Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Модифицированное обусловливание страха для индуцирования поведения бегства у мышей

1.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/66266

⸱

15 декабря 2023 г.

 ,  ,  , 
1Department of Physiology, Kanazawa Medical University

* These authors contributed equally

В этой статье

Уведомление об исправлении

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Краткое содержание

Для изучения поведения в полете в контексте страха мы вводим модифицированный протокол обусловливания страха. Этот протокол гарантирует, что мыши постоянно демонстрируют поведение в бегстве во время предъявления сигнала в условии страха.

Аннотация

Адекватное проявление оборонительного поведения в угрожающей ситуации имеет решающее значение для выживания. Господствующая теория предполагает, что активное защитное поведение, такое как прыжок или быстрый рывок, выражается при высокой угрозе или фактической угрозе, в то время как пассивное защитное поведение, такое как замирание, выражается, когда угроза предсказана, но угроза относительно низкая. При классическом обусловливании страха испытуемые, как правило, демонстрируют замирание в качестве условной защитной реакции, с незначительным выражением активного защитного поведения в большинстве случаев. Здесь мы вводим модифицированную процедуру обусловливания страха для мышей, чтобы наблюдать переход от замирания к бегству и наоборот, включающую пять повторяющихся пар условных стимулов (CS; непрерывный тон, 8 кГц, 95 дБ SPL (уровни звукового давления)) и безусловных стимулов (УЗИ; шок ногой, 0,9 мА, 1,0 с) в течение двух дней. Эта модифицированная процедура обусловливания страха требует относительно большого количества сеансов и дней тренировки, но не требует высокоинтенсивного удара ногой для умеренного выражения поведения в полете. Использование одного и того же контекста для обусловливания и характерных презентаций CS имеет важное значение для выявления поведения в полете. Эта модифицированная процедура обусловливания страха является надежным методом наблюдения за активным защитным поведением у мышей, предоставляя возможность пролить свет на тонкие механизмы и характеристики такого поведения в контексте страха.

Введение

Правильный выбор защитного поведения в угрожающих обстоятельствах имеет решающее значение для выживания всех животных. Защитное поведение постепенно переходит от одного к другому в зависимости от близости угрозы, например, переход от замирания к бегству 1,2,3. Дисрегуляция этого поведения часто наблюдается при различных психических расстройствах4. Посттравматическое стрессовое расстройство (ПТСР) является одним из таких расстройств, характеризующихся преувеличенным защитным поведением, таким как панические реакции на неугрожающиестимулы.

Классическое обусловливание страха у грызунов обычно используется в качестве модели для ПТСР 5,6,7, но грызуны не проявляют бегство (паническое) поведение в этой модели8. Следовательно, классическая модель обусловливания страха, часто называемая «моделью ПТСР грызунов», не обладает валидностью для ПТСР у людей, особенно в том, что касается захвата симптомов бегства или паники, которые не были хорошо изучены.

Недавно несколько модифицированных протоколов обусловливания страха успешно продемонстрировали, что испытуемые грызуны демонстрируют поведение в полете во время этих процедур. Например, повторяющиеся ассоциации условного стимула (КС) и безусловного стимула (УЗИ) семь раз в день позволяли самкам крыс демонстрировать поведение, похожее на поведение в полете. В двухдневном обусловливании страха с использованием последовательных составных стимулов (SCS; состоит из тона, за которым следует шум), мыши начали демонстрировать поведение в полете во время шумовой части презентаций SCS10, 11, 12. Подробное описание метода СКС приведено в протокольном отчете13. Трехдневное обусловливание страха с помощью SCS также сработало для крыс, чтобы индуцировать поведение бегства14. Однако эти новые протоколы имеют некоторые ограничения. Например, использование серийного предъявления реплик не позволяет исключить влияние оценки близости на защитное поведение. В случае семикратной ассоциации CS-US у крыс большинство реакций на бегство наблюдалось у самок, а не у самцов.

В свете этих соображений мы вводим модифицированный протокол обусловливания страха для мышей, чтобы исследовать поведение при бегстве в контексте страха. Самцы мышей постоянно демонстрируют поведение в полете во время нашего модифицированного обусловливания страха. В этом протоколе выступающий тон используется в качестве CS вместо SCS. Кроме того, требуется не менее пяти пар CS-US в день в течение, по крайней мере, двух дней, наряду с потенцированием страха условным контекстом. Протокол предоставляет еще один вариант для исследования поведения в полете, дополняя предыдущие протоколы, в зависимости от цели исследования.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Этот протокол был проведен в соответствии с руководящими принципами Физиологического общества Японии и получил одобрение Комитета по уходу за животными Медицинского университета Канадзавы (2021-32). Все процедуры были проведены в соответствии с рекомендациями ARARIVE. Для исследования были использованы взрослые самцы мышей C57BL/6J (в возрасте 3-6 месяцев), и ранее было подтверждено, что эти мыши демонстрировали поведение в полете, описанное в этой рукописи15.

1. Подготовка животных

  1. Групповые мыши (3-4 в клетке; поддерживались при температуре 23-27 °C; в течение 12-часового цикла свет/темнота; обеспечивали свободный доступ к пище и воде) до начала экспериментов.
  2. Поместите каждую мышь в клетку из плексигласа (14 см × 21 см × 12 см) по крайней мере на 3 дня, прежде чем подвергнуться этому модифицированному обусловливанию страха.

2. Настройка инструментов/оборудования

  1. Коробка обусловливания страха (рис. 1А)
    1. Используйте камеру кондиционирования страха (25 см × 25 см × 25 см), заключенную в звукопоглощающую коробку (67 см × 53 см × 55 см) (см. Таблицу материалов).
    2. Необходимы два контекста (A и B). Для контекста А создайте черно-белые полосы на стенах, прикрепив белый пластиковый картон черными лентами (шириной 3 см, 4 на доске). Для пола используйте белую гладкую пластиковую доску.
    3. Протирайте стены и пол гептанолом (1%) перед каждым сеансом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Активная система вентиляции не используется. Чистка спиртом в конце сеанса уменьшает запах гептанола.
    4. Для контекста Б сделайте стены полностью черными, удалив доску, используемую в контексте А. Пол представляет собой сетчатый пол.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При очистке не возникает никакого специфического запаха, кроме легкого запаха спирта.
    5. Осветите экспериментальную коробку с помощью верхнего белого светодиода (светодиод, 240 люкс) (см. Таблицу материалов).
  2. Шокер
    1. Подсоедините скрембл-шокер (см. Таблицу материалов) к решетчатому полу, состоящему из стержней из нержавеющей стали. Это используется для обеспечения ударов ногами. Интенсивность удара стопой устанавливали на уровне 0,9 мА в соответствии с распространенными методами обусловливания страха 10,11,12,13.
  3. Аудиогенератор
    1. Разместите динамик (см. Таблицу материалов) на потолке. Все акустические раздражители усиливаются.
    2. С помощью 1/4-дюймового микрофона можно изменить и откалибровать общую амплитуду каждого стимула для получения уровней звукового давления (SPL, re: 20 μ Па) на передней части динамика диаметром 5 см. Представьте непрерывный тональный взрыв через этот динамик.
      Примечание: Калибровка звукового динамика имеет решающее значение для изучения тонкого влияния звукового стимула на защитное поведение во время этого модифицированного обусловливания страха.
  4. Датчик
    1. Поместите пол испытательной камеры на преобразователь (см. Таблицу материалов) для обнаружения вибрации. Сигнал с преобразователя передается на звуковую карту с частотой дискретизации 8 кГц для регистрации поведенческих колебаний.
  5. Видеокамера
    1. Разместите CMOS-камеру (см. Таблицу материалов) на потолке, чтобы отслеживать движения объекта и записывать звук в блоке кондиционирования.
  6. Система запуска
    1. Используйте звуковое программное обеспечение (см. Таблицу материалов) для запуска звуковых сигналов или ударов ногами в запланированное время.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого подойдет любой имеющийся в продаже стимулятор.

3. Поведенческий эксперимент

  1. Запланируйте четыре дня процедур обусловливания страха: привыкание (1 день, 5 попыток), обусловливание (2 дня по 5 попыток) и сеансы теста/вымирания (1 день, 5 или 15 попыток). Интервалы между испытаниями варьировали в пределах 60-75 с (рис. 1Б).
    Примечание: Предпочтительно включить десять или более испытуемых в группу, чтобы получить надежные поведенческие тенденции. В зависимости от цели исследования требуются две или три группы.
    1. Во время сеанса обусловливания предъявите безусловный стимул (УС) (1 с, 0,9 мА) сразу после прекращения условного стимула (КС) (непрерывный тоновый всплеск, 8 кГц, 20 с, 95 дБ SPL), как показано на рисунке 1B. Поставьте пять пар CS-US за день подготовки.
    2. После окончания 5-го удара ногой оставьте испытуемого в контексте на 1 минуту, прежде чем вернуть его в домашнюю клетку. Протирайте камеру 70% спиртом для очистки после каждого поведенческого теста.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Интенсивность КС и УЗИ может быть изменена в зависимости от цели исследования. Предыдущие исследования показали, что более сильная интенсивность CS вызывает более активное защитное поведение, чем более мягкое. Кондиционные дни также могут быть продлены.
  2. Вызывайте поведение в полете во время презентаций CS в соответствии с графиком, указанным ниже.
    Примечание: В этом эксперименте используются CS (95 дБ SPL) и US (0,9 мА).
    1. В 1-й день подвергните испытуемых 5 испытаниям только КС в контексте А.
    2. На 2-й и 3-й дни испытуемые с 5 ассоциативными испытаниями CS-US в контексте B.
    3. На 4-й день подвергните испытуемых 5 испытаниям КС для сеанса вспоминания в контексте Б. В случае тестирования на исчезновение памяти, подвергните испытуемых 15 испытаниям только КС.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для проверки стабильности памяти поможет продление сеансов вымирания на 2-3 дня. Кроме того, тестирование памяти через неделю, а не на 4-й день, может дать дополнительное подтверждение стабильности памяти.

4. Анализ защитного поведения

ПРИМЕЧАНИЕ: Анализируется движение, процент замирания и количество прыжков во время презентаций CS. Подробности описаны ниже. Если это возможно, лучше проводить анализ двойным слепым методом.

  1. Синхронизируйте время событий на видео и время стимулов (CS и US), используя начало тона, записанное в видео.
  2. Используйте специально разработанный код для вычисления как усредненных, так и общих движений мышей на основе разницы в центре масс силуэта объекта в кадрах.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого измерения используются произвольные единицы, так как скорость движения зависит от частоты дискретизации фильма.
  3. Чтобы измерить процент замерзания, используйте сигнал датчика во времени.
    1. Предварительная обработка сигналов преобразователя с помощью полосового фильтра 20-500 Гц.
    2. Вычислите среднеквадратичную амплитуду сигнала преобразователя во времени для каждого интервала длительностью 50 мс.
    3. Установите пороговое значение амплитуды сигнала для определения периода неподвижности. Длительностью неподвижности является период сигнала ниже порогового значения более чем на 1 с.
    4. Вручную измерьте продолжительность замораживания, посмотрев видео.
    5. Отрегулируйте порог амплитуды сигнала для замораживания, сравнив измеренный вручную процент замерзания и процент, рассчитанный по сигналу преобразователя.
  4. Подсчитайте количество переходов вручную из видеофайлов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подсчет количества дротиков также будет полезен для оценки реакции на полет.

5. Статистический анализ

  1. Установите статистическую значимость на уровне p < 0,05.
  2. Для сравнения между несколькими группами и несколькими факторами проведите многомерный ANOVA с последующим post-hoc тестом. Если тестируется определенный день графика кондиционирования, выполните несколько сравнительных тестов или тестов на перестановку.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Результаты, полученные с помощью модифицированного обусловливания страха у самцов мышей (C57BL/6J; 3-6 месяцев), представлены в соответствии с графиком, показанным на рисунке 1C. Эксперимент был разработан для изучения того, как условный контекст влияет на выражение поведения в полете. Были выделены две группы: 1-я (n = 10) и 2-я (n = 10). В этом эксперименте использовались CS (95 дБ SPL) и УС (0,9 мА).

В 1-й день все мыши подвергались воздействию только 5 условны...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Модифицированный протокол обусловливания страха, представленный в этой статье, является стабильным методом исследования поведения в полете в контексте страха. Используя этот протокол, мы обнаружили, что поведение мышей в бегстве в контексте страха вызывается значимыми стимулами и зависит от контекста. Характеристики поведения в полете не были хорошо изучены, так как не существовало подходящего протокола для наблюдения за поведением в полете. Этот протокол будет одним из подходящих методов для изучения активного обороните...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Благодарности

Эта работа была частично поддержана грантами KAKENHI JP22K15795 (Т.Ф.), JP22K09734 (Н.К.), JP21K07489 (Р.Й.), Медицинским университетом Канадзавы (C2022-3, D2021-4, Р.Й.) и Фондом Найто (Т.Ф.).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
АудиодинамикFostexFT17H
УсилительSonyTA-F500
CMOS камераSanwa Supply Inc.CMS-V43BK
Камера кондиционирования страхаPanlab S.L.U.LE116
Пищевые гранулыNosanLabo MR стандартный
светодиодYamazenLT-B05N
Микрофонтипа ACO4156N
Scramble shockerPanlab S.L.U.LE 100-26
Звуковая картаBehringerUMC202
Звуковое программное обеспечениеSyntrillium SoftwareCool Edit 2000
ПреобразовательPanlab S.L.U.LE 111

Ссылки

  1. Fanselow, M. S., Lester, L. S. Evolution and learning. , Psychology Press. 185-212 (1988).
  2. Fanselow, M. S. Neural organization of the defensive behavior system responsible for fear. Psychonomic Bulletin & Review. 1 (4), 429-438 (1994).
  3. Mobbs, D., Headley, D. B., Ding, W., Dayan, P. Space, time, and fear: Survival computations along defensive circuits. Trends in Cognitive Sciences. 24 (3), 228-241 (2020).
  4. Black, D. W., Grant, J. E. Dsm-5 guidebook: The essential companion to the diagnostic and statistical manual of mental disorders. American Psychiatric Pub. , (2014).
  5. Bienvenu, T. C., et al. The advent of fear conditioning as an animal model of post-traumatic stress disorder: Learning from the past to shape the future of ptsd research. Neuron. 109 (15), 2380-2397 (2021).
  6. Johnson, L. R., Mcguire, J., Lazarus, R., Palmer, A. A. Pavlovian fear memory circuits and phenotype models of ptsd. Neuropharmacology. 62 (2), 638-646 (2012).
  7. Yehuda, R., Ledoux, J. Response variation following trauma: A translational neuroscience approach to understanding ptsd. Neuron. 56 (1), 19-32 (2007).
  8. Ledoux, J. E. Emotion circuits in the brain. Annual Review of Neuroscience. 23 (1), 155-184 (2000).
  9. Gruene, T. M., Flick, K., Stefano, A., Shea, S. D., Shansky, R. M. Sexually divergent expression of active and passive conditioned fear responses in rats. Elife. 4, e11352(2015).
  10. Fadok, J. P., et al. A competitive inhibitory circuit for selection of active and passive fear responses. Nature. 542 (7639), 96-100 (2017).
  11. Hersman, S., Allen, D., Hashimoto, M., Brito, S. I., Anthony, T. E. Stimulus salience determines defensive behaviors elicited by aversively conditioned serial compound auditory stimuli. Elife. 9, e53803(2020).
  12. Trott, J. M., Hoffman, A. N., Zhuravka, I., Fanselow, M. S. Conditional and unconditional components of aversively motivated freezing, flight and darting in mice. Elife. 11, e75663(2022).
  13. Borkar, C. D., Fadok, J. P. A novel pavlovian fear conditioning paradigm to study freezing and flight behavior. Journal of Visualized Experiments. 167, e61536(2021).
  14. Totty, M. S., et al. Behavioral and brain mechanisms mediating conditioned flight behavior in rats. Scientific Reports. 11 (1), 8215(2021).
  15. Furuyama, T., et al. Multiple factors contribute to flight behaviors during fear conditioning. Scientific Reports. 13 (1), 10402(2023).
  16. Cain, C. K. Avoidance problems reconsidered. Current Opinion in Behavioral Sciences. 26, 9-17 (2019).
  17. Ledoux, J. E., Moscarello, J., Sears, R., Campese, V. The birth, death and resurrection of avoidance: A reconceptualization of a troubled paradigm. Molecular Psychiatry. 22 (1), 24-36 (2017).
  18. Bouchekioua, Y., et al. Serotonin 5-ht2c receptor knockout in mice attenuates fear responses in contextual or cued but not compound context-cue fear conditioning. Translational Psychiatry. 12 (1), 58(2022).
  19. Bouchekioua, Y., Nishitani, N., Ohmura, Y. Conditioned lick suppression: Assessing contextual, cued, and context-cue compound fear responses independently of locomotor activity in mice. Bio-Protocol. 12 (23), e4568(2022).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Исправление


Formal Correction: Erratum: Modified Fear Conditioning for Inducing Flight Behaviors in Mice
Posted by JoVE Editors on 5/17/2024. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/66266

Теги

Модифицированное обусловливание страха для индуцирования поведения бегства у мышей
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.