Этот протокол использует визуализацию светового листа для исследования сократительной функции сердца у личинок данио-рерио и получения информации о механике сердца с помощью отслеживания клеток и интерактивного анализа.
Методическая статья
4D-визуализация сердечного приступа рыбки данио
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Рыбка данио-рерио – это интригующий модельный организм, известный своей замечательной способностью к регенерации сердца. Изучение сокращающегося сердца in vivo имеет важное значение для получения информации о структурных и функциональных изменениях в ответ на травмы. Тем не менее, получение высокоскоростных 4-мерных (4D, 3D пространственных + 1D временных) изображений сердца рыбки данио для оценки сердечной архитектуры и сократимости сердца остается сложной задачей. В этом контексте для преодоления этих технических ограничений используется собственный световой микроскоп (LSM) и специализированный вычислительный анализ. Эта стратегия, включающая построение системы LSM, ретроспективную синхронизацию, отслеживание отдельных клеток и управляемый пользователем анализ, позволяет исследовать микроструктуру и сократительную функцию по всему сердцу с одноклеточным разрешением у трансгенных личинок Tg(myl7:nucGFP). Кроме того, мы можем дополнительно использовать микроинъекции низкомолекулярных соединений для точного и контролируемого вызова сердечного поражения. В целом, эта система позволяет отслеживать физиологические и патофизиологические изменения, а также региональную механику на уровне отдельных клеток в процессе морфогенеза и регенерации сердца.
Введение
Рыбка данио-рерио (Danio rerio) является широко используемым модельным организмом для изучения сердечного развития, физиологии и восстановления благодаря своей оптической прозрачности, генетической податливости и регенеративной способности 1,2,3,4. При инфаркте миокарда, в то время как структурные и функциональные изменения влияют на выброс сердца и гемодинамику, технические ограничения продолжают препятствовать возможности исследовать динамический процесс во время регенерации сердца с высоким пространственно-временным разрешением. Например, традиционные методы визуализации, такие как конфокальная микроскопия, имеют ограничения с точки зрения глубины изображения, временного разрешения или фототоксичности для регистрации динамических изменений и оценки сократительной функции сердца в течение несколькихсердечных циклов.
Световая микроскопия представляет собой современный метод визуализации, который успешно решает эти проблемы путем быстрого перемещения лазера по желудочку и предсердию сердца, получая детальные изображения с улучшенным пространственно-временным разрешением и незначительными фотообесцвечивающими и фототоксическими эффектами 6,7,8,9,10,11.
Этот протокол представляет собой комплексную стратегию визуализации, которая включает в себя построение системы LSM, реконструкцию 4D-изображений, 3D-отслеживание клеток и интерактивный анализ для захвата и анализа динамики кардиомиоцитов по всему сердцу в течение несколькихсердечных циклов. Специализированная система визуализации и вычислительная методология позволяют отслеживать микроструктуру миокарда и сократительную функцию на уровне отдельных клеток у личинок данио-рерио трансгенных Tg(myl7:nucGFP). Кроме того, низкомолекулярные соединения были введены в эмбрионы с помощью микроинъекций для оценки лекарственно-индуцированного повреждения сердца и последующей регенерации. Эта целостная стратегия обеспечивает отправную точку для исследования in vivo структурных, функциональных и механических свойств миокарда на уровне отдельных клеток во время развития и регенерации сердца.
Протокол
Разрешение на проведение этого исследования было выдано Комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Техасского университета в Далласе под номером протокола #20-07. Для настоящего исследования использовали12 трансгенных личинок данио-рерио Tg(myl7:nucGFP). Весь сбор данных и постобработка изображений осуществлялись с использованием программного обеспечения с открытым исходным кодом или платформ с исследовательскими или образовательными лицензиями. Ресурсы предоставляются авторами по обоснованному запросу.
1. Разведение данио-рерио и микроинъекция эмбрионов
Сроки: 2 дня
- Поддерживайте и разводите взрослых рыбок данио-рерио с помощью стандартных процедур ухода и разведения. Подробные сведения о методах см. в предыдущем отчете13.
- Выполняйте микроинъекцию в соответствии с установленным протоколом14. В настоящем исследовании микроинъекция выполнялась на стадии 1-2 клеток (зиготы).
ПРИМЕЧАНИЕ: Крайне важно точно определить эту стадию для эффективной микроинъекции и обеспечить последовательность развития. Во время одноклеточной стадии на желтке образуется небольшой купол, и эта стадия обычно длится около 12 минут. При переходе в двухклеточную стадию становятся видимыми два соседних купола, и эта стадия продолжается около 45 минут после оплодотворения. Более подробную информацию о построении системы можно найти в других отчетах или протоколах 12,16,17.
2. Подготовка и монтаж эмбрионов/личинок данио-рерио
Сроки: 7 дней
- Перенос эмбрионов через 1 день после оплодотворения (DPF) в воду E3 с 0,2 мМ 1-фенил-2-тиомочевины (ПТУ) (см. Таблицу материалов) для предотвращения образования пигмента.
- Заменяйте среду свежей водой E3 с PTU каждый день до получения LSM-изображения.
- Визуализируйте эмбрионы или личинки с помощью стереомикроскопа, чтобы зарегистрировать их развитие в желаемые моменты времени от 0 до 7 dpf.
- Подготовьте сегментированные трубки из фторированного этиленпропилена (ФЭП) с внутренним диаметром 2 мм для встраивания личинок данио-рерио в систему LSM12.
ПРИМЕЧАНИЕ: Трубка FEP используется для закрепления образца материалами, соответствующими показателю преломления, которые очень похожи на окружающую среду, например, воду. - Начиная с 3 dpf, переведите рыбу в раствор трикаина (MS-222) с концентрацией 150 мг/л (см. таблицу материалов), чтобы обездвижить рыбу перед визуализацией.
- Приготовьте 0,8 % легкоплавкую агарозу со 150 мг/л трикаина и с помощью пипетки для переноса переместите обезболиваемую рыбу в агарозу после того, как она остынет до комнатной температуры18.
- Используйте другую трансферную пипетку, чтобы закрепить рыбу с агарозой в пробирках FEP (рис. 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Для установления минимального стресса у развивающихся эмбрионов были проведены исследования сердечной деятельности до и после фиксации, такие как частота сердечных сокращений, под микроскопическим наблюдением. Эти оценки были направлены на выявление каких-либо существенных различий до и после трикаиновой анестезии. Дополнительное обследование кожи и мускулатуры на предмет нарушений сердечной структуры, таких как отеки, также может быть проведено после фиксации. Концентрация трикаина также играет решающую роль в визуализации сердца19, поэтому в этом проекте для визуализации сокращения у личинок данио-рерио был использован раствор трикаина с концентрацией 150 мг/л. В то время как нынешняя ретроспективная синхронизация позволяет нам работать с нерегулярным сердцебиением20, комплексное решение для 4D-визуализации сердечных аритмий и долгосрочной визуализации у рыбок данио-рерио все еще находится в стадии разработки.
3. Настройка и конфигурация системы визуализации светового листа
Сроки: 3-14 дней
- Создайте собственную LSM-систему на основе цилиндрической линзы, используя в качестве источников освещения твердотельные лазерные системы с непрерывной диодной накачкой (DPSS) на определенных длинах волн, таких как 473 нм и 532 нм (рис. 2A).
- Настройка управляющих кодов LabVIEW (см. Таблицу материалов) для синхронизации трансляционного столика образца, освещения светового полотна и экспозиции камеры sCMOS для захвата последовательностей изображений.
ПРИМЕЧАНИЕ: Более подробную информацию о построении системы можно найти в других отчетах или протоколах 12,16,17. Мы призываем исследовательские группы искать возможности сотрудничества с лабораториями, обладающими признанным опытом в области оптической визуализации при создании системы.
4. Подготовка изображений данио-рерио и сбор данных
Сроки: 1 день
- Откалибруйте пространственное разрешение системы LSM и минимизируйте изменение непрозрачности на различной глубине, измеряя флуоресцентные шарики.
- Сначала разбавляют флуоресцентные шарики (см. таблицу материалов) диаметром 0,53 мкм до концентрации 1:1,5 х10,5 5 с использованием 0,8 % легкоплавкой агарозы и переносят раствор в сегментированную трубку ФЭП.
- Во-вторых, используйте систему LSM для визуализации шариков и измерения функции разброса точек (PSF) по всему образцу, проверяя пространственное разрешение и выравнивание системы12.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этой системе анализ репрезентативных результатов для полной ширины при половинном максимуме (FWHM) показывает боковое и осевое разрешение 1,26 ± 0,15 и 2,48 ± 0,15 мкм (n = 60 шариков) соответственно. Это говорит о постоянном пространственном разрешении по всей глубине изображения.
- Надежно прикрепите трубку FEP с установленной личинкой данио-рерио к 6-осевой (x, y, z, тангаж, рыскание и крен) моторизованному столику образца и погрузите пробирки в камеру для отбора проб, заполненную водой E3. Чтобы избежать рассеивания света желточным мешком и лучше определить положение сердца, поверните личинку данио-рерио, чтобы получить изображение с брюшной стороны (рис. 2B). В этом случае большинство полученных изображений будут включать как желудочек, так и предсердие (рис. 2C).
ПРИМЕЧАНИЕ: Учитывая, что текущие процедуры визуализации обычно длились менее одного часа для каждой рыбы и проводились в условиях контролируемой комнатной температуры, контроль температуры в камере и регулирование уровня кислорода считаются необязательными для этого проекта. Тем не менее, для долгосрочных исследований с покадровой визуализацией, особенно тех, которые сосредоточены на процессах развития, рекомендуется непрерывный мониторинг и регулирование температуры при 27 °C в камере для образцов, чтобы обеспечить физиологическую среду рыбок данио и предотвратить любые потенциальные аномалии развития. - Подключите моторизованный столик к рабочей станции и настройте все необходимые параметры, включая желаемый режим движения.
- Установите соединение между камерой sCMOS и рабочей станцией. Отрегулируйте все основные параметры, такие как время экспозиции 5 мс и желаемая область интереса.
- Настройте количество последовательностей изображений и кадров в настраиваемой управляющей программе LabVIEW.
- Включите лазер и начните LSM-визуализацию образца. Поддерживайте процесс до тех пор, пока все последовательности изображений не будут успешно записаны.
- Запишите 300 кадров в виде последовательности 2D-изображений, чтобы охватить 3-5 сердечных циклов личинки с частотой кадров 200 кадров в секунду. Запись фиксирует сократительную способность сердца в селективной плоскости, освещенной световым полотном.
- Перемещайте личинку с шагом 1 мкм по световому листу, чтобы виртуально разрезать образец.
ПРИМЕЧАНИЕ: Размер шага предметного столика должен быть установлен на основе осевого разрешения системы светового листа в соответствии с теоремой12 Найквиста-Шеннона. - Повторите шаг 7, чтобы записать еще одну последовательность изображений нового образца среза, пока не будет покрыто все сердце. Как правило, 100-200 последовательностей изображений с шагом 1 мкм обеспечивают охват всего сердца личинки данио-рерио (рис. 2D).
ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 4.7-4.9 контролируются программой LabVIEW и автоматически выполняются системой LSM (Рисунок 3). Учитывая большой объем генерируемых данных изображений, для последовательностей изображений рекомендуется стандартизированное соглашение об именовании. Например, назначьте папки с такими именами, как «z-1», «z-2» и т. д., чтобы классифицировать данные по различным последовательностям изображений. В каждой последовательности изображения должны быть названы последовательно (например, "1", "2", ...), чтобы обозначить различные моменты времени. Общее время, затрачиваемое на установку рыбы, регулировку угла съемки и сбор всех данных для одной личинки данио-рерио, составляет около 1 часа.
5. Реконструкция 4D-изображения с параллельными вычислениями
Сроки: 1 день
ПРИМЕЧАНИЕ: Алгоритм 4D-реконструкции, разработанный нашей группой, и образцы данных находятся в открытом доступе21. Этот метод позволяет реконструировать 4D-изображение сердца по последовательностям изображений, собранным на предыдущих этапах (табл. 1).
- Откройте файл test_Parallel.m в MATLAB (см. Таблицу материалов). Укажите расположение папки, в которой хранятся последовательности необработанных изображений, в переменной "baseDir".
- Присвойте переменной "numOfSlice" общее количество последовательностей изображений (обычно 100-150), а переменной "numOfImage" - количество изображений (обычно 300-500) в каждой последовательности.
- Просмотрите последовательность изображений, показывающую среднюю плоскость сердца рыбки данио (например,51-я последовательность из 101 общей последовательности). Определите номера кадров первой и четвертой систол в этой последовательности и присвойте их переменным systolicPoint_1st и systolicPoint_4th.
- Нажмите « Выполнить », чтобы начать процесс.
ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжительность сердечного цикла в каждой последовательности изображений сначала определяется программой MATLAB путем сравнения сходства (суммы квадратов разностей) между изображениями в разные моменты времени. Впоследствии сердечный цикл будет оценен с использованием среднего значения длин циклов из всех последовательностей изображений. Затем начальные точки последовательностей изображений в различных осевых положениях будут выровнены программой путем итеративного сравнения сходства изображений от первой последовательности изображений до последней последовательности изображений. - Проверьте результаты в выходной папке. Программа сохранит изображения в виде файлов ".tif" с временными метками. Каждый файл ".tif" представляет собой 3D-изображение сердца в определенный момент времени. Интервал времени между двумя 3D-изображениями равен установленному времени экспозиции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Реконструируйте изображения, полученные на предыдущих шагах, чтобы изобразить 4D (3D пространственные + 1D временные) сердечные сокращения. Чтобы повысить квалификацию в исследованиях с высокой пропускной способностью во время ретроспективной синхронизации, этот подход позволяет выполнять одновременные вычислительные операции на GPU за счет использования нескольких ядер CPU через набор инструментов параллельных вычислений MATLAB и преобразования изображений в формат gpuArray.
6. 3D сегментация клеток и отслеживание клеток
Сроки: 1 день
- Скачайте пакет 3DeeCellTracker (см. Таблицу материалов) и настройте окружение Python22.
- Загрузите программное обеспечение для аннотирования ITK-SNAP23 (см. таблицу материалов) и используйте его для ручной маркировки 3D-изображения сердца в двух выбранных временных точках, одна на диастоле желудочков, а другая на систоле желудочков, для создания наборов данных для обучения и проверки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Также может применяться другое программное обеспечение для маркировки. - В Python запустите обучающую программу 3DeeCellTracker и инициализируйте параметры noise_level(в данном случае 100), folder_path и модели в функции TrainingUNet3D , чтобы задать предопределенную 3D модель U-Net.
- В MATLAB используйте программу imageDimConverter.m для преобразования и переименования набора данных для обучения и проверки в нужный формат для загрузки.
- В Python загрузите наборы данных для обучения и проверки с помощью функций trainer.load_dataset() и trainer.draw_dataset().
- В Python запустите первую часть трекинговой программы 3DeeCellTracker и инициализируйте параметры.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это включает в себя определение параметров изображения для определения размеров изображения, параметров сегментации для выбора модели машинного обучения, применяемой для сегментации клеток, и параметров отслеживания для выбора предварительно обученных моделей глубоких нейронных сетей, используемых для регистрации клеток. При первом использовании рекомендуется использовать модель U-Net для сегментации клеток и FFN+ PR-GLS для регистрации клеток. Он необходим для хранения данных, модели и результатов в папках, которые будут автоматически созданы на этом шаге. - В MATLAB с помощью программы imageDimConverter.m преобразуйте и переименуйте все 3D-изображения сердца в нужный формат и перенесите их в папку данных, созданную на последнем шаге.
- В Python запустите вторую часть программы 3DeeCellTracker , чтобы начать сегментацию.
- После сегментации первого 3D-изображения сравните результат сегментации с необработанным изображением и выполните ручную коррекцию, если обнаружена неправильная сегментация. Переместите исправленную сегментацию в созданную папку "/manual_vol1".
- В Python запустите третью часть программы 3DeeCellTracker , чтобы сегментировать все изображения.
- Используйте Amira (см. Таблицу материалов) для визуальной оценки результатов отслеживания путем сравнения положений отслеживаемых ячеек с соответствующими необработанными изображениями. Если результаты теста не удовлетворяют, повторите процедуру, начиная с шага 6.6, используйте альтернативную модель машинного обучения для сегментации или регистрации клеток, а затем повторно запустите процесс отслеживания.
ПРИМЕЧАНИЕ: После сегментации данные меток ячеек по умолчанию сохраняются в виде 8-битного изображения (от 0 до 255), что означает, что в качестве меток для классификации ячеек предоставляется только 256 шкал. Есть два решения для решения этой проблемы, когда требуются дополнительные классы. Одним из решений является установка формата данных меток ячеек в виде 16-битного изображения в программе отслеживания, что приведет к экспоненциальному увеличению времени обработки, более чем на два дня в данном случае. Другим решением является использование программы «separateTrackingResults.py» для постобработки меток ячеек, которая разделяет ячейки одинаковыми метками в зависимости от их физического местоположения и присваивает каждой ячейке отдельную метку. В этом случае этот процесс занимает около 10 минут.
7. Анализ сократительной способности сердца в режиме виртуальной реальности
Сроки: 1 день
- Получение результатов отслеживания клеток на предыдущих шагах.
- Вручную проверьте данные и выберите ячейки с одинаковой интенсивностью изображения на всех томах (около 500 ячеек из примерно 600).
- Используйте сценарий cellLabelsToObj.ipynb 21 для создания поверхностной сетки для каждой отдельной ячейки с помощью программного обеспечения 3D Slicer24 (см. Таблицу материалов) и присвойте каждой ячейке уникальный цветовой код.
- Экспортируйте каждую 3D-модель, состоящую из всех ячеек в один момент времени, в виде одного файла .obj, состоящего из нескольких подобъектов, сопровождаемых файлом .mtl для описания метки ячейки.
- Импортируйте модели в Unity с помощью образовательной лицензии — механизма разработки, используемого для расширенной реальности.
- Применяйте настраиваемые сценарии, состоящие из функций, написанных на C#, к моделям и элементам пользовательского интерфейса, чтобы обеспечить 4D-визуализацию и интерактивный анализ. Выполните VR-взаимодействие, выполнив шаг 7.7.
- Взаимодействуйте с моделями в виртуальной реальности (VR) с помощью следующих функций (рисунок 4):
- Выбор ячеек: Выберите до двух ячеек одновременно и просмотрите их траектории, скорости, объемы, площади поверхности и относительные расстояния.
- Выбор точки времени: выберите конкретный момент времени в данных для анализа выходных данных выбранных ячеек, например, при t = 0 мс во время диастолы или при t = 200 мс во время систолы.
- Временная пауза: заморозьте динамическую модель, чтобы сосредоточиться на выбранных ячейках и их выходных данных.
- Контрастность: модулирует контраст между выбранными ячейками и окружающими ячейками в модели.
Результаты
Текущий протокол состоит из трех основных этапов: подготовка рыбок данио и микроинъекция, визуализация светового листа и реконструкция 4D-изображения, а также отслеживание клеток и взаимодействие с виртуальной реальностью. Взрослым рыбкам данио-рерио было позволено спариваться, оплодотворенные яйца были собраны и выполнены микроинъекции по мере необходимости для предложенных экспериментов (Рисунок 1). Этот этап обеспечивает отправную точку для изучения применения рыбок данио в исследовании развития и регенерации сердца, а также играет решающую роль в последующей визуализации и анализе. Сокращающееся сердце было визуализировано на разных стадиях (от 3 dpf до 7 dpf) с помощью специально разработанной LSM-системы и выровнено последовательности изображений по оси z для реконструкции 4D-модели сердца данио-рерио (рис. 2 и рис. 3). Эти модели обеспечивают основу для глубоких фенотипических характеристик и имеют решающее значение для выявления динамики морфологии и функции сердца на разных временных шкалах развития. Отдельные клетки в сердце рыбки данио были отслежены, а их движение и взаимодействие количественно оценивались с помощью специализированной платформы виртуальной реальности. Также сравнивали изменения скорости и относительного расстояния выбранных клеток в течение одного сердечного цикла в предсердии и желудочке для оценки регионарной сократимости и исследования локальной деформации (рис. 4). Регионарный штамм определяли на основе вариаций смещения между двумя соседними клетками миокарда в интересующей области. Фракционное укорочение (FS) и фракцию выброса (EF) оценивали с использованием методик, описанных в опубликованной литературе25. Уравнения для FS и EF выглядят следующим образом:
где Dd и Ds — диаметры желудочков (короткая ось, измеряемая расстояниями между различными клетками желудочков) на конечной диастолической и конечной систолических стадиях соответственно, аVd и Vs — объемы желудочков (вычисляемые по диаметрам длинной и короткой осей желудочка) на конечной диастолической и конечной систолических стадиях соответственно.
В совокупности эти результаты демонстрируют новую стратегию, которая объединяет физиологию и инженерию для облегчения объемной визуализации и интерпретации данных в моделях рыбок данио, что открывает большие перспективы для продвижения исследований морфогенеза и механики сердца.
Рисунок 1: Сбор яиц данио-рерио и процесс микроинъекции. Процесс включает в себя спаривание взрослых рыбок данио, сбор оплодотворенных яиц и выполнение дополнительной микроинъекции. Во время микроинъекции предварительно вытянутая стеклянная пипетка загружается желаемыми материалами. Оплодотворенные яйца выравниваются прямыми рядами в прорезях агарозной плесени и располагаются перпендикулярно игле. Микроинъекция проводится под постоянным микроскопическим наблюдением как за яйцеклетками, так и за кончиком иглы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Процесс визуализации светового листа и реконструкция 4D-изображения. (A) Схема структуры собственной системы визуализации светового листа. CL: цилиндрическая линза. ЭО: цель возбуждения. DO: цель обнаружения. TL: трубчатая линза. FL: фильтр. CAM: камера sCMOS. (B) Схема рыбки данио, установленной в трубке FEP и встроенной агарозой. (C) Необработанная последовательность 2D-изображений, полученная от личинки данио-рерио 4 dpf. Часы в левом верхнем углу каждого кадра показывают фазу сердца, начиная с конечной систолы. (D) Иллюстрация ретроспективной синхронизации для регистрации 4D-изображения данио-рерио. Последовательность изображений указывает на непрерывную запись на определенной глубине вдоль оси Z. Каждый кадр в последовательности изображений представлен красной точкой, а начальная и конечная фазы от конечной диастолы до конечной систолы выделены желтым прямоугольником. (E) 4D-реконструированные модели сердца по 2D-последовательностям изображений. DPF: дней после оплодотворения. Эта цифра взята из Zhang et al.12. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Панель управления LabVIEW. (A) Настройки, используемые на панели управления, охватывают конфигурацию лазера, камеры, траектории изображения и диаграммы направленности двигателя. (B) Пример необработанного изображения сердца рыбки данио, полученного программой LabVIEW. Масштабная линейка: 30 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Отслеживание клеток и взаимодействие с виртуальной реальностью помогают выявить сократительную способность сердца рыбки данио. (A) Отслеживаемые клетки сердца данио-рерио Tg(myl7:nucGFP) при 3 dpf. (B) Платформа виртуальной реальности предоставляет пользователям захватывающий просмотр и интерактивный опыт 4D-модели сердца рыбки данио, позволяя визуализировать функцию сердца с течением времени с помощью пользовательского анализа. (C) После сбора измерений с платформы VR сравнивали изменения скорости и относительного расстояния в течение одного сердечного цикла между выбранными клетками при 3 dpf и 7 dpf. Первые два рисунка показывают изменения средней скорости в пяти желудочковых клетках и пяти предсердных клетках, а остальные иллюстрируют изменения относительного расстояния между тремя группами клеток, т.е. двумя желудочковыми клетками, желудочковой клеткой и предсердной клеткой и двумя предсердными клетками. (D) Оценка сердечной функции сердца рыбок данио-рерио с 3 dpf и 7 dpf. В общей сложности 370 клеток были отслежены в сердцах рыбок данио при 3 dpf, и 580 клеток были отслежены при 7 dpf. Эта цифра взята из Zhang et al.12. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
| ИМЯ | УПОТРЕБЛЕНИЕ | ИДЕНТИФИКАТОР | |
| Кастомизированные программы и алгоритмы | |||
| PSF.m | Для расчета PSF по результатам измерений FWHM флуоресцентных шариков. | Программа MATLAB | |
| 4D Данио-рерио Imaging.vi | Для управления и синхронизации аппаратного обеспечения в системе LSM. | Программа LabVIEW | |
| test_Parallel.м и т.д. | Для восстановления 4D-изображений из последовательностей 2D-изображений. | Программа MATLAB | |
| imageDimConverter.m | Для сокрытия данных изображения в заданном формате для отслеживания ячеек. | Программа MATLAB | |
| separateTrackingResults.py | Для разнесения результатов отслеживания ячеек для разделения ячеек с одинаковыми метками. | Программа на Python | |
| cellTracking_All.py | Выбор ячеек с одинаковой интенсивностью изображения во всех объемах. | Программа на Python | |
| cellLabelsToObj.ipynb | Для создания поверхностной сетки для каждой отдельной ячейки с помощью 3D-среза. | Программа на Python | |
| DynamicHeartModel.cs и т.д. | Для создания VR-среды и взаимодействия с объектами. | Программа на C# | |
| Индивидуальный дизайн аппаратного обеспечения | |||
| Камера для образцов, напечатанная на 3D-принтере | Для использования с водопогружными объективами. | Проектирование SolidWorks | |
| Держатель образца, напечатанный на 3D-принтере | Адаптироваться к этапу образца и удерживать образец. | Проектирование SolidWorks | |
Таблица 1: Настраиваемая таблица ресурсов. Примеры кодов и данных загружаются в Zenodo21.
Обсуждение
Интеграция модели рыбки данио с инженерными методами имеет огромный потенциал для исследования in vivo инфаркта миокарда, аритмий и врожденных пороков сердца. Используя свою оптическую прозрачность, регенеративную способность, а также генетическое и физиологическое сходство с человеком, эмбрионы и личинки данио-рерио стали широко использоваться в исследованиях 1,2,4. Превосходное пространственно-временное разрешение, минимальное фотоповреждение и возможности оптического секционирования светового листа выделяют его для 4D-исследования морфологии сердца и сократительной функции у личинок данио-рерио 12,26,27,28. Этот протокол представляет собой комплексный подход, который объединяет визуализацию светового листа, ретроспективную синхронизацию, 3D-отслеживание клеток и интерактивную платформу виртуальной реальности (VR) для количественных оценок. Он обеспечивает отправную точку для регистрации и реконструкции сердечных сокращений, отслеживания и количественной оценки клеточной динамики, а также оценки структурных, функциональных и механических изменений во время развития и регенерации сердца. Этот метод также может быть дополнен многоканальной флуоресцентной визуализацией для отслеживания различных типов клеток и линий для исследования клеточной гетерогенности и межклеточного взаимодействия. В то время как дихотомия модели данио-рерио от систем млекопитающих и ее ограниченность в качестве острой модели требуют тщательного рассмотрения, достижения в области генной инженерии могут позволить разработать трансгенные линии данио-рерио, которые больше напоминают состояния болезней человека, тем самым повышая трансляционную ценность результатов, полученныхв исследованиях рыбок данио.
Эта ретроспективная синхронизация, основанная на предположении о периодическом сердечном цикле, используется для реконструкции световых изображений сокращающегося сердца рыбки данио. Применение этого метода в световой визуализации позволяет визуализировать и анализировать сокращающееся сердце со скоростью более 200 объемов в секунду. Для решения проблемы, связанной с большим объемом данных в текущем анализе, были использованы параллельные вычисления с использованием многоядерных процессоров и графических процессоров, что привело к более чем десятикратному повышению эффективности реконструкции изображений. В ходе ретроспективной синхронизации предполагалось, что кардиомиоциты возвращаются в исходное положение с каждым ударом сердца. Хотя это предположение относительно безопасно, учитывая низкую вариабельность сердцебиения, наблюдаемую у рыбок данио-рерио26 , как показано на рисунке 4C, оно остается упрощением, которое может не учитывать всех биологических нюансов. Инновации в области визуализации, такие как компрессионная флуоресценция и микроскопия светового поля, могут смягчить эффекты, вытекающие из этого предположения, за счет уменьшения избыточности срезов.
Чтобы обеспечить глубокий анализ сложной 4D-модели сердца, была разработана вычислительная платформа, включающая сегментацию клеток на основе 3DeeCellTracker и VR-платформу для исследований, ориентированных на пользователя. Неотъемлемые возможности этой структуры, включая высокую эффективность и интерактивное манипулирование, позволяют количественно оценить изменение клеточной скорости, исследовать межклеточные взаимодействия и оценить региональную и глобальную механику миокарда, такую как фракционное укорочение, фракция выброса и регионарная деформация30 (рис.). Отмечается отсутствие предварительных оценок функции сердца рыбок данио при 7 dpf в существующей литературе. Тем не менее, по сравнению с данными, полученными другими исследователями при 3 dpf, полученные результаты, согласуются с предыдущими указаниями на снижение как фракции выброса (EF), так и фракционного укорочения (FS) в интервале от 3 dpf до 7 dpf25,31. Эти аналитические методы обладают значительным потенциалом для выяснения сердечной динамики в моделях сердечных повреждений рыбок данио12,25.
Поскольку технология виртуальной реальности и программное обеспечение содержат уникальные функции, такие как стереоскопическое зрение и автоматическая регистрация положения клеток, эта платформа позволяет использовать иммерсивный и оптимизированный метод выбора конкретных клеток и анализа их траектории на протяжении всего сердечного цикла. Использование виртуальной реальности обеспечивает интуитивно понятный способ выполнения сложных задач, таких как сегментация и аннотирование ячеек, с большей эффективностью и точностью 32,33,34. Кроме того, он позволяет нескольким пользователям использовать уникальные инструменты при совместной работе с большими и сложными наборами данных34. Хотя длительное использование виртуальной реальности может вызвать побочные эффекты, такие как головокружение, это можно смягчить с помощью улучшенного эргономичного дизайна и непривязанных гарнитур. Кроме того, для решения проблемы значительной вычислительной мощности, необходимой для визуализации сложных биологических структур в режиме реального времени, оптимизация программного обеспечения для мгновенной обработки и использование облачных вычислительных решений могут улучшить способность системы управлять сложными визуализациями.
По мере того, как аппаратные устройства и вычислительные мощности продолжают развиваться, эта стратегия может быть расширена для исследования сердечных аритмий в миокарде как на клеточном, так и на тканевом уровне, что в конечном итоге может раскрыть основной механизм морфогенеза сердца и продвинуть разработку терапевтических вмешательств.
Раскрытие информации
У авторов нет конфликта интересов, который они могли бы раскрыть.
Благодарности
Мы выражаем нашу благодарность доктору Кэролайн Бернс из Бостонской детской больницы за то, что она щедро поделилась трансгенными рыбками данио. Мы благодарим г-жу Элизабет Ибаньес за ее помощь в разведении рыбок данио-рерио в UT Dallas. Мы также ценим все конструктивные комментарии, предоставленные членами D-инкубатора в UT Dallas. Эта работа была поддержана NIH R00HL148493 (Y.D.), R01HL162635 (Y.D.) и UT Dallas STARS program (Y.D.).
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| RESOURCE | SOURCE/Reference | IDENTIFIER | |
| Animal models | |||
| Tg(myl7:nucGFP) трансгенные рыбки данио | Burns Lab в Бостонской детской больнице | ZDB-TGCONSTRCT-070117-49 | |
| Программное обеспечение и алгоритмы | |||
| MATLAB | The MathWorks Inc. | R2023a | |
| LabVIEW | National Instruments Corporation | 2017 SP1 | |
| HCImage Live | Hamamatsu Photonics | 4.6.1.2 | |
| Python | The Python Software Foundation | 3.9.0 | |
| Fiji-ImageJ | Schneider et al.18 | 1.54f | |
| 3DeeCellTracker | Chentao Wen et al.15 | v0.5.2 | |
| Unity | Unity Software Inc. | 2020.3.2f1 | |
| Амира | Термо Фишер Scientific | 2021.2 | |
| 3D Слайсер | Андрей Федоров и др.17 | 5.2.1 | |
| ITK SNAP | Павел А Юшкевич и др.16 | 4 | |
| Light-sheet system | |||
| Цилиндрический объектив | Thorlabs | ACY254-050-A | |
| 4X Световой объектив | Nikon | MRH00045 | |
| 20X Объектив обнаружения | Olympus | 1-U2M585 | |
| sCMOS камера | Hamamatsu | C13440-20CU | |
| Моторизованная XYZ сцена | Thorlabs | PT3/M-Z8 | |
| Двухосевой наклонный столик | Thorlabs | GN2/M | |
| Вращающийся шаговый двигатель | Pololu | 1474 | |
| Флуоресцентные бусины | Spherotech | FP-0556-2 | |
| 473 нм DPSS лазерное | свечение | R471003GX | |
| 532 нм DPSS лазерное | свечение | R531003FX | |
| <сильно>микроинъектор и вакуумный насос | |||
| микроинъектор | WPI | PV850 | |
| Вакуумный насос | Welch | 2522B-01 | |
| Стеклянные пипетки | WPI | TIP10LT | |
| капиллярным наконечником для загрузки геля | Bio-Rad | 2239912 | |
| Virtual reality hardware | |||
| VR гарнитура | Meta | Quest 2 | |
| 30mg/l PTU solution | |||
| Рабочий | |||
| 1X E3 | |||
| > | |||
| Трикаин | Синдель SYNC-M-GR-US02 | ||
| Деионизированная вода | - | - | |
| Бикарбонат натрия | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| 150 мг/л Рабочий раствор трикаина | |||
| 10 г/л Стоковый раствор трикаина | - | - | |
| Деионизированный вода | - | -< | |
| сильный>60X Стоковый раствор E3 | |||
| Sodium Chloride | Lab Animal Resource Center (LARC), Техасский университет в Далласе | NaCl | |
| Potassium | Chloride-KCL | ||
| Кальция хлорид дигидрат-CaCL | sub>2 x 2H2O | ||
| Сульфат магния гептагидрат-MgSO | sub>4 x 7H2O | ||
| RO Вода | - | -< | |
| >1X E3 рабочий раствор | |||
| 60X E3 stock solution | Lab Animal Resource Center (LARC), Техасский университет в Далласе | - | |
| Вода обратного осмоса | |||
| 1% метиленового синего (опционально) | - | C16H18ClN3S |
Ссылки
- Power, R. M., Huisken, J. A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging. Nat. Methods. 14 (4), 360-373 (2017).
- Liu, J., Stainier, D. Y. R. Zebrafish in the study of early cardiac development. Circ. Res. 110 (6), 870(2012).
- Ding, Y., Bu, H., Xu, X. Modeling inherited cardiomyopathies in adult zebrafish for precision medicine. Front. Physiol. 11, 599244(2020).
- Giardoglou, P., Beis, D. On zebrafish disease models and matters of the heart. Biomedicines. 7 (1), 15(2019).
- Zhang, X., Alexander, R. V., Yuan, J., Ding, Y. Computational analysis of cardiac contractile function. Curr. Cardiol. Rep. 24 (12), 1983-1994 (2022).
- Weber, M., Huisken, J. In vivo imaging of cardiac development and function in zebrafish using light sheet microscopy. Swiss Med. Wkly. 145 (51), w14227(2015).
- Vedula, V., et al. A method to quantify mechanobiologic forces during zebrafish cardiac development using 4-D light sheet imaging and computational modeling. PLOS Comput. Biol. 13 (10), e1005828(2017).
- Yalcin, H. C., Amindari, A., Butcher, J. T., Althani, A., Yacoub, M. Heart function and hemodynamic analysis for zebrafish embryos. Dev. Dyn. 246 (11), 868-880 (2017).
- Baek, K. I., et al. Advanced microscopy to elucidate cardiovascular injury and regeneration: 4D light-sheet imaging. Prog. Biophys. Mol. Biol. 138, 105-115 (2018).
- Salman, H. E., Yalcin, H. C. Advanced blood flow assessment in Zebrafish via experimental digital particle image velocimetry and computational fluid dynamics modeling. Micron. 130, 102801(2020).
- Sodimu, O., et al. Light sheet imaging and interactive analysis of the cardiac structure in neonatal mice. J. Biophotonics. 16 (5), e202200278(2023).
- Zhang, X., et al. 4D light-sheet imaging and interactive analysis of cardiac contractility in zebrafish larvae. APL Bioeng. 7 (2), 026112(2023).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book. Eugene. , University of Oregon Press. (2000).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. 25, e1115(2009).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
- Girkin, J. M., Carvalho, M. T. The light-sheet microscopy revolution. J. Opt. 20 (5), 053002(2018).
- Gualda, E. J., et al. OpenSpinMicroscopy: an open-source integrated microscopy platform. Nat. Methods. 10 (7), 599-600 (2013).
- Messerschmidt, V., et al. Light-sheet fluorescence microscopy to capture 4-dimensional images of the effects of modulating shear stress on the developing zebrafish heart. J Vis Exp. 138, e57763(2018).
- Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).
- Lee, J., et al. 4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation. J Clin Invest. 126 (5), 1679-1690 (2016).
- Zhang, X., et al. 4D light-sheet imaging and interactive analysis of cardiac contractility in Zebrafish larvae. Zenodo. , (2023).
- Wen, C., et al. 3deecelltracker, a deep learning-based pipeline for segmenting and tracking cells in 3d time lapse images. Elife. 10, e59187(2021).
- Yushkevich, P. A., et al. User-guided 3D active contour segmentation of anatomical structures: significantly improved efficiency and reliability. Neuroimage. 31 (3), 1116-1128 (2006).
- Fedorov, A., et al. 3D Slicer as an image computing platform for the quantitative imaging network. Magn. Reson. Imaging. 30 (9), 1323-1341 (2012).
- Naderi, A. M., et al. Deep learning-based framework for cardiac function assessment in embryonic zebrafish from heart beating videos. Comput. Biol. Med. 135, 104565(2021).
- Mickoleit, M., et al. High-resolution reconstruction of the beating zebrafish heart. Nat. Methods. 11 (9), 919-922 (2014).
- Lee, J., et al. 4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation. J. Clin. Invest. 126 (5), 1679-1690 (2016).
- Ding, Y., et al. Multiscale light-sheet for rapid imaging of cardiopulmonary system. JCI Insight. 3 (16), e121396(2018).
- Choe, C. P., et al. Transgenic fluorescent zebrafish lines that have revolutionized biomedical research. Lab. Anim. Res. 37 (1), 1-29 (2021).
- Coelho-Filho, O. R., et al. Quantification of cardiomyocyte hypertrophy by cardiac magnetic resonance: implications on early cardiac remodeling. Circulation. 128 (11), 1225(2013).
- Zhang, B., et al. Automatic segmentation and cardiac mechanics analysis of evolving zebrafish using deep learning. Front. Cardiovasc. Med. 8, 675291(2021).
- Ding, Y., et al. Integrating light-sheet imaging with virtual reality to recapitulate developmental cardiac mechanics. JCI Insight. 2 (22), e97180(2017).
- Koger, C. R., Hassan, S. S., Yuan, J., Ding, Y. Virtual reality for interactive medical analysis. Front. Virtual Real. 3, 782854(2022).
- Yuan, J., et al. Extended reality for biomedicine. Nat. Rev. Methods Prim. 3 (1), 1-1 (2023).
Перепечатки и разрешения
