Адаптация в экстремальных периодах жизни: экспериментальная эволюция с экстремофильным археем Sulfolobus acidocaldarius

Ранняя жизнь на Земле могла возникнуть в экстремальных условиях, таких как гидротермальные жерла, которые характеризуются чрезвычайно высокими температурами и^{кислотностью.} Микробы продолжают обитать в экстремальных условиях, включая горячие источники и вулканическую сольфатару. Характеристика эволюционной динамики, происходящей в этих экстремальных условиях, может пролить свет на специализированные физиологические процессы, которые обеспечивают выживание в этих условиях. Это может иметь далеко идущие последствия, от нашего понимания истоков биологического разнообразия до разработки новых высокотемпературных ферментов с биотехнологическим применением.

Понимание эволюционной динамики микробов в экстремальных условиях остается ограниченным, несмотря на ее критическую важность. В отличие от этого, значительный объем знаний об эволюции в мезофильной среде был получен благодаря применению метода, известного как экспериментальная эволюция. Экспериментальная эволюция включает в себя наблюдение за эволюционными изменениями в лабораторных условиях 2,3,4,5. Часто это связано с определенными изменениями окружающей среды (например, температурой, соленостью, введением токсина или конкурирующего организма)^7,8,9. В сочетании с полногеномным секвенированием экспериментальная эволюция позволила нам проверить ключевые аспекты эволюционных процессов, включая параллелизм, повторяемость и геномную основу для адаптации. Тем не менее, к настоящему времени основная часть экспериментальной эволюции была выполнена с мезофильными микробами (включая бактерии, грибы и вирусы 2,3,4,5, но в значительной степени исключая архей). Метод экспериментальной эволюции, применимый к термофильным микробам, позволил бы нам лучше понять, как они развиваются, и способствовал бы более полному пониманию эволюции. Это может иметь далеко идущие последствия, от расшифровки происхождения термофильной жизни на Земле до биотехнологических применений, включающих «экстремозимы», используемые в высокотемпературных биопроцессах¹⁰ и астробиологических^{исследованиях11}.

Архей Sulfolobus acidocaldarius является идеальным кандидатом в качестве модельного организма для разработки экспериментальных методов эволюции термофилов. S. acidocaldarius размножается аэробно, с оптимальной температурой роста при 75 °C (диапазон от 55 °C до 85 °C) и высокой кислотностью (pH 2-3)4,6,12,13,14. Примечательно, что, несмотря на экстремальные условия роста, S. acidocaldarius поддерживает плотность популяции и частоту мутаций, сравнимую с мезофилами 7,15,16,17,18. Кроме того, он обладает относительно небольшим, хорошо аннотированным геномом (штамм DSM639: 2,2 Mb, 36,7% GC, 2,347 генов)¹²; S. acidocaldarius также извлекает выгоду из надежных инструментов геномной инженерии, позволяющих напрямую оценивать эволюционный процесс через целевые нокауты генов^. Примечательным примером этого является доступность генетически модифицированных штаммов S. acidocaldarius, таких как урациловые ауксотрофные штаммы MW001¹⁹ и SK-1²⁰, которые могут служить в качестве селективных маркеров.

Существуют значительные трудности с проведением экспериментальной эволюции с термофилами, такими как S. acidocaldarius. Длительная инкубация при высоких температурах, необходимых для этих исследований, приводит к значительному испарению как для жидких, так и для твердых методов культивирования. Длительная работа при высоких температурах также может повредить традиционные встряхивающие инкубаторы, которые обычно используются в экспериментальной эволюции в жидких средах. Изучение нескольких температур требует значительных финансовых вложений для приобретения и обслуживания нескольких инкубаторов. Кроме того, высокое энергопотребление вызывает серьезные экологические и финансовые проблемы.

В этой работе представлен метод решения проблем, возникающих при проведении экспериментальной эволюции с термофилами, такими как S. acidocaldarius. Основываясь на методе, разработанном Baes et al. для исследования реакции на тепловой шок^14,21, в разработанном здесь методе используются настольные термомиксеры для последовательной и надежной высокотемпературной инкубации. Его масштабируемость позволяет одновременно оценивать несколько температурных обработок с меньшими затратами на приобретение дополнительного инкубационного оборудования. Это повышает эффективность эксперимента, обеспечивая надежный статистический анализ и обширное исследование факторов, влияющих на эволюционную динамику у термофилов^. Более того, такой подход значительно снижает первоначальные финансовые вложения и потребление энергии по сравнению с традиционными инкубаторами, предлагая более устойчивую и экологически чистую альтернативу.

Наш метод закладывает основу для экспериментального изучения эволюционной динамики в условиях, характеризующихся экстремальными температурами, которые, возможно, играли ключевую роль на ранних стадиях диверсификации жизни на Земле. Теплолюбивые организмы обладают уникальными свойствами, но их экстремальные условия роста и специализированные требования часто ограничивают их доступность в качестве модельной системы. Преодоление этих барьеров не только расширяет исследовательские возможности для изучения эволюционной динамики, но и повышает более широкую полезность термофилов в качестве модельных систем в научных исследованиях.

1. Приготовление питательной среды S. acidocaldarius (BBM⁺)

ПРИМЕЧАНИЕ: Для культивирования S. acidocaldarius по этому протоколу используется базальная среда Брока (BBM⁺)²³. Его готовят путем объединения неорганических исходных растворов, описанных ниже, для создания BBM^-, который может быть приготовлен заранее. Затем BBM⁺ подготавливают по мере необходимости, добавляя в BBM⁻ растворы органических исходных материалов. Рецепты стоковых растворов также представлены в таблице 1. Все среды и исходные растворы должны быть приготовлены в условиях двойной дистилляции Н₂О (дд Н₂О).

1. Приготовление неорганических исходных растворов для питательной среды
   1. Приготовьте исходный раствор микроэлементов.
      1. Приготовьте исходный раствор микроэлементов, добавив 9 г/л декагидрата тетрабората натрия (Na₂B₄O₇·10H₂O) к ddH₂O, с последующим добавлением 1:1 H₂SO₄ по каплям до тех пор, пока он не растворится.
      2. Последовательно вводят 0,44 г/л гептагидрата сульфата цинка (ZnSO₄·7H₂O), 0,1 г/л дигидрата хлорида меди(II) (CuCl₂·2H₂O), 0,06 г/л дигидрата молибдата натрия (Na₂MoO₄·2H₂O), 0,06 г/л дигидрата сульфата ванадия (IV) (VOSO_{4,2H 2}O), 0,02 г/л гептагидрата сульфата кобальта (II) (CoSO₄·7H₂O), и 3,6 г/л тетрагидрата хлорида марганца(II) (MnCl₂·4H₂O). Раствор автоклавировать и хранить при температуре 4 °С.
   2. Приготовьте исходный раствор Fe (1000x), растворив 20 г/л гексагидрата хлорида железа (FeCl₃·6H₂O) в ddH₂O. Стерилизуйте раствор путем фильтрации через фильтр 0,22 мкм и храните при температуре 4 °C.
   3. Приготовьте раствор Брока I (1000x), растворив 70 г/л хлорида кальция (CaCl₂·2H₂O) в воде двойной дистилляции (ddH₂O). Автоклав и хранить при температуре 4 °C.
      ВНИМАНИЕ: Растворение CaCl₂·2H_2Oв воде является экзотермическим процессом. Выполняйте этот шаг с осторожностью. Надевайте термозащитные перчатки класса EN407 для защиты от травм. Не закрывайте сосуд плотно, так как давление может нарастать.
   4. Приготовьте раствор Брока II/III, смешав 130 г/л сульфата аммония ((NH₄)₂SO₄), 25 г/л гептагидрата сульфата магния (MgSO₄·7H₂O), 28 г/л дигидрофосфата калия (KH₂PO₄) и 50 мл ранее приготовленного исходного раствора микроэлементов. Используя 1:1 H₂SO₄, отрегулируйте pH исходного раствора до 2-3. Отавтоклавируйте раствор и храните его при комнатной температуре (RT).
2. Приготовление органических исходных растворов для питательной среды
   1. Приготовьте стоковый раствор D-глюкозы (100x) путем растворения 300 г/л (30% w/v) D-глюкозы в ddH₂O и простерилизуйте фильтром (через фильтр 0,22 мкм). Хранить при температуре 4 °C.
      Примечание: В соответствии с экспериментальными требованиями вместо D-глюкозы могут быть использованы другие источники углерода (например, D-ксилоза).
   2. Приготовьте пептон из казеинового стокового раствора (100x) путем растворения пептона из казеина в концентрации 100 г/л в ddH₂O. Автоклав для стерилизации и храните исходный раствор при RT.
   3. Приготовьте исходный раствор урацила (100x), растворив 2 г/л урацила в ddH₂O и простерилизуйте фильтром (через фильтр 0,22 мкм); хранить при температуре −20 °C.
3. Приготовление питательной среды BBM⁺ в рабочей концентрации 1x
   1. Сначала приготовьте 988 мл стерильного ddH₂O путем автоклавирования.
   2. Приготовьте 1 л BBM^- , добавив 1 мл раствора Brock Stock Solution I, 10 мл Brock Stock Solution II/III и 1 мл раствора Fe stock к 988 мл стерильного ddH₂O, предварительно автоклавированного. Отрегулируйте pH среды в диапазоне 2-3 с 1:1 H₂SO₄.
      ПРИМЕЧАНИЕ: BBM⁻ может быть изготовлен заранее и храниться в RT до 1 месяца.
   3. Наконец, чтобы получить 1 л BBM⁺, смешайте по 10 мл D-глюкозного стокового раствора, пептона из стокового раствора казеина и стокового раствора урацила с 985 мл BBM⁻. Хорошо перемешайте и отрегулируйте pH среды до 2-3 с 1:1 H₂SO₄.
      ПРИМЕЧАНИЕ: BBM⁺ должен быть свежим по мере необходимости.
4. Приготовление твердой среды BBM⁺
   1. Приготовить 1 М стоковые растворы MgCl₂ и CaCl₂; это будет способствовать затвердеванию твердой среды BBM. Для 1 М MgCl₂ добавьте 9,5 г к 100 мл ddH₂O. Для 1 М CaCl₂ добавьте 11 г на 100 мл ddH₂O. Автоклав для стерилизации.
      ВНИМАНИЕ: Растворение CaCl₂·2H_2Oв воде является экзотермическим процессом. Выполняйте этот шаг с осторожностью. Надевайте термозащитные перчатки класса EN407 для защиты от травм. Не закрывайте сосуд плотно, так как давление может нарастать.
   2. Смешайте 3% (по массе) геллановой камеди (например, 30 г/л) в ddH₂O и в автоклаве для стерилизации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Геллановая камедь (например, Gelrite) используется здесь в качестве желирующего агента, так как стандартный бактериологический агар не может затвердевать при 75 °C.
   3. Отдельно приготовьте BBM⁺ для твердой среды, которую следует смешать в соотношении 1:1 со стерильной геллановой камедью, приготовленной на шаге 1.4.1.
      1. Сначала приготовьте 1 л BBM⁻ , как в пункте 1.3.2. Смешайте 887 мл BBM⁻ с 1 мл стокового раствора Fe и по 20 мл стокового раствора D-глюкозы, пептоном из стокового раствора казеина и стоковым раствором урацила.
      2. Добавьте 40 мл 1 М MgCl₂ и 12 мл 1 М CaCl₂. Хорошо перемешайте и отрегулируйте pH среды до 2-3 с 1:1 H₂SO₄.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Объемы складских растворов, добавленные здесь, намеренно больше, чем для приготовления жидкого BBM⁺ на шаге 1.3. Это необходимо для того, чтобы учесть смешивание в соотношении 1:1 с расплавленной геллановой камедью на следующем этапе.
   4. Разогрейте BBM⁺ для твердой среды примерно до 75 °C и смешайте в соотношении 1:1 с расплавленной геллановой камедью в ddH₂O. Хорошо перемешайте и залейте в термостабильный пластик (например, полипропилен), стеклянные чашки Петри или шестилуночные планшеты для ростаS. acidocaldarius. Используйте агар сразу после смешивания, так как он быстро схватится.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые полистирольные чашки Петри 90 мм, обычно используемые в микробиологии, деформируются при длительной инкубации при высоких температурах.
      ВНИМАНИЕ: Принимайте соответствующие меры предосторожности при работе с горячими жидкостями; Надевайте термозащитные перчатки с классом EN407 для защиты от травм.

2. Возрождение S. acidocaldarius из культуры заморозки

1. Подготовка вентилируемых труб для выращивания для обеспечения достаточной аэрации и доступности кислорода.
   1. Заранее подготовьте проколотые микроцентрифужные пробирки объемом 2 мл для роста Sulfolobus . Осторожно нагрейте тупую проволоку (>0,7 мм, например, выпрямленную скрепку) с помощью пламени горелки Бунзена и проткните крышку трубки, создав небольшое отверстие примерно 1 мм.
   2. Поместите проколотые пробирки в автоклавируемый сосуд (например, в пустую коробку из-под наконечника для дозатора) и автоклав для стерилизации.
      ВНИМАНИЕ: Надевайте термозащитные перчатки класса EN407 для защиты от термических травм рук от нагретого металла. Нагревайте провод только в течение короткого времени (1-2 с), чтобы предотвратить перегрев. Следует использовать только металлы с высокой температурой плавления (сталь).
2. Инокулируйте стартовые культуры S. acidocaldarius.
   1. Заполните автоклавные пробирки объемом 2 мл 1,5 мл предварительно подогретого BBM⁺ (как приготовлено в разделе 1, предварительно инкубировать при 75 °C в течение не менее 15 минут).
   2. Инокулируйте заполненные BBM⁺ пробирки соскобами (эквивалентно 50 - 60 мг) из глицеринового сырья (25% v/v глицерина, хранящегося при -80 °C). Здесь используется штамм S. acidocaldarius DSM639. Заполните дополнительную пробирку 1,5 мл BBM+ в качестве отрицательного контроля.
3. Чтобы предотвратить утечку аэрозолей из проколотой крышки пробирки объемом 2 мл и загрязнение среды роста (и любых других образцов), а также для снижения вариабельности испарения культуры внутри пробирок, поместите на верхнюю часть крышки газопроницаемую мембрану, которая может выдерживать повышенные температуры (65-85 °C) и блокировать утечку/инфильтрацию микробов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Использование газопроницаемых мембран для герметизации труб значительно снижает испарение. В течение 48-часового периода при температуре 75 °C герметизированные пробирки демонстрируют среднюю потерю объема 8,63% (диапазон: 3,29-16,45%, n = 24 технических повторения, повторенных дважды), в отличие от 25,05% (диапазон: 11,92-62,91%, n = 24 технических повторения, повторенных дважды) для негерметичных пробирок.
4. Инокулированные пробирки инкубируют в термомиксере при температуре 75 °C с постоянным встряхиванием при 400 оборотах в минуту (об/мин) в течение 48-72 ч или до тех пор, пока не будет достигнут внешний диаметр_{600 нм} 0,3 - 0,8, измеренный спектрофотометром.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Проколотая крышка пробирок объемом 2 мл и встряхивание обеспечивают соответствующую аэрацию для оптимального роста. Крышка термомиксера должна быть на месте, чтобы обеспечить поддержание постоянной температуры и уменьшить испарение.
5. После инкубационного периода дайте ожившим культурам вторую фазу роста (предварительное кондиционирование).
   1. Гранулируйте культуры, вращая пробирки при 5000 x g в течение 2 минут при RT. Затем выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в свежем 1,5 мл теплого BBM⁺.
      Примечание: В этом эксперименте используется штамм дикого типа S. acidocaldarius DSM639, но эти методы роста и экспериментальной эволюции могут быть применены к любому штамму Sulfolobus и, возможно, к другим термофилам.

3. Определение плотности популяции, времени удвоения и фазы экспоненциального роста для S. acidocaldarius

1. Определение плотности популяции и времени до фазы экспоненциального роста для выбранных условий выбора. Для каждого тестируемого условия окружающей среды готовят три закваски, следуя шагам 2.1-2.5.
2. Разбавьте три культуры в BBM⁺ до наружного диаметра_{600 нм,} равного 0,01. Вносите не менее 20 мл из каждой культуры. Эти три культуры представляют собой технические репликации.
3. Выполняйте репликацию кривых роста наружного диаметра_{600 нм} с течением времени с помощью деструктивной выборки.
   1. Подготовьте 24 проколотые пробирки объемом 2 мл на шаге 2.1, разделите их на три комплекта по восемь и пометьте эти технические реплики 1, 2 и 3 (например, восемь пробирок помечены как реплики 1 и т. д.).
   2. Из каждой из трех разведенных культур с шага 3.2 пипетку по 1,5 мл в семь подготовленных пробирок. Заполните оставшуюся пробирку 1,5 мл BBM+ в качестве отрицательного контроля.
4. Инкубируйте все 24 пробирки в термомиксере при температуре 75 °C и 400 об/мин. Уплотнить газопроницаемой мембраной. Через равные промежутки времени (например, 0, 4, 8, 12, 24, 36, 48 ч) извлеките по одной трубке из каждого из трех повторов и измерьте наружный диаметр_{600 нм} с помощью спектрофотометра, затем выбросьте трубку. Замените газопроницаемую мембрану после снятия трубки.
5. Параллельно определите взаимосвязь между наружным диаметром_{600 нм} и плотностью населения. Выполняйте последовательные разведения (от 1 x ^10-1 до 1 x ^10-6) в среде BBM⁺ по крайней мере в трех временных точках (в идеале в начале, середине и конце). Инокулируйте по 100 мкл каждого разбавления в твердую среду BBM⁺ (приготовленную как на шаге 1.4).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения стабильного роста колоний и точного подсчета лучше всего пипетировать разведенную культуру на твердую среду в месте без механического распределения, например, с помощью L-образного разбрасывателя или стеклянных шариков. Механическое распространение, по-видимому, отрицательно влияет на образование колоний.
6. Инкубируйте планшеты в статическом инкубаторе при температуре 75 °C до появления колоний (5-7 дней).
   1. В течение этого временного промежутка поддерживайте инкубатор во влажном состоянии, чтобы избежать чрезмерного пересыхания пластин, иначе колонии не будут образовываться.
   2. Добиться этого можно, поместив пластины в закрытый полипропиленовый ящик, выстланный влажной тканью. Проткните крышку коробки не менее трех раз, чтобы обеспечить аэрацию.
   3. Поставьте в инкубатор ведра с водой, чтобы повысить влажность. Ежедневно наполняйте ведра.
7. После того, как все измерения наружного диаметра_{600 нм} будут собраны, определите время удвоения и время достижения фазы экспоненциального роста, подогнав логистическую кривую к отношению между наружным диаметром_{600 нм} и временем, например, с помощью функции SummarizeGrowth из пакета growthcurver в R.
8. После того, как видимые колонии сформировались на твердой среде, подсчитайте колониеобразующие единицы (КОЕ), стремясь отсчитывать от фактора разбавления, получив 50-100 колоний для достижения наилучшей точности.
9. Рассчитайте плотность клеток в питательной среде по формуле: КОЕ/мл = количество колоний/(объемное покрытие × коэффициенте разбавления).
10. Выполните логарифмическую линейную регрессию для определения взаимосвязи между log10 (КОЕ) и log10 (наружный диаметр_{600 нм).} Таким образом, рассчитаем прогнозируемый КОЕ/мл для заданного ОД по наклону и пересечению регрессионной модели: прогнозируемый КОЕ = 10^{[наклон × log10(OD600nm) + пересечение]}.
11. (Дополнительный) Также выполните в встряхивающем инкубаторе шаги 3.1-3.10, чтобы определить, достигается ли сопоставимый рост в термомиксерах.

4. Начало независимых линий для экспериментальной эволюции

1. День 1: Чтобы создать одиночные колонии, сначала выполните все шаги, описанные в разделе 2 выше, чтобы создать исходную культуру.
2. День 3: Измерьте наружный диаметр_{600 нм} культуры, чтобы убедиться, что она достигла достаточной плотности в экспоненциальной фазе (наружный диаметр_{600 нм} 0,3-0,8 с помощью спектрофотометра).
3. Проводят серийные разведения культуры S. acidocaldarius DSM639 из 1 x ^10-1-1 x ^10-6 и распределяют по 100 мкл от каждого разведения 1 x ^10-5 и 1 x ^10-6 в лунки 6-луночного планшета, содержащего твердую среду BBM⁺ (раздел 1 и таблица 1) в нескольких повторениях. Инкубируйте планшеты при температуре 75 °C в статическом инкубаторе, как показано на шаге 3.5, в течение 5-7 дней, чтобы появились отдельные колонии.
4. День 8-10 (5-7 дней после инкубации):
   1. Определите количество развивающихся линий из отдельных колоний. Для каждой линии выберите одну колонию случайным образом из пластин с помощью петли инокуляции. Ресуспендируйте колонию в проколотую пробирку объемом 2 мл, содержащую 1,5 мл предварительно подогретой среды BBM⁺ . Нанесите соответствующую маркировку на пробирку.
   2. Повторите для нужного количества линий; здесь было установлено семь линий, помеченных как SA1-7. Заполните дополнительную пробирку 1,5 мл BBM+ в качестве отрицательного контроля.
   3. Запечатайте верхушки пробирок дышащей мембраной и инкубируйте в термомиксере при температуре 75 °C, 400 об/мин в течение 48-72 ч, пока культуры не станут мутными (эквивалентно наружному диаметру_{600 нм} 0,3-0,8 по спектрофотометру).
5. День 10-12 (через 7-9 дней после прививки):
   1. В настольной центрифуге вращайте клональные культуры при 5000 x g в течение 1 мин при RT. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу 200 μл жидкого BBM⁺.
   2. Смешайте 200 мкл клеточных суспензий с 200 мкл 50% глицерина (25% v/v глицерина) для создания запасов глицерина семи независимых линий и храните при -80 °C. Это предковые популяции для эволюционных экспериментов.

5. Проведение эксперимента по изменению температуры

Примечание: Концептуальная схема, описывающая основные аспекты протокола эксперимента, приведена на рисунке 1.

1. Используйте семь предковых популяций, полученных в разделе 4, для эволюционного эксперимента.
   1. Все экспериментальные эволюционные анализы проводят в стерильных, проколотых пробирках объемом 2 мл, пломбированных проницаемой мембраной (описаны выше, раздел 2).
   2. Наряду с этими популяциями поддерживайте отдельные проколотые пробирки объемом 2 мл с 1,5 мл BBM⁺ в качестве отрицательного контроля без культуры для мониторинга (перекрестного) загрязнения и установления порогового значения OD, указывающего на отсутствие роста культуры.
2. Установите температурную обработку: использование термомиксеров позволяет установить несколько температурных обработок. Здесь используются следующие температурные обработки: постоянная 75 °C, постоянная 65 °C и постепенное снижение температуры с 75 до 65 °C путем снижения температуры на 1 °C каждые 4 дня («обработка перепадом температуры»).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эти методы лечения могут быть адаптированы к конкретным экспериментальным требованиям. Для каждой температурной обработки требуется отдельный термомиксер.
3. День 1: Оживите популяции предков из их запасов глицерина (приготовлено на шаге 4.5) после выполнения шагов, описанных в разделе 2.
4. День 3:
   1. Разбавляют эти культуры до наружного диаметра_{600 нм} 0,01 (измеренного спектрофотометром) до общего объема не менее 6 мл предварительно подогретого BBM⁺. Аликвоту по 1,5 мл от каждой из семи культур предковой популяции разбавляют в три отдельные проколотые пробирки объемом 2 мл, по одной для каждой температурной обработки, установленной на шаге 5.2.
      Примечание: Этот шаг аликвотирования гарантирует, что любая генетическая вариация, присутствующая в каждой предковой популяции, присутствует при всех температурных обработках в начале эволюционного эксперимента. Эти культуры будут действовать как перенос 0 (Tx0) для начала эксперимента по эволюции температуры.
   2. Запечатайте трубки дышащей мембраной и поместите каждый набор из семи популяций предков в отдельные термомиксеры. Установите каждый термомиксер на необходимую температуру и 400 об/мин, чтобы начать эволюционный эксперимент.
5. День 5:
   1. Через 48 ч проводят перенос 1 (Tx1) путем инокуляции 1,5 мл подогретой среды BBM⁺ в проколотую пробирку объемом 2 мл с 15 мкл культуры от каждой из культур Tx0 (разведение 1:100). Чтобы ускорить этот шаг, выполните этот шаг с помощью многоканальной пипетки переменной ширины, чтобы выполнить несколько переносов из одного эксперимента в унисон, сократив время, в течение которого культуры находятся вне термомиксера.
   2. Как и раньше, запечатайте трубки, прежде чем поместить их обратно в соответствующие термомиксеры в случайном порядке. Проводите рандомизацию вручную или через рандомайзеры iMetaLab 96 лунок.
6. Измерьте наружный диаметр_{600 нм} Tx0 в пластинчатом спектрофотометре (200 мкл в 96-луночных планшетах; тот же объем BBM⁺ используется в качестве заготовки) для отслеживания роста независимых линий.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Наружный диаметр_{600 нм} следует измерять после переноса в свежую среду для предотвращения загрязнения. Оптическую плотность можно измерить и другими способами, например, с помощью стандартного спектрофотометра. Использование пластинчатого спектрофотометра позволяет одновременно измерять несколько культур, оптимизируя процесс.
7. Повторите шаги 5.5 и 5.6 на дни 7, 9, 11 и т.д., соответствующие Tx2, Tx3, Tx4 и т.д. Поддерживайте постоянную температуру для процедур 75 °C и 65 °C. Для обработки при перепаде температуры снижайте температуру на 1 °C каждый второй перенос (т.е. на Tx2, Tx4, Tx6 и т.д.).
8. Готовьте запасы глицерина (шаг 3.2.3) популяций после каждого^10-го переноса (т.е. Tx10, Tx20 и т.д.), маркируя пробирку идентификатором предковой популяции (например, SA1 для^1-й независимой популяции) и номером переноса (например, Tx10 для^10-го переноса). Используйте эти запасы глицерина позже для оживления популяций, чтобы изучить, как популяции менялись с течением времени, или для возобновления эксперимента, если это необходимо (например, из-за загрязнения или непредвиденных инцидентов, приведших к потере культур).
9. Пусть эксперимент продолжается либо в течение заданного числа переносов, либо до тех пор, пока не пройдет заданное число поколений. При окончательном переносе подготовьте запасы глицерина всех нисходящих линий.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь эксперимент продолжался до тех пор, пока обработка при падении температуры не достигла 65 °C, что и произошло на Tx22. Это соответствует примерно 150 поколениям (рассчитано на основе коэффициента разбавления 100 в 4,6: log₂(100) = 6,64 поколения на перенос). Продолжительность эволюционных экспериментов может быть скорректирована в соответствии с требованиями эксперимента.

6. Анализ роста в постэволюционном эксперименте: предковые и эволюционировавшие линии

ПРИМЕЧАНИЕ: Концептуальная диаграмма, описывающая протокол анализа роста/приспособленности, приведена на рисунке 2.

1. Подготовьте проколотые 2 мл пробирки с 1,5 мл BBM⁺. Подготовьте достаточное количество трубок для выращивания всех нисходящих линий плюс каждой из предковых линий.
2. Оживите предковые популяции и каждую популяцию потомков, сохраненную на шаге 5.9 после окончательного переноса эволюционного эксперимента, используя метод, описанный на этапах 2.2-2.5, но с инкубацией при температуре, которую каждая популяция испытала при последних двух переносах эволюционного эксперимента, т.е. 75 °С для постоянной обработки 75 °С и 65 °С для экспериментов с постоянной температурой 65 °С и падением температуры. Для достижения сопоставимой плотности популяции проводите инкубацию при температуре 75 °C в течение 72 ч и инкубацию при температуре 65 °C в течение 120 ч.
3. Измерьте наружный диаметр_{600 нм} выращенных культур с помощью пластинчатого спектрофотометра.
4. Проведите анализ роста каждой популяции потомков и каждого предкового штамма при обеих температурах (т.е. 75 °C и 65 °C) в трех повторениях. Приготовьте проколотые центрифуги объемом 2 мл с 1,5 мл BBM⁺. Подготовьте шесть пробирок для каждой эволюционировавшей линии и каждой предковой линии. Пометьте пробирки с указанием названия родословной (SA1-7 или предка), температуры роста (75 °C или 65 °C) и идентификатора репликации (1, 2 или 3).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если доступно менее шести термомиксеров, анализ роста может быть воспроизведен в течение нескольких дней на нескольких экспериментальных блоках. В этом случае важно измерить каждую линию и предка в каждом экспериментальном блоке, чтобы можно было оценить и учесть эффекты блокировки статистически.
5. В шесть подготовленных пробирок вводят свежую среду по 15 мкл культуры от каждой потомковой линии и предковой линии.
6. Установите три термомиксера на 75 °C и три термомиксера на 65 °C, назначив каждому термомиксеру идентификатор репликации. Поместите в термомиксер трубки, соответствующие температуре и идентификатору репликации. В каждом термомиксере убедитесь, что родословные и предки расположены случайным образом для контроля гетерогенности.
7. Загерметизируйте каждый комплект из 24 трубок проницаемой мембраной. Инкубировать в течение 48 ч.
8. Перелейте по 200 мкл из каждой культуры в 96-луночный планшет. Измерьте наружный диаметр_{600 нм} с помощью спектрофотометра.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Многоканальный дозатор переменной ширины может использоваться для облегчения переноса между микроцентрифужными пробирками и 96-луночными планшетами.
9. Построение графиков и анализ данных с помощью статистического программного обеспечения (например, R).

7. Полногеномное секвенирование эволюционировавших линий и идентификация мутаций

1. Оживите потомки, хранящиеся на шаге 5.9 в предварительно нагретом BBM⁺ при 75 °C в течение 48-72 ч, путем инокулирования кусочка льда из каждой замороженной популяции в BBM⁺ , как показано в разделе 2, шаги 2.2-2.5. Приготовьте от 1 до 10 мл объема культуры для получения достаточного количества геномной ДНК. Точный требуемый объем зависит от параметра, выбранного для секвенирования на шагах 7.2 или 7.3 (ниже).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Хорошей практикой является также секвенирование штамма, используемого для инициации предковых популяций. Это необходимо для того, чтобы правильно определить, возникли ли какие-либо мутации, обнаруженные в потомках, во время эволюционного эксперимента, а не до.
2. (Вариант 1) Извлечение геномной ДНК и подготовка библиотек секвенирования Illumina для секвенирования Illumina.
   1. Извлекайте и очищайте геномную ДНК с помощью коммерческого набора для экстракции геномной ДНК бактерий.
   2. Убедитесь, что извлеченная геномная ДНК соответствует требованиям поставщика услуг секвенирования по количеству и качеству, используя коммерческие наборы, рекомендованные поставщиком.
   3. Выполните подготовку библиотеки геномной ДНК с помощью коммерческого набора в соответствии с протоколом производителя. Рекомендуется использовать протокол с парным концом со скоростью 250.о. Храните извлеченную геномную ДНК при температуре -20 °C до тех пор, пока образцы не будут готовы к отправке поставщику услуг по секвенированию.
3. (Вариант 2) В качестве альтернативы можно отправить образцы коммерческому поставщику, который выполняет экстракцию ДНК, проверку качества геномной ДНК, подготовку библиотеки Illumina и секвенирование Illumina в качестве комбинированной услуги.
4. Анализируйте секвенированные геномы для выявления мутаций.
   1. Получите файлы FASTQ и, если это еще не было выполнено поставщиком секвенирования, выполните обрезку адаптера с помощью Trimmomatic с отсечкой качества скользящего окна Q15.
   2. Используя обрезанные файлы FASTQ, запустите конвейер breseq (версия 0.38.1) для обнаружения мутаций, сравнивая чтения геномной ДНК с референсной последовательностью для выбранного штамма. Для S. acidocaldarius DSM639 это идентификатор RefSeq NC_007181.

8. (Опционально) Оценка энергопотребления термомиксера по сравнению с потреблением энергии в инкубаторе

1. Чтобы сравнить энергопотребление при использовании инкубатора и термомиксера для роста, измерьте энергопотребление каждого устройства в течение 24 часов с помощью вилки для мониторинга энергии.
2. Используйте две вилки для одновременного измерения энергопотребления обоих устройств. В качестве альтернативы можно измерить потребление энергии в последующие дни.
3. Отключите инкубатор или термомиксер от электрической розетки. Вставьте вилку для мониторинга энергопотребления в розетку и инициализируйте ее в соответствии с инструкциями производителя, включая установку программного обеспечения для мониторинга и управления.
4. Подключите инкубатор или термомиксер к пробке для контроля энергии и дайте ему поработать не менее 2 часов (но в идеале 24 часа или дольше), чтобы получить точную оценку типичного энергопотребления. Записывайте энергопотребление каждого устройства.

Измерения кривой роста
Кривые роста S. acidocaldarius DSM639 показаны на рисунке 3A. Было обнаружено, что рост аналогичен при сравнении инкубации с использованием термомиксеров и в обычных инкубаторах. Параметры средних темпов роста оценивались путем подгонки логистической кривой к каждой реплицированной кривой роста и вычисления средней и стандартной ошибки. Время до среднеэкспоненциальной фазы на термомиксере и инкубаторе составляло 27,2 ч ± 1,1 ч и 31,1 ч ± 1,9 ч соответственно. Расчетное начальное время удвоения для термомиксера и инкубатора при 75 °С составило 4,29 ч ± 0,28 ч и 4,19 ч ± 0,44 ч соответственно, что согласуется с ранее опубликованными значениями24. Связь между log10 (OD600 нм) и log10 (КОЕ) была хорошо охарактеризована линейной моделью (скорректированный R2 = 0,82, F(1,22) = 104, p < 0,00001, наклон = 1,73 ± 0,17, пересечение = 9,73 ± 0,14). Таким образом, соотношение между наружным диаметром600 нм и КОЕ определяется формулой КОЕ = 10(1,73 × log10 (наружный диаметр 600 нм) + 9,73). Таким образом, внешний диаметр600 нм 0,3 соответствует примерно 6,7 ×10 8 КОЕ/мл (рис. 3B).

Эксперимент по эволюции температуры
Три температурных условия: постоянная 75 °C, постоянная 65 °C и падение температуры (75-65 °C, снижение на 1 °C каждые два переноса) были инициированы с использованием семи независимых линий, полученных от S. acidocaldarius DSM639. Измерения наружного диаметра600 нм проводились после каждого переноса в течение 45 дней эксперимента (примерно 150 поколений при 75 °C) и показаны на рисунке 4. Измерения наружного диаметра600 нм, проводимые в течение нескольких дней, по своей природе являются зашумленными, так как они могут быть подвержены незначительным различиям, например, в периоде роста, температуре и т. д. Тем не менее, измерения, проведенные в течение нескольких дней, все еще могут быть полезны для оценки жизнеспособности популяции, а также дать представление о том, улучшается ли физическая форма с течением времени. К концу эксперимента линии от постоянных условий 75 °C увеличились на наружном диаметре600 нм с начального диапазона 0,125-0,3 до диапазона 0,248-0,471. Это говорит о том, что физическая форма улучшилась благодаря этому лечению. Напротив, линии от обработки при постоянной температуре 65 °C показали снижение наружного диаметра600 нм с начального диапазона 0,018-0,087 до 0,008-0,04 в конечной точке времени. Это говорит о том, что популяции не смогли адаптироваться к постоянной температуре 65 °C, хотя тот факт, что жизнеспособные организмы могли быть восстановлены, показывает, что популяции не были вымыты в результате последовательных разведений, что предполагает некоторую степень адаптации. Наконец, популяции при обработке с понижением температуры увеличивались с начального диапазона наружного диаметра600 нм 0,099-0,279 до 0,3-0,39 при Tx6 (что соответствует 288 ч и 73 °C при этой обработке), с последующим устойчивым снижением до диапазона 0,003-0,024 в конечной временной точке.

Анализы роста/приспособленности
Анализы приспособленности были проведены для каждой популяции потомков после эволюционных экспериментов. Наружный диаметр600 нм был проанализирован после 48-часового роста для всех семи независимых линий, после чего были подогнаны линейные модели в R для каждой температуры анализа, с «средой отбора» в качестве основного эффекта и «репликацией/термомиксером» в качестве блочного эффекта. Рост предкового штамма использовался в качестве референтного уровня для контрастов лечения. Данные представлены на рисунке 5.

При анализе при 75 °C наблюдалось в среднем значительное увеличение приспособленности по сравнению с предковой линией от постоянных 75 °C (t-критерий: t210=3,64, p=0,0003) и постоянных 65 °C (t-критерий: t210=2,8, p=0,005), но не от обработки с падением температуры (t-критерий: t210=−0,87, p=0,38). При анализе при температуре 65 °C, в среднем, линии от всех видов лечения показали повышение приспособленности (постоянные линии при 75 °C; t-критерий: t210=4,68, p<0,0001, постоянные линии 65 °C; t-критерий: t210,=4,24, p<0,0001, линии падения температуры; t-критерий: t210=3,15, p=0,002). Тем не менее, для обеих температур анализа наблюдались значительные различия между линиями в их приспособленности (Рисунок 5). Некоторые линии существенно не отличались от предковой линии или имели сниженную приспособленность; Это было особенно очевидно для линий от обработки перепадом температуры.

Стоит отметить, что соотношение между наружным диаметром600 нм и КОЕ/мл могло измениться в ходе эволюционного эксперимента. Это можно оценить, определив параметры роста для эволюционировавших линий (следующие шаги 3.1-3.10).

Результаты секвенирования всего генома
Анализ всего генома проводили с использованием breseq (версия 0.38.1)25 на семи линиях из состояния постоянной 75 °C с использованием референсного генома S. acidocaldarius DSM639 (присоединение RefSeq NC_007181.1). Было выявлено множество мутаций, включающих вставки, делеции и однонуклеотидный полиморфизм (SNP) в геномах всех потомков (табл. 2). Множественные вставки и несинонимичные мутации были в генах, кодирующих белки, а также в межгенных областях, которые могут влиять на экспрессию генов из-за сдвигов рамки в промоторных областях генов. Некоторые из мутаций были согласованы в нескольких нисходящих линиях в генах, участвующих в различных функциях, таких как биосинтез клеточной стенки, транскрипция, метаболизм, клеточный транспорт и каталитическая активность (Таблица 2). Среди этих мутаций была большая делеция 54 667 пар оснований в пяти из семи линий; Это было подтверждено отсутствующим графиком доказательств охвата для каждой популяции (частота от 93,2% до 100%). Удаленный участок приравнивается к потере 53 генов; Роль этих генов в адаптации будет изучена в будущих исследованиях. Были отмечены некоторые различия между используемым изолятом DSM639 и опубликованной референсной последовательностью (см. дополнительную таблицу 1).

Энергопотребление встряхивающего инкубатора по сравнению с термомиксером
Энергопотребление встряхивающего инкубатора сравнивалось с термомиксером с использованием коммерчески доступной умной розетки для мониторинга энергопотребления в диапазоне распространенных температур инкубации и используемой здесь температуре 75 °C. При температуре 75 °C термомиксер потреблял примерно 1/40часть энергии традиционного встряхивающего инкубатора (рис. 6), что позволяет предположить, что термомиксеры являются потенциальным средством снижения углеродного следа, связанного с экспериментальной эволюцией.

Рисунок 1: Блок-схема, иллюстрирующая протокол эволюционного эксперимента при трех температурных обработках. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Блок-схема, иллюстрирующая этапы протокола анализа роста/приспособленности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Определение ключевых параметров роста и сравнение инкубационных устройств для S. acidocaldarius DSM639. Три репликационные культуры были выращены при температуре 75 °C в 7 отдельных пробирках. С помощью разрушающего отбора проб были измерены (А) наружный диаметр600 нм (среднее значение ± стандартной погрешности n=3 технических повторений; некоторые погрешности меньше, чем при нанесении символов); кривые представляют собой подогнанные логистические модели роста и (B) колониеобразующие единицы (КОЕ); линии представляют собой подогнанные логарифмические модели линейной регрессии). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4: Репрезентативные результаты для оптических плотностей (OD600 нм), полученные в ходе эволюционных экспериментов. Оптические плотности независимых линий измерялись в ходе эволюционных экспериментов при трех температурных обработках (постоянная 65 °C, постоянная 75 °C, падение 75 °C-65 °C), проведенных в течение примерно 150 поколений. Кривые изображают сглаживание Лёсса с течением времени для каждой независимой линии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 5: Репрезентативные результаты для анализов роста. Ростовые анализы для независимых линий, полученных от S. acidocaldarius DSM639 после экспериментов по эволюции температуры (постоянная 65 °C, постоянная 75 °C, падение 75 °C-65 °C) по сравнению со штаммом-предком. Для всех линий рост был проверен при 65 °C и 75 °C. Цветные точки показывают среднюю ± стандартную ошибку технических репликатов (показаны серым цветом, n = 12 для предка и n = 3 для каждой эволюционировавшей линии). Серой полосой обозначена средняя ± стандартная погрешность приспособленности предков. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 6: Энергопотребление традиционных инкубаторов по сравнению с термомиксерами. Потребление энергии регистрировалось с помощью коммерчески доступной умной розетки для мониторинга энергопотребления в течение 2 часов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1: Рецепты сред и исходные растворы, необходимые для выращивания S. acidocaldarius. Все среды и исходные растворы должны быть изготовлены с помощью двойной дистилляции H2O (ddH2O) и затем стерилизованы либо автоклавированием, либо стерилизацией фильтра через фильтр 0,22 мкм, как указано. Пожалуйста, обратитесь к разделу 1 протокола для получения подробного описания того, как готовить все среды и стоковые растворы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 2: Репрезентативные результаты полногеномного секвенирования потомков . Мутации, обнаруженные в потомках потомков S. acidocaldarius DSM639 от постоянной обработки 75 °C. Мутации указывают на изменения относительно прямого предка линии, который обладает несколькими изменениями относительно референсной последовательности для S. acidocaldarius DSM639 (RefSeq NC_007181; мутации у предка показаны в дополнительной таблице 1). n обозначает количество линий, в которых была обнаружена мутация. → ген на «системе прямого считывания»; ← ген на «обратной системе считывания». †Эти изменения связаны со сдвигом рамки считывания (A)10→11, присутствующим в изоляте S. acidocaldarius DSM639 (дополнительная таблица 1). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Дополнительная таблица 1: Мутации, присутствующие в изоляте S. acidocaldarius DSM639 относительно референсной последовательности (присоединение RefSeq NC_007181.1). → ген на «системе прямого считывания»; ← ген на «обратной системе считывания». ‡SACI_RS04020 аннотирован как псевдоген в NC_007181.1, но наблюдаемая здесь мутация сдвига рамки считывания Δ1 bp предположительно восстанавливает его функцию, поскольку с мутацией он кодирует белок со 100% идентичностью к гену rgy обратной гиразы (присоединение RefSeq WP_176586667.1). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Авторы не заявляют о конфликте интересов.