на микролитр (МЕ/мкл). Для расчета вирусной нагрузки (пересчета МЕ/мкл в международные единицы на миллилитр [МЕ/мл]) используйте следующее уравнение:
        Результат (МЕ/мл) = (Результат [МЕ/мкл] x Объем элюирования [мкл])/ Объем образца (мл)
        ПРИМЕЧАНИЕ:4-й Международный стандарт ВОЗ для ДНК гепатита В, код NIBSC 10/266, был экстрагирован для очистки вирусной ДНК из 0,5 мл плазмы, элюирован очищенной вирусной ДНК в 50 мкл элюирующего буфера и использован с набором для ПЦР в качестве эталонного образца вместе со стандартами 5 HBV и NTC. Вирусную нагрузку ВГВ контрольного образца (код NIBSC 10/266) рассчитывали как (6659 МЕ/мкл х 50 мкл)/0,5 мл = 6,65,900 МЕ/мл.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Принципиальная схема рабочего процесса по обнаружению и количественному определению ДНК вируса гепатита В из плазмы/сыворотки крови человека показана на рисунке 1. График усиления Стандарта 2 (используется в качестве ПК) и NTC как для HBV, так и для IC показан на рисунке 2. На рисунке 3 показаны кривые амплификации для HBV-положительного образца, HBV-отрицательного образца и образца с ингибированием ПЦР. Кривая амплификации, значени...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Коду NIBSC 10/266 присвоена единица 9,55,000 МЕ/мл при восстановлении в 0,5 мл безнуклеазной воды в соответствии с информацией поставщика21. Это можно считать высоконагруженным HBV-положительным образцом. Вирусная нагрузка ВГВ, определенная с помощью набора вирусной нагрузки, использованного в этом исследовании, составила 6 65 900 МЕ/мл (рис. 4). Поскольку эффективность экстракции ДНК любого набора для экстракции ДНК не равна 100%, часть ДНК часто теряется в процессе ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы связаны с компанией Kilpest India Limited, производителем набора для определения вирусной нагрузки ВГВ, используемого в этом исследовании.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Выражаем благодарность за техническую помощь Правину, Кусуму, Чандану, Ише, Рашми, Бабли, Шивани, Анките и Шикхе.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
4th Международный стандарт ВОЗ по вирусу гепатита В ДНКNIBSCNIBSC код: 10/2664-й Международный стандарт ВОЗ по ДНК вируса гепатита В (ВГВ), код NIBSC 10/266, предназначен для использования для калибровки вторичных референтных реагентов, используемых в методах амплификации нуклеиновых кислот (NAT) ВГВ.
Машины для ПЦР в реальном времени ABI ThermoFisher ScientificABI 7500; QuantStudio 5Это машина для ПЦР в реальном времени 
HBV, HCV and HIV Multiplex 14/198NIBSCNIBSC код: 14/198Это очень низкоположительный триплексный реагент для анализов NAT, содержащих гепатит В (HBV), гепатит C (HCV) и вирус иммунодефицита человека-1 (HIV-1)
QIAGEN Аппарат для ПЦР в реальном времениQiagenRotor-Gene QЭто аппарат для ПЦР в реальном времени 
Комплект для измерения вирусной нагрузки HBV Kilpest India Limited3B294Это набор на основе ПЦР в реальном времени, используемый в этом исследовании для обнаружения ДНК HBV и определения вирусной нагрузки
TRUPCR Набор для экстракции вирусных нуклеиновых кислотKilpest India Limited3B214Это набор для экстракции ДНК, используемый для экстракции вирусной ДНК HBV из NIBSC:10/266 и NIBSC:14/198

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ryu, W. -S. Molecular Virology of Human Pathogenic Viruses. , Elsevier, Academic Press. (2016).
  2. Lin, X., et al. Chronic hepatitis b virus infection in the Asia-Pacific region and Africa: Review of disease progression. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 20 (6), 833-843 (2005).
  3. Iloeje, U. H., et al. Predicting cirrhosis risk based on the level of circulating Hepatitis B viral load. Gastroenterology. 130 (3), 678-686 (2006).
  4. Huang, Y. -T., et al. Lifetime risk and sex difference of hepatocellular carcinoma among patients with chronic Hepatitis B and C. Journal of Clinical Oncology. 29 (27), 3643(2011).
  5. World Health Organization. World Health Organization fact sheet. , https://www.who.int/news-room/fact-sheets (2023).
  6. Watanabe, M., Toyoda, H., Kawabata, T. Rapid quantification assay of hepatitis b virus DNA in human serum and plasma by fully automated genetic analyzer mutaswako g1. PLoS One. 18 (2), e0278143(2023).
  7. Chan, H. L. -Y., et al. Viral genotype and Hepatitis B virus DNA levels are correlated with histological liver damage in HBeAg-negative chronic Hepatitis B virus infection. The American Journal of Gastroenterology. 97 (2), 406-412 (2002).
  8. Liu, C. J., et al. Viral factors correlate with Hepatitis B e antigen seroconverson in patients with chronic Hepatitis B. Liver International. 26 (8), 949-955 (2006).
  9. Liu, C. -J., et al. Role of Hepatitis B viral load and basal core promoter mutation in hepatocellular carcinoma in Hepatitis B carriers. The Journal of Infectious Diseases. 193 (9), 1258-1265 (2006).
  10. Yeo, W., et al. Hepatitis B viral load predicts survival of HCC patients undergoing systemic chemotherapy. Hepatology. 45 (6), 1382-1389 (2007).
  11. Yim, H. J., et al. Levels of Hepatitis B virus (HBV) replication during the nonreplicative phase: HBV quantification by real-time PCR in korea. Digestive Diseases and Sciences. 52, 2403-2409 (2007).
  12. Noh, R., et al. Clinical impact of viral load on the development of hepatocellular carcinoma and liver-related mortality in patients with hepatitis c virus infection. Gastroenterology Research and Practice. 2016, 7476231(2016).
  13. Mendy, M., et al. Hepatitis B viral load and risk for liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma in the Gambia, West Africa. Journal of Viral Hepatitis. 17 (2), 115-122 (2010).
  14. Abe, A., et al. Quantitation of Hepatitis B virus genomic DNA by real-time detection PCR. Journal of Clinical Microbiology. 37 (9), 2899-2903 (1999).
  15. Pas, S. D., Fries, E., De Man, R. A., Osterhaus, A. D., Niesters, H. G. Development of a quantitative real-time detection assay for Hepatitis B virus DNA and comparison with two commercial assays. Journal of Clinical Microbiology. 38 (8), 2897-2901 (2000).
  16. Ronsin, C., Pillet, A., Bali, C., Denoyel, G. R. -A. Evaluation of the cobas ampliprep-total nucleic acid isolation-cobas Taqman Hepatitis B Virus (HBV) quantitative test and comparison to the versant HBV DNA 3.0 assay. Journal of Clinical Microbiology. 44 (4), 1390-1399 (2006).
  17. Sum, S. S. M., Wong, D. K. H., Yuen, J. C. H., Lai, C. L., Yuen, M. F. Comparison of the cobas taqman™ HBV test with the cobas amplicor monitor™ test for measurement of Hepatitis B virus DNA in serum. Journal of Medical Virology. 77 (4), 486-490 (2005).
  18. Lall, S., Choudhary, M. C., Mahajan, S., Kumar, G., Gupta, E. Performance evaluation of TRUPCR® HBV real-time PCR assay for Hepatitis B virus DNA quantification in clinical samples: Report from a tertiary care liver centre. Virusdisease. 30 (2), 186-192 (2019).
  19. Garg, G., et al. Presence of entry receptors and viral markers suggest a low level of placental replication of Hepatitis B virus in a proportion of pregnant women infected with chronic Hepatitis B. Scientific Reports. 12 (1), 17795(2022).
  20. NIBSC-Code:10/266. Standard for Hepatitis B Virus (Hbv) DNA for Nucleic Acid Amplification Techniques (NAT). , 4th ed, National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC). Potters Bar, UK. NIBSC Code: 10/266 (2016).
  21. Kim, H., Hur, M., Bae, E., Lee, K. A., Lee, W. I. Performance evaluation of cobas HBV real-time PCR assay on Roche cobas 4800 system in comparison with cobas Ampliprep/cobas Taqman HBV test. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 56 (7), 1133-1139 (2018).
  22. Madihi, S., Syed, H., Lazar, F., Zyad, A., Benani, A. Performance comparison of the artus HBV QS-RGQ and the CAP/CTM HBV v2.0 assays regarding HEPATITIS B virus DNA quantification. BioMed Research International. 2020, 4159189(2020).
  23. Nibsc-14/198. , National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC). At: HBV, HCV and HIV multiplex 14/198 https://www.nibsc.org/ (2023).
  24. Guvenir, M., Arikan, A. Hepatitis B virus: From diagnosis to treatment. Polish Journal of Microbiology. 69 (4), 391-399 (2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Hepatitis B VirusHBV DNAReal Time PCRViral Load QuantificationPCR KitDNA DetectionClinical SamplesStandard CurvePCR EfficiencySerological Tests

Related Articles