Изучение поведения клеток при механическом напряжении имеет решающее значение для достижений в клеточной механике и механобиологии. Мы представляем метод флуоресцентной микропипеточной аспирации (fMPA), новый метод, сочетающий контролируемую механическую стимуляцию с комплексным анализом внутриклеточной сигнализации в отдельных клетках. Этот метод исследует новые углубленные исследования механобиологии живых клеток.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Аспирационный анализ флуоресцентной микропипетки для исследования механочувствия эритроцитов
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Аспирационные анализы с помощью микропипеток уже давно являются краеугольным камнем для исследования механики живых клеток, давая представление о клеточных реакциях на механический стресс. В данной статье подробно описывается инновационная адаптация метода аспирации микропипеток с флуоресцентной связью (fMPA). Анализ fMPA дает возможность управлять точными механическими силами при одновременном мониторинге процессов механотрансдукции живых клеток, опосредованных ионными каналами. Сложная установка включает в себя прецизионную микропипетку из боросиликатного стекла, подключенную к точно регулируемому резервуару для воды и пневматической системе аспирации, что облегчает применение контролируемого давления с шагом ± 1 мм рт. ст. Существенным усовершенствованием является интеграция эпифлуоресцентной визуализации, позволяющая одновременно наблюдать и количественно оценивать морфологические изменения клеток и внутриклеточные потоки кальция во время аспирации. Анализ fMPA, благодаря синергетическому сочетанию эпифлуоресцентной визуализации с аспирацией микропипеток, устанавливает новый стандарт для изучения клеточного механочувствия в механически сложных средах. Этот многогранный подход может быть адаптирован к различным экспериментальным установкам, обеспечивая критически важное представление о механизмах механочувствительности отдельных клеток.
Введение
Открытия в мире клеточного поведения подчеркнули роль механических стимулов, таких как растяжение, напряжение сдвига жидкости, сжатие и жесткость субстрата, в определении динамических клеточных активностей, таких как адгезия, миграция и дифференциация. Эти механобиологические аспекты имеют первостепенное значение для выяснения того, как клетки взаимодействуют с физиологической средой и реагируют на нее, влияя на различные биологические процессы 1,2.
За последнее десятилетие аспирационные анализы на основе микропипеток стали универсальным инструментом в изучении различных клеточных реакций на механические раздражители. Этот метод дает ценную информацию о внутренних механических свойствах живых клеток на уровне одной клетки, включая модуль упругости клеток, жесткость и напряжение коры головного мозга. Эти анализы позволяют измерять различные механические параметры, такие как натяжение клеточной мембраны, давление, оказываемое на клеточную мембрану, и кортикальное напряжение (обобщенное в таблице 1). Изучение аспиративных сил обогатило наше понимание того, как они влияют на клеточные функции и процессы, особенно в области мембранной динамики, включая фрагментацию, удлинение и почкование 3,4.
| Механический параметр | Описание | Основополагающие подходы |
| Жесткость ячеек | Измерение механической жесткости и эластичности ячейки. | Аспирация клеточной мембраны и анализ деформационной реакции на отрицательное давление20,21. |
| Адгезионная прочность | Оценка того, насколько сильно клетки прилипают к поверхностям. | Применение контролируемого отсоса для отделения прилипших клеток от субстрата2,22. |
| Натяжение мембраны | Оценка напряжения или стресса в клеточных мембранах. | Измерение деформации мембраны в ответ на приложенное давление23,24. |
| Вязкоупругие свойства | Характеристика комбинированного вязкого и упругого поведения клетки. | Анализ нестационарной деформационной реакции на аспирацию23,25. |
| Деформативность | Определение того, насколько легко клетка может менять форму. | Оценка степени деформации при контролируемом всасывании20,24. |
| Поверхностное натяжение | Измерение натяжения на поверхности ячейки. | Оценка давления, необходимого для формирования выпячивания мембраны микропипетки26. |
| Взаимодействие клетки с материалом | Изучение взаимодействий между клетками и материалами или субстратами. | Аспирация клеток, контактирующих с различными материалами, и наблюдение за взаимодействиями2,24. |
| Межклеточное взаимодействие | Изучение взаимодействий между соседними клетками. | Аспирация группы клеток и анализ их межклеточных сил27. |
Таблица 1: Механические параметры, характеризуемые микропипеточным аспирационным анализом.
Метод аспирации на основе микропипеток широко используется для изучения эритроцитов (эритроцитов), оценки деформируемости и различных механических характеристик эритроцитов, что имеет важное значение для понимания их функции в системе кровообращения. Эритроциты демонстрируют замечательную приспособляемость, сохраняя свою механическую универсальность против деформации при навигации через сложную капиллярную сеть и межэндотелиальные щели 5,6. Во время этого путешествия эритроциты должны проходить через проходы шириной 0,5-1,0 мкм, подвергаясь воздействию множества механических сил, включая растяжение и сжатие 7,8,9. Они также обладают высокой чувствительностью к напряжению сдвига, создаваемому кровотоком во времяциркуляции 10. Эти процессы способствуют активации регуляторных механизмов, включающих приток кальция, важнейшее сигнальное событие, играющее хорошо известную роль в клеточных реакциях на механические раздражители11,12. Сложные механизмы, управляющие кальций-опосредованным механозондированием, остаются неотразимыми предметами продолжающихся исследований.
В этом контексте фМПА является эффективным подходом к выявлению степени мобилизации кальция при точно контролируемых механических силах, позволяющим одновременно применять механическую модуляцию (с помощью системы аспирации микропипеток) и визуализацию интенсивности кальция (с помощью флуоресцентных индикаторов). В частности, он имитирует физиологический сценарий, когда эритроциты проходят через сужающиеся кровеносные сосуды. Стоит отметить, что разработанная нами система fMPA может генерировать давление с разрешением 1 мм рт. Реализованная высокоскоростная камера позволяет достигать временного разрешения 100 мс и пространственного разрешения на уровне субмикронного метра. Эти конфигурации обеспечивают точное приложение механических сил к живым клеткам и одновременно улавливают результирующую клеточную сигнализацию. Кроме того, благодаря интегративному инженерному характеру этой установки, аспирационный анализ с помощью микропипеток может быть легко адаптирован к другому оборудованию или методам, что позволяет глубже исследовать тонкости клеточной механики. Эта универсальность является дополнительным преимуществом такого подхода.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Этот протокол соответствует руководящим принципам и был одобрен Комитетом по этике исследований на людях Сиднейского университета. Для проведения данного исследования было получено информированное согласие доноров.
1. Изоляция эритроцитов человека
ПРИМЕЧАНИЕ: Шаг 1.1 должен выполняться квалифицированным флеботомистом с использованием протокола, одобренного Институциональным наблюдательным советом.
- Возьмите 5 мл крови из срединной кубитальной вены с помощью иглы-бабочки 19 G.
- Переложите собранную кровь в пробирку объемом 15 мл, содержащую эноксапарин в соотношении 1:200 для предотвращения свертывания крови.
- Развести 5 мкл эноксапарин-антикоагулянтной крови в 1 мл карбонатного/бикарбонатного буфера (С-буфер, рН = 8,5-9; Оглавление материалов).
- Центрифугируют разбавленный образец крови при 900 × г в течение 1 мин для осаждения эритроцитов. Осторожно сцедите надосадочную жидкость, не повредив гранулу.
- Проводят две промывки гранул эритроцитов 1 мл С-буфера (таблица материалов), каждый раз центрифугируя при 900 × г в течение 1 мин.
- Затем промывают гранулу эритроцитов 2 раза 1 мл буфера Tyrode, используя те же условия центрифугирования, а затем повторно суспендируют конечную гранулу в 1 мл буфера Tyrode для получения суспензии промытых эритроцитов.
2. Нагрузка кальциевым индикатором
- Отрегулируйте концентрацию промытого исходного раствора эритроцитов до 10 × 106 клеток/мл в буфере Tyrode на основе количества клеток, полученного с помощью автоматического счетчика клеток (таблица материалов).
- Маркировку кальция внутри эритроцитов путем инкубации с кальций-чувствительным красителем Cal-520 AM 16,67 мкМ при перемешивании на ротационном трубчатом смесителе в течение 1 ч.
- Разбавьте эритроциты в буфере Tyrode, содержащем 0,5% бычьего сывороточного альбумина (БСА) в соотношении 1:50. Теперь клетки готовы к экспериментальному использованию.
3. Изготовление микропипеток
- Установите капиллярную трубку из боросиликатного стекла (наружный диаметр 1 мм x внутренний диаметр 0,6 мм) на съемник микропипеток P-1000 для получения двух соответствующих микропипеток с закрытыми наконечниками в месте вытягивания с помощью предварительно заданной программы вытягивания. Для этой настройки используйте следующие значения программы вытягивания: нагрев 516, тяга 150, скорость 75, время 250 и давление 500.
ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры нагрева и вытягивания, заданные в программе вытягивания, могут быть настроены и зависят от желаемых настроек экспериментальной конструкции12. КОНТРОЛЬНАЯ ТОЧКА (см. Дополнительную таблицу S1). - Откройте закрытый наконечник, установив одну из микропипеток с закрытым концом, приобретенных после натягивания на резак для микропипеток. Отрегулируйте температуру нагрева примерно до 50-60 °C.
- Найдите микропипетку с помощью окуляра с 10-кратным увеличением. Переместите микропипетку ближе к шарику из боросиликатного стекла, используя ручки для регулировки.
- Установите окуляр на 30x, прежде чем расположить микропипетку как можно ближе к шарику боросиликатного стекла, не сгибая наконечник пипетки.
- Размягчите шарик боросиликатного стекла с помощью тепла, наступив на педаль нагрева. Осторожно вставьте необработанный закрытый наконечник микропипетки в размягченный шарик до тех пор, пока не будет достигнута желаемая конечная точка, диаметр отверстия.
- Отпустите педаль и дайте стеклянной бусине остыть. Следите за тем, чтобы кончик микропипетки всегда оставался внутри шарика.
ПРИМЕЧАНИЕ: Дальнейшая установка наконечника приводит к увеличению диаметра отверстия. - Осторожно извлеките микропипетку, чтобы получить четкий прямой срез на закрытой микропипетке. Убедитесь, что конечный диаметр капилляра составляет 1 мкм.
ПРИМЕЧАНИЕ: КОНТРОЛЬНАЯ ТОЧКА (см. Дополнительную таблицу S1)
4. Подготовка камеры ячейки
- С помощью алмазного карандаша разделите стандартный стеклянный листок размером 40 мм x 22 мм x 0,17 мм на три равные полосы.
- Приклейте один кусок вырезанного стеклянного защитного стекла к нижней части самодельного держателя камеры с помощью вакуумной смазки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Держатель патронника состоит из двух металлических (медных/алюминиевых) квадратов, соединенных изогнутой ручкой. Расстояние между металлическими блоками должно быть менее 40 мм, чтобы разрезанный покровный щиток прилегал к держателю и образовывал параллельную камеру. - Приклейте второй кусок вырезанного стеклянного покровного стекла к верхней части самодельного держателя камеры с помощью вакуумной смазки.
ПРИМЕЧАНИЕ: КОНТРОЛЬНАЯ ТОЧКА (см. Дополнительную таблицу S1) - Введите 200 мкл меченой суспензии эритроцитов между двумя покровными стеклами с помощью пистолета-пипетки на 200 мкл (рис. 1).
Рисунок 1: Иллюстрация камеры ячейки. Два вырезанных куска стеклянной крышки размером 40 мм x 22 мм x 0,17 мм приклеиваются к держателю камеры с помощью смазки. Между двумя вырезанными стеклянными покровными стеклами помещается примерно 200 мкл клеточного раствора в буфере Tyrode. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
5. Узел аспирации микропипетки
- Установите камеру ячейки на столик-держатель, установленный на платформе микроскопа. Отрегулируйте положение так, чтобы камера ячейки находилась прямо над объективом (Рисунок 2B).
- Опустите держатель микропипетки ниже уровня жидкости в подключенном резервуаре для воды.
- Введите деминерализованную воду или буфер Tyrode в изготовленную микропипетку и осторожно удалите все пузырьки воздуха с помощью шприца в сочетании с иглой 34 G (см. Таблицу материалов).
- Отвинтите конец держателя микропипетки наполовину и дайте воде стечь из держателя микропипетки в течение нескольких секунд.
ПРИМЕЧАНИЕ: КОНТРОЛЬНАЯ ТОЧКА (см. Дополнительную таблицу S1) - Вставьте микропипетку в наконечник держателя. Затяните винт держателя, чтобы убедиться, что микропипетка зафиксирована.
- Вставьте микропипетку в камеру клетки и найдите микропипетку и эритроциты под микроскопом. Используйте микроманипулятор для регулировки положения.
- Опустите наконечник микропипетки еще ниже, чтобы убедиться, что наконечник находится на одном уровне с расположенными эритроцитами.
ПРИМЕЧАНИЕ: КОНТРОЛЬНАЯ ТОЧКА (см. Дополнительную таблицу S1) - Обнулите гидравлическое давление на наконечнике микропипетки, отрегулировав высоту резервуара для воды. Затем слегка приподнимите резервуар для воды, чтобы создать легкое положительное давление на кончике.
6. Выполните аспирационный анализ микропипеток с флуоресцентной связью
- Включите источник флуоресцентного возбуждающего света с длиной волны 488 нм. Не включайте флуоресцентный затвор на этом этапе, чтобы избежать фотообесцвечивания (Рисунок 2C). Включите флуоресцентную камеру и передающую камеру.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обе камеры управляются с помощью соответствующего программного обеспечения (см. Таблицу материалов). - Установите желаемое время экспозиции (100 мс для обеих камер в этом исследовании), область интереса (ROI), размер биннинга (нет для этого исследования) для обеих камер в программном обеспечении. Откройте панель многомерного сбора , чтобы установить номер кадра съемки, 2 000 для этого исследования и каталог сохранения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Номер кадра регистрации зависит от желаемого количества событий аспирации, которые должны быть записаны. Для 1 события аспирации диапазон числа захвата должен быть установлен в пределах 100-500, что составляет примерно 10-50 с. - Найдите микропипетку под полем зрения с помощью микроманипулятора.
- Включите пневматический зажим давления, включая блок управления и систему зажимов (Рисунок 2A). Убедитесь, что блок управления находится в режиме EXTRNL. Компенсируйте любое смещение давления внутри системы, медленно вращая ручку.
- Включите отдельное программное обеспечение, которое управляет пневматическим зажимом. Программное обеспечение имеет электрическую панель управления для управления дискретным аналоговым входом в систему зажимов. Давление регулируется с помощью коэффициента пересчета 20 мВ/мм рт.ст.
- Обнулите давление внутри системы. Осторожно расположите микропипетку близко к эритроцитам. Отрегулируйте положение резервуара для воды до тех пор, пока на кончике микропипетки не появится легкое положительное давление.
- Запустите съемку в программном обеспечении, управляющем камерой. Включите люминесцентный затвор.
- Аспирируйте эритроциты, введя рассчитанную величину напряжения в панель управления, чтобы достичь желаемого давления.
ПРИМЕЧАНИЕ: Давление для аспирации эритроцитов обычно находится в диапазоне Δp = от -5 до -40 мм рт.ст. В пределах кончика микропипетки должно быть заметное удлинение языка (рис. 2D). - Удерживайте давление в течение заданного периода времени; Затем ослабьте давление.
- Переместите микропипетку, чтобы взять следующую клетку, и повторите эксперимент.
7. Анализ интенсивности флуоресценции
- Загрузите сохраненные флуоресцентные изображения в аналитическое программное обеспечение.
- Отрегулируйте порог интенсивности с помощью вкладки настройки дисплея . Это можно сделать, либо вручную введя значения, либо используя ползунок, чтобы убедиться, что флуоресцентные изображения показывают четкий контраст клетки в аналитическом программном обеспечении (см. Дополнительный файл 1 - Дополнительный рисунок S1).
- Прокрутите страницу до временной шкалы в нижней части программного обеспечения. Найдите обозначенное событие аспирации.
- Нажмите кнопку Добавить новые поверхности. Определите рентабельность инвестиций в анализ.
ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение предоставляет управляемый пятиступенчатый процесс для настройки и завершения сегментации (см. Дополнительный файл 1 - Дополнительный рисунок S2 и Дополнительный рисунок S3).
ПРИМЕЧАНИЕ: Держите окупаемость инвестиций как можно меньше, чтобы сэкономить вычислительные ресурсы. - Используйте ползунок «Вычитание фона» и отрегулируйте порог сегментации с помощью ползунка, чтобы получить наилучший результат сегментации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это означает, что, за исключением события аспирации, фон должен быть сегментирован как можно точнее (см. Дополнительный файл 1 - Дополнительный рисунок S4 и Дополнительный рисунок S5). - Добавьте фильтр по площади для исключения фоновых шумов (см. Дополнительный файл 1-Дополнительный рисунок S6).
ПРИМЕЧАНИЕ: Это выполняется на этапе постобработки. - Выберите вкладку статистики | Подробная вкладка | вкладка «Средние значения ». Прокрутите, чтобы найти и выбрать среднее значение интенсивности (см. Дополнительный файл 1 - Дополнительный рисунок S7).
- Экспортируйте трассировку сигнала флуоресценции с течением времени в файл .csv.
- Откройте экспортированный CSV-файл. Вычтите фоновые сигналы, Fb, из всех измерений.
- Рассчитайте изменение интенсивности кальция, ΔFmax, используя уравнение (1):
(1)
Где ΔFmax — максимальное изменение интенсивности кальция, Fb — интенсивность фона, а F0 — интенсивность покоя.
Иллюстрация 2: Узел аспирации микропипеток с флуоресцентной связью. (A) Обзор аппаратной системы fMPA, включающей инвертированный микроскоп в сочетании со светлопольной и флуоресцентной камерами. В левой части изображения изображен самодельный водяной манометр и блок управления, позволяющий точно настроить давление пневматического нагнетательного насоса. (B) Столик микроскопа, изображающий камеру экспериментальной ячейки и систему микроманипулятора с одной микропипеткой. (C) Схема настройки системы fMPA. Одновременная визуализация светлопольных (желтый) и флуоресцентных (синее излучение, зеленое возбуждение) сигналов с использованием двух дихроичных зеркал для направления световых путей от источника флуоресцентного света (синий) к мишени, а затем к камерам для получения изображения (зеленый). (D) В верхнем ряду показаны изображения светлого поля, а в нижнем — флуоресцентные изображения. Слева показано положение микропипетки перед аспирацией, когда эритроциты находятся в состоянии покоя. В средней колонке показан процесс аспирации, в котором эритроциты испытывают отрицательное давление -40 мм рт. Справа показана морфология клеток после отрицательного аспирационного давления. Масштабная линейка = 5 мкм. Сокращения: fMPA = Аспирация микропипеток с флуоресцентной связью; DM = дихроичное зеркало; эритроциты = эритроциты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Для проведения аспирационных анализов с помощью микропипеток мы сначала построили специальную камеру, состоящую из двух металлических квадратов (медь/алюминий), соединенных ручкой. Два стеклянных покровных стекла (40 мм × 7 мм × 0,17 мм) были прикреплены для создания камеры, заполненной 200 мкл эритроцитов, взвешенных в буфере Тироде. После введения эритроцитов в камеру боросиликатная микропипетка была закреплена на держателе и аккуратно размещена внутри камеры с помощью микроманипулятора. Впоследствии микропипетку подно...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Аспирационные анализы с помощью микропипеток воплощают в себе усовершенствованную методологию, использующую существенную модуляцию давления, точную пространственную оркестровку и надежное временное различение для исследования глубоких тонкостей клеточной биомеханики. В этом исследовании особое внимание уделяется применению фМПА в качестве важнейшего инструмента для выявления нюансов механочувствительных реакций, демонстрируемых эритроцитами при различных стимулах. Одновременное использование сигналов светлого поля и флуо...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов, которые они могли бы сообщить в отношении настоящего исследования.
Благодарности
Мы благодарим Нурул Айшу Зайнал Абидин и Лауру Молдован за дополнительный набор доноров, сбор крови и поддержку флеботомии. Мы благодарим Томаса Андерсона и Ариана Насера за организацию оборудования и реагентов. Это исследование финансировалось Австралийским исследовательским советом (ARC) Discovery Project (DP200101970-L. А.Дж.); Грант Национального совета по здравоохранению и медицинским исследованиям (NHMRC) Австралии (APP2003904-L. А.Дж.); NHMRC Equipment Grant-L.A.J.; Программа наращивания потенциала в области сердечно-сосудистых заболеваний штата Новый Южный Уэльс (Грант для исследователей в начале и середине карьеры, Лос-Анджелес); Грант на исследовательские инновации NSW CVRN-VCCRI; Управление по глобальному и научно-исследовательскому взаимодействию (Премия за сотрудничество в партнерстве между Сиднеем и Глазго, Лос-Анджелес); L.A.J. является стипендиатом Национального фонда сердца 2-го уровня (105863) и стипендиатом Фонда медицинских исследований снега (2022SF176).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| &микро; Manager | Micro-Manager | версии 2.0.0 | |
| 1 мл шприца | Terumo | 210320D | Сотрудничество с компанией Microfil |
| 200 &микро; L Пипетка | Eppendorf | 3123000055 | Препарат для красной клетки |
| 22 x 40 мм Защитные накладки | Knittel Glass | MS0014 | Клеточная камера в сборе |
| 50 мл Шприц | Terumo | 220617E | Подключите к водонапорной башне |
| Кальций хлорид (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C1016 | Tryode's буферный препарат - 12 мМ NaHCO3, 10 мМ HEPES, 0,137 М NaCl, 2,7 мМ KCl и 5,5 мМ D-глюкозы с добавлением 1 мМ CaCl2. Конечный pH = 7,2 |
| Центрифуга 5425 | Eppendorf | 5405000280 | Препарат красных клеток |
| Clexane | Sigma-Aldrich | 1235820 | Для предотвращения свертывания собранной крови. 10 000 Ед/мл |
| DAQami | Diligent | ||
| Флуоресцентный источник света | CoolLED | pE-300 | Аппаратная система для аспирации микропипеток |
| Стеклянный капилляр | Narishige | G-1 | Производство |
| Глюкозный | Sigma-Aldrich | G8270 | Tryode's - 12 мМ NaHCO<суб>3, 10 мМ HEPES, 0,137 М NaCl, 2,7 мМ KCl и 5,5 мМ D-глюкоза с добавлением 1 мМ CaCl<суб>2. Конечный pH = 7,2 |
| Буферный препарат Hepes | Thermo Fisher | 15630080 | Tryode's - 12 мМ NaHCO3, 10 мМ HEPES, 0,137 М NaCl, 2,7 мМ KCl и 5,5 мМ D-глюкозы с добавлением 1 мМ CaCl2. Конечный pH = 7,2 |
| Высокоскоростная камера GigE Manta | G-040B | Аппаратная система аспирации микропипеток | |
| Высокоскоростной зажим | Научный прибор | HSPC-2-SB | Сотрудничество с нагнетательным насосом |
| Ступень головки высокоскоростного зажима давления | Научный прибор | HSPC-2-SB | Взаимодействуют с нагнетательным насосом |
| Imaris | Oxford Instruments | ||
| Инвертированная микроскопия | Олимп | Olympus IX83 | Аппаратная система для аспирации микропипеток |
| Microfil | Мировые прецизионные приборы | MF34G-5 | 34 G (длина 67 мм) Измельчите пузырь воздуха в разрезанной микропипетке и проверьте отверстие наконечника пипетки |
| Съемник микропипеток | Sutter instrument | P1000 | Производство микропипеток |
| Milli Q EQ 7000 Система очистки сверхчистой воды | Merck Millipore | ZEQ7000T0C | карбонатный/бикарбонатный буфер и Триодный буферный препарат |
| Пипетка microforge | Narishige | MF-900 | Производство микропипеток |
| Хлорид калия (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | Tryode's буферный препарат - 12 мМ NaHCO<суб>3, 10 мМ HEPES, 0,137 М NaCl, 2,7 мМ KCl и 5,5 мМ D-глюкоза с добавлением 1 мМ CaCl<суб>2. Конечный pH = 7,2 |
| Насос давления | Научный прибор | PV-PUMP | Индуцирование контролируемого давления во время эксперимента |
| Prime 95B Camera | Фотометрия | Prime 95B sCMOS | Флуоресцентная визуализация |
| Дистанционный блок с поворотным колесом | Sensapex | uM-RM3 | Панель управления для регулировки положения микропипетки |
| Scepter 3.0 Портативный счетчик клеток | Merck Millipore | PHCC340KIT | Автоматический счетчик клеток |
| Бикарбонат натрия (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | Карбонат/бикарбонатный буферный препарат - 2,65 г NaHCO3 с 2,1 г Na2CO3 в 250 мл воды Mili Q - Итоговый pH = 8-9. |
| Карбонат натрия (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | S2127 | Карбонат/бикарбонатный буферный препарат - 2,65 г NaHCO3 с 2,1 г Na2CO3 в 250 мл воды Mili Q - Итоговый pH = 8-9. |
| Буферный препарат хлорида натрия (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | Tryode's - 12 мМ NaHCO3, 10 мМ HEPES, 0,137 M NaCl, 2,7 мМ KCl и 5,5 мМ D-глюкозы с добавлением 1 мМ CaCl2. Конечный pH = 7,2 |
| Моноосновной фосфат натрия моногидрат (2PO4 • H2O) | Sigma-Aldrich | S9638 | Tryode's буферный препарат - 12 мМ NaHCO3, 10 мМ HEPES, 0,137 M NaCl, 2,7 mM KCl и 5,5 мМ D-глюкоза с добавлением 1 мМ CaCl2. Конечный pH = 7,2 |
| Блок управления с сенсорным экраном | Sensapex | uM-TSC | Панель управления для регулировки положения микропипетки |
| X Цель dry | Олимп | Olympus 60x/0.70 LUCPlanFL | Аппаратная система для аспирации микропипеток |
Ссылки
- González-Bermúdez, B., Guinea, G. V., Plaza, G. R. Advances in micropipette aspiration: applications in cell biomechanics, models, and extended studies. Biophysical Journal. 116 (4), 587-594 (2019).
- Mierke, C. T. Physics of Cancer, Volume 3 (Second Edition): Experimental biophysical techniques in cancer research. , IOP Publishing. (2021).
- Chen, Y., et al. Loss of the F-BAR protein CIP4 reduces platelet production by impairing membrane-cytoskeleton remodeling. Blood. 122 (10), 1695-1706 (2013).
- Shin, J. -W., Swift, J., Spinler, K. R., Discher, D. E. Myosin-II inhibition and soft 2D matrix maximize multinucleation and cellular projections typical of platelet-producing megakaryocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (28), 11458-11463 (2011).
- Liapis, H., Foster, K., Miner, J. H. Red cell traverse through thin glomerular basement membrane. Kidney International. 61 (2), 762-763 (2002).
- Wang, H., et al. Fluorescence-coupled micropipette aspiration assay to examine calcium mobilization caused by red blood cell mechanosensing. European Biophysics Journal. 51 (2), 135-146 (2022).
- Danielczok, J. G., et al. Red blood cell passage of small capillaries is associated with transient Ca2+-mediated adaptations. Frontiers in Physiology. 8, 979(2017).
- Diez-Silva, M., Dao, M., Han, J., Lim, C. -T., Suresh, S. Shape and biomechanical characteristics of human red blood cells in health and disease. MRS Bulletin. 35 (5), 382-388 (2010).
- Maître, J. -L., Niwayama, R., Turlier, H., Nédélec, F., Hiiragi, T. Pulsatile cell-autonomous contractility drives compaction in the mouse embryo. Nature Cell Biology. 17 (7), 849-855 (2015).
- Ju, L., Chen, Y., Xue, L., Du, X., Zhu, C. Cooperative unfolding of distinctive mechanoreceptor domains transduces force into signals. eLife. 5, e15447(2016).
- Bogdanova, A., Makhro, A., Wang, J., Lipp, P., Kaestner, L. Calcium in red blood cells-a perilous balance. International Journal of Molecular Sciences. 14 (5), 9848-9872 (2013).
- Oesterle, A. Pipette Cookbook 2018. , Available from: https://www.sutter.com/PDFs/cookbook.pdf (2018).
- Cahalan, S. M., et al. Piezo1 links mechanical forces to red blood cell volume. eLife. 4, e07370(2015).
- Sforna, L., et al. Piezo1 controls cell volume and migration by modulating swelling-activated chloride current through Ca2+ influx. Journal of Cellular Physiology. 237 (3), 1857-1870 (2022).
- High speed pressure clamp. ALA Scientific Instruments. , ALA Scientific. Available from: https://alascience.com/products/hspc-2sb/ (2023).
- Teledyne Imaging Prime 95BTM Scientific CMOS Camera Datasheet. , Available from: https://www.photometrics.com/wp-content/uploads/2019/10/Prime-95B-Datasheet-07172020.pdf (2020).
- Lee, L. M., Lee, J. W., Chase, D., Gebrezgiabhier, D., Liu, A. P. Development of an advanced microfluidic micropipette aspiration device for single cell mechanics studies. Biomicrofluidics. 10 (5), 054105(2016).
- Weaver, W. M., et al. Advances in high-throughput single-cell microtechnologies. Current Opinion in Biotechnology. 25, 114-123 (2014).
- Zhou, E. H., Lim, C. T., Quek, S. T. Finite element simulation of the micropipette aspiration of a living cell undergoing large viscoelastic deformation. Mechanics of Advanced Materials and Structures. 12 (6), 501-512 (2005).
- Oh, M. -J., Kuhr, F., Byfield, F., Levitan, I. Micropipette aspiration of substrate-attached cells to estimate cell stiffness. Journal of Visualized Experiments. (67), e3886(2012).
- Rand, R. P., Burton, A. C. Mechanical properties of the red cell membrane. Biophysical journal. 4 (4), 303-316 (1964).
- Hogan, B., Babataheri, A., Hwang, Y., Barakat, A. I., Husson, J. Characterizing cell adhesion by using micropipette aspiration. Biophysical Journal. 109 (2), 209-219 (2015).
- Henriksen, J. R., Ipsen, J. H. Measurement of membrane elasticity by micro-pipette aspiration. The European Physical Journal E. 14 (2), 149-167 (2004).
- Hochmuth, R. M. Micropipette aspiration of living cells. Journal of Biomechanics. 33 (1), 15-22 (2000).
- Pu, H., et al. Micropipette aspiration of single cells for both mechanical and electrical characterization. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 66 (11), 3185-3191 (2019).
- Guevorkian, K., Maître, J. -L. Chapter 10 - Micropipette aspiration: A unique tool for exploring cell and tissue mechanics in vivo. Methods in Cell Biology. , 187-201 (2017).
- Biro, M., Maître, J. -L. Chapter 14 - Dual pipette aspiration: A unique tool for studying intercellular adhesion. Methods in Cell Biology. 125, 255-267 (2015).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
