Method Article

Сравнительное исследование матриц базальной мембраны для поддержания стволовых клеток человека и генерации кишечных органоидов

DOI:

10.3791/66277

⸱

March 15th, 2024

 ,  ,  , 
1Center for Pharmacometrics & Systems Pharmacology, Department of Pharmaceutics, University of Florida, 2TheWell Bioscience, Inc

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Органоиды стали ценными инструментами для моделирования заболеваний. Внеклеточный матрикс (ВКМ) управляет судьбой клетки во время генерации органоидов, и использование системы, напоминающей нативную ткань, может повысить точность модели. В этом исследовании сравнивается генерация индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, полученных из кишечных органоидов человека, в ВКМ животного происхождения и гидрогелях, не содержащих ксено.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Внеклеточный матрикс (ВКМ) играет решающую роль в поведении и развитии клеток. Органоиды, полученные из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (ИПСК), находятся в центре внимания многих областей исследований. Тем не менее, отсутствие физиологических сигналов в материалах классических клеточных культур препятствует эффективной дифференцировке iPSC. Включение коммерчески доступной ЭКМ в культуру стволовых клеток дает физические и химические сигналы, полезные для поддержания клеток. Коммерчески доступные продукты базальной мембраны животного происхождения состоят из белков ВКМ и факторов роста, которые поддерживают поддержание клеток. Поскольку ВКМ обладает тканеспецифичными свойствами, которые могут модулировать судьбу клеток, матрицы, свободные от ксеносов, используются для трансляции в клинические исследования. В то время как коммерчески доступные матрицы широко используются в работе с гиперПСК и органоидами, эквивалентность этих матриц еще не была оценена. Здесь было проведено сравнительное исследование поддержания hiPSC и генерации кишечных органоидов (hIO) человека в четырех различных матрицах: Matrigel (Matrix 1-AB), Geltrex (Matrix 2-AB), Cultrex (Matrix 3-AB) и VitroGel (Matrix 4-XF). Несмотря на то, что колонии не имели идеально круглой формы, спонтанная дифференцировка была минимальной, при этом более 85% клеток экспрессировали маркер стволовых клеток SSEA-4. Матрица 4-XF привела к образованию 3D круглых глыб. Кроме того, увеличение концентрации добавок и факторов роста в средах, используемых для изготовления раствора гидрогеля Matrix 4-XF, улучшило экспрессию SSEA-4 в 1,3 раза. Дифференциация ИПСК, поддерживаемого Matrix 2-AB, привела к меньшему количеству высвобождений сфероидов на средней/задней стадии кишечника по сравнению с другими базальными мембранами животного происхождения. По сравнению с другими, матрица органоидов, свободных от ксеносов (матрица 4-O3), приводит к увеличению размера и повышению зрелости гидрогелей, что позволяет предположить, что физические свойства гидрогелей, не содержащих ксено, могут быть использованы для оптимизации генерации органоидов. В целом, полученные результаты свидетельствуют о том, что вариации в составе различных матриц влияют на стадии дифференцировки IO. Это исследование повышает осведомленность о различиях в коммерчески доступных матрицах и предоставляет руководство по оптимизации матриц во время работы с iPSC и IO.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Внеклеточный матрикс (ВКМ) является динамичным и многофункциональным компонентом тканей, который играет центральную роль в регулировании поведения и развития клеток. Будучи сложной сетью, она обеспечивает структурную поддержку, клеточные адгезивные лиганды1 и хранение факторов роста и цитокинов, которые регулируют клеточную сигнализацию. Например, во время заживления ран ВКМ служит каркасом для мигрирующих клеток и резервуаром факторов роста, участвующих в восстановлении тканей2. Аналогичным образом, нарушение регуляции в ВКМ может привести к увеличению тяжести различных заболеваний, таких как фиброз и рак 3,4. Во время эмбрионального развития ВКМ руководит морфогенезом тканей. Например, в развитии сердца компоненты ЭКМ играют роль в создании правильной архитектуры и функционирования сердечной ткани5. Более десяти лет исследований показали, что жесткость микроокружениясама по себе может контролировать спецификацию линии стволовых клеток. Поэтому неудивительно, что во время дифференцировки клеток in vitro ВКМ влияет на судьбу стволовых клеток, предоставляя сигналы для дифференцировки.

Органоиды могут быть получены из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК). Для успешной генерации органоидов необходимо начать с правильно охарактеризованной линии iPSC. Тем не менее, отсутствие физиологических сигналов в материалах классических клеточных культур препятствует эффективной дифференцировке иПСК и генерации органоидов. Кроме того, недавние исследования подчеркивают важность состава внеклеточного матрикса (ВКМ), взаимодействий между клетками и ВКМ8, а также механических и геометрических сигналов 9,10,11 в контексте органоидной экспансии и дифференцировки12. Развитие технологии органоидов за счет улучшения воспроизводимости будет включать в себя включение физических и химических сигналов, специфичных для тканей.

Органоиды нацелены на повторение нативной ткани в физиологически схожем микроокружении. Выбор системы ВКМ, которая точно имитирует ВКМ нативной ткани, имеет решающее значение для достижения физиологической значимости в отношении поведения, функции и реакции клеток настимулы. Выбор компонентов ВКМ может влиять на дифференцировку стволовых клеток в определенные типы клеток в пределах органоида. Различные белки ECM и их комбинации могут давать сигналы, определяющие судьбу клетки14. Например, исследования показали, что использование специфических компонентов ВКМ может способствовать дифференцировке кишечных стволовых клеток в зрелые типы кишечных клеток, что приводит к образованию физиологически значимых кишечных органоидов. В то время как органоиды являются ценным инструментом при моделировании заболеваний и тестировании лекарств, выбор подходящей системы ECM имеет решающее значение для этого приложения. Подходящая система ЭКМ может повысить точность моделирования заболевания за счет создания микроокружения, напоминающего пораженную ткань16. Кроме того, тканеспецифическая ВКМ может помочь в создании органоидов, которые лучше повторяют фенотипы, связанные с заболеванием, и реакцию на лекарства17. Оптимизация системы ECM, используемой для дифференцировки органоидов, имеет решающее значение для достижения желаемых результатов дифференцировки.

Коммерчески доступные системы базальных мембран, полученные из источников ECM животного происхождения (например, Matrigel, Cultrex) и гидрогеля, не содержащего ксеноса (например, VitroGel), широко используются в исследованиях iPSC и органоидов. Компании, которые коммерциализируют их, и исследователи, которые их используют, на протяжении многих лет излагают множество инструкций для своих конкретных продуктов и приложений. Многие из этих инструкций послужили руководством для создания этого протокола. Кроме того, преимущества и недостатки, связанные с их внутренними свойствами, были индивидуально отмечены многими 18,19,20,21. Тем не менее, не существует систематического рабочего процесса, который бы направлял выбор оптимальных систем для работы с iPSC и органоидами. Здесь предусмотрен рабочий процесс для систематической оценки эквивалентности систем ECM из различных источников для работы iPSC и органоидов. Это сравнительное исследование поддержания двух различных линий iPSC человека (hiPSC) и генерации кишечных органоидов человека (hIO) в четырех различных матрицах: Matrigel (Матрица 1-AB), Geltrex (Матрица 2-AB), Cultrex (Матрица 3-AB) и VitroGel (Матрица 4-XF). Для культивирования органоидов использовали четыре версии бесксено-свободной матрицы VitroGel, которые ранее были оптимизированы для культивирования органоидов: ORGANOID 1 (Матрица 4-O1), ORGANOID 2 (Матрица 4-O2), ORGANOID 3 (Матрица 4-O3), ORGANOID 4 (Матрица 4-O4). Также были использованы матрицы животного происхождения, оптимизированные для органоидов: Matrigel High Concentration (Matrix 1-ABO) и Cultrex Type 2 (Matrix 3-ABO). Использовали коммерчески доступные среды для культивирования стволовых клеток (mTeSR Plus) и набор для дифференцировки органоидов (STEMdiff intestinal organoid kit). Этот протокол сочетает в себе индивидуальные инструкции от производителей продуктов с лабораторным опытом, чтобы направить читателя к успешной оптимизации ECM для их конкретной работы с iPSC и органоидами. В целом, этот протокол и репрезентативные результаты подчеркивают важность выбора оптимального микроокружения для работы стволовых клеток и дифференцировки органоидов.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Обслуживание hiPSC

ВНИМАНИЕ: Все работы выполняются в шкафу биобезопасности (BSC) в соответствии со стандартными асептическими методами. Необходимо соблюдать стандарты безопасности OSHA для лабораторий, включая надлежащее использование средств индивидуальной защиты, таких как лабораторные халаты, перчатки и очки.

  1. Приготовление матриц, аликвот и клеточных культуральных сред
    1. Для коммерчески доступных базальных мембран животного происхождения (БМ; Матрица 1-АВ, Матрица 2-АВ, Матрица 3-АВ), подготавливают аликвоты рабочих объемов в соответствии с рекомендацией производителя, обобщенной в таблице 1 , и хранят их при температуре -20 °С или -80 °С для длительного хранения. Не допускайте образования пузырьков. Если образуются пузырьки, перед хранением центрифугируйте образцы при температуре 4 °C, при <200 x g, в течение ~1-2 минут, чтобы пузырь вышел на поверхность.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Изготовление одноразовых аликвот помогает избежать повторяющихся циклов замораживания-оттаивания, которые нарушают архитектуру ECM. Поскольку концентрация BM варьируется в зависимости от количества партии, обязательно следуйте рекомендациям производителя по приготовлению одноразовых аликвот и растворов для покрытий. Высококонцентрированные БМ вязкие и их трудно пипетировать; используйте холодные наконечники, которые ранее хранились при температуре -20 °C.
    2. Питательную среду для стволовых клеток готовят в соответствии с рекомендациями производителя. Для приготовления специфической коммерчески доступной полной среды, используемой в данном протоколе, добавьте 100 мл 5-кратного коктейля к 400 мл базальной среды. Затем тщательно перемешайте эту среду и распределите по 40 мл объемов, храните при температуре 20 °C. Перед применением разморозьте каждую аликвоту готового носителя, немедленно используйте аликвотированную готовую среду или храните при температуре 2–8 °C до 2 недель. Не замораживайте его повторно.
    3. Приготовьте аликвоты полной среды стволовых клеток, содержащей в 3 раза большую концентрацию коктейля добавки, для приготовления гидрогеля Matrix 4-XE, т.е. разбавьте добавку в 5 раз до 3 раз.
  2. Покрытие пластика тканевых культур BM животного происхождения (Матрица 1-3AB)
    1. Перед началом работы подготовьте следующее: всегда держите матрицы во льду при размораживании и обработке, чтобы предотвратить их загустение. Используйте холодные среды для приготовления разведенных матриц. Подготовьте достаточное количество реплицируемых лунок для каждого условия для анализа клеток до начала и на каждой стадии процесса дифференцировки hiPSC и генерации органоидов hIO.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь для этого исследования использовались 24-луночные планшеты. В таблице 2 приведены рекомендуемые объемы покрытия для пластин других размеров.
    2. Для каждого типа матрицы приготовьте 25 мл холодного промежутка DMEM/F-12, содержащего 15 мМ HEPES, в конической пробирке объемом 50 мл. Держите их на льду.
    3. Добавьте размороженные матрицы в соответствующие холодные предварительные DMEM/F-12 и хорошо перемешайте. Держите носитель холодным во время процесса смешивания. Визуально проверьте однородное перемешивание, убедившись, что нет комочков.
    4. С помощью разбавленных растворов матриц сразу же покройте каждую выбранную для использования лунку (250 μл/лунка при использовании 24-луночных планшетов).
    5. Аккуратно наклоните посуду для культуры, чтобы раствор для покрытия равномерно распределился по поверхности. Перед использованием инкубировать при комнатной температуре (15 - 25 °C) не менее 1 часа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если пластина не будет использована сразу, ее можно хранить при температуре от 2 до 8 °C до 1 недели после нанесения покрытия, но она должна быть закрыта прозрачной пленкой для предотвращения испарения. При использовании хранящихся тарелок дайте им нагреться до комнатной температуры (15 - 25 °C) в течение 30 минут, прежде чем переходить к следующему этапу.
    6. Аккуратно удалите излишки раствора с помощью серологической пипетки или методом аспирации. Следите за тем, чтобы поверхность с покрытием не была поцарапана.
    7. Немедленно добавьте теплую полную среду для стволовых клеток (50% от общего объема, необходимого для конкретной лунки, например, 250 мкл/лунка при использовании 24-луночного планшета).
  3. Покрытие пластика тканевых культур гидрогелем Matrix 4-XE
    1. Перед началом работы подготовьте следующее: достаньте гидрогель Matrix 4-XE из холодильника и дайте ему нагреться до комнатной температуры (25 °C). Подготовьте достаточное количество реплицируемых лунок для каждого условия для анализа клеток до начала и на каждой стадии процесса дифференцировки hiPSC и генерации органоидов hIO.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь для этого исследования использовались 24-луночные планшеты. Рекомендуемые объемы покрытия для пластин других размеров см. в таблице 3 .
    2. Приготовьте полную питательную среду для стволовых клеток, содержащую концентрацию фактора роста в 3 раза по сравнению со стандартной формулой для культуры стволовых клеток (среда для стволовых клеток в 3 раза).
    3. Смешайте гидрогель Matrix 4-XE и среду для 3x стволовых клеток в соотношении 2:1 v/v и аккуратно пипеткой вверх и вниз 5x-10x для тщательного перемешивания.
    4. Переложите гидрогелевую смесь на лунную тарелку и осторожно наклоните посуду для культуры, чтобы смесь равномерно распределилась по поверхности. Используйте 250 μл/лунку при использовании 24-луночного планшета. Рекомендуемые объемы приведены в таблице 3 .
    5. Подождите 10-15 минут при комнатной температуре для образования мягкого геля. В процессе формирования гидрогеля не нарушайте работу гидрогеля, наклоняя или встряхивая пластину.
  4. Пассирование и посев комков без ферментов hiPSC
    1. Перед началом работы подготовьте следующее: не менее чем за 1 час до выгрузки обмажьте нужную пластиковую посуду матрицами. Аликвоту достаточно полноценных сред стволовых клеток и подогреть до комнатной температуры (15 - 25 °C). Избегайте многократных циклов нагрева для всей среды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги описывают прохождение уже созданной и на >90% конфлюентной культуры ИПСК на 6-луночный планшет и посев их в 24-луночные планшеты для дифференцировки кишечных органоидов.
    2. Промойте клетки 1 мл D-PBS (без Ca++ и Mg++) и аспирируйте. Добавьте 1 мл реагента для отбора плюрипотентных стволовых клеток человека, не содержащего ферментов, тщательно перемешайте для равномерного распределения и аспирируйте в течение 1 минуты. Колонии нужно только подвергать воздействию тонкой пленки жидкости.
    3. Инкубируйте при 37 °C до тех пор, пока колонии не начнут выглядеть менее уплотненными, что займет ~ 3-8 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальное время инкубации может варьироваться в зависимости от используемой клеточной линии. Оптимальное время инкубации должно быть определено при первом прохождении каждой клеточной линии с реагентом селекции плюрипотентных стволовых клеток человека, не содержащим ферментов.
    4. Добавьте 1 мл полной среды для стволовых клеток. Отделите колонии, осторожно постучав сильно по боковой стороне пластины. Обязательно держите тарелку другой рукой.
    5. С помощью пипетки объемом 1 мл или больше перенесите суспензию клеточных комков в коническую пробирку объемом 15 мл. Оцените размер скоплений с помощью светлопольного микроскопа и убедитесь, что размер скопления клеток составляет 50-200 мкм; Если они больше, аккуратно встряхните коническую трубку, чтобы разбить их.
    6. Нарисуйте сетку x-y на дне каждой лунки 96-луночной пластины с плоским дном, которая будет использоваться для подсчета комков, и добавьте 50 μL D-PBS в каждую из лунок. Рекомендуется усреднять куртины, отсчитываемые от 3 лунок.
    7. Обеспечьте равномерное распределение комков клеток, осторожно встряхивая пробирку, а затем перелейте 5 мкл суспензии комков в каждую из лунок 96-луночного планшета с плоским дном.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не рекомендуется использовать автоматический счетчик ячеек для подсчета скоплений. Рекомендуется ручной подсчет.
    8. Подсчитайте общее количество комков в каждой лунке диаметром 50 - 200 мкм. Если большинство скоплений клеток имеют диаметр > 200 мкм (см. рисунок 1), повторите шаги 1.4.5 - 1.4.7.
    9. Рассчитайте объем (в л) суспензии комков, необходимый для посева 6 000 комков, следующим образом:
      figure-protocol-1
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальная плотность посева должна быть оптимизирована для каждой клеточной линии. Чтобы определить оптимальную плотность посева, рекомендуется провести первоначальный посев в диапазоне плотностей комков (например, 4 000, 5 000 и 6 000 комков на лунку) и проверить через 24-48 ч после посева, достигнуто ли слияние 85%-90%.
    10. В качестве контроля качества выделяют образец клеток для проточной цитометрии, исследования маркеров стволовых клеток. Список общих маркеров приведен в таблице 4 .
    11. Разделите необходимый объем суспензии комков iPSC на затравку на лунки, покрытые различными ECM, на отдельные пробирки по 15 мл.
    12. Центрифугируйте пробирку, содержащую комковатый раствор iPSC, при концентрации 200 x g в течение 5 мин для удаления среды, содержащей реагент отбора плюрипотентных стволовых клеток человека, не содержащий ферментов. В ожидании центрифугирования добавьте в каждую лунку 50% от желаемого объема на лунку, если это еще не было сделано.
  5. Культура iPSC в планшетах, содержащих матрицы животного происхождения
    1. Аккуратно ресуспендируйте скопления iPSCs в 50% расчетном объеме полной среды стволовых клеток для получения желаемой плотности и поместите смесь клеточных агрегатов на лунки с покрытием, содержащие 50% рассчитанной полной среды стволовых клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Добавление ингибитора ROCK-1 может быть необходимо для некоторых клеточных линий или когда размер скоплений составляет 50 мкм или меньше. Рекомендуется добавить <10 мкм, чтобы избежать ранней гаструляции.
    2. Осторожно добавьте среду с ячейками поверх матриц, 250 μл/лунку, если используется 24-луночный планшет. Рекомендуемый объем клеточной среды для луночных планшетов другого размера см. в таблице 2.
    3. Наклоните пластину несколькими короткими движениями вперед-назад и из стороны в сторону, чтобы равномерно распределить комки клеток.
      ВНИМАНИЕ: Неравномерное распределение агрегатов приводит к повышенной спонтанной дифференцировке ИПСК человека. Круговое распределение суспензии комков приводит к скоплению комков на границе скважин и снижению плотности в центре.
    4. Инкубируйте планшет при температуре 37 °C и выполняйте смену среды с использованием полной среды стволовых клеток ежедневно или через день. При выполнении смены среды визуально оценивайте культуры, чтобы контролировать рост и определить, требуют ли клетки времени для прохождения или готовы к дифференцировке. Чтобы пропустить два последовательных дня кормления, добавьте в 2 раза больше объема среды, чем необходимо для одного дня.
  6. Культура iPSC в планшетах, содержащих Matrix 4-XE
    1. Мягко ресуспендируйте иПСК в общий расчетный объем в 3 раза больше полной среды стволовых клеток, чтобы получить желаемую плотность.
    2. Осторожно добавьте среду с ячейками поверх гидрогеля 250 μл/лунку, если вы используете 24-луночный планшет. Рекомендуемый объем клеточной среды для луночных планшетов другого размера см. в таблице 3.
      ВНИМАНИЕ: Гидрогель будет набухать и занимать больший объем, чем свежеприготовленный. Колонии иПСК будут частично внедрены в гидрогель в нижней части пластины, поэтому рекомендуется менять 50-80% верхней среды, не нарушая гидрогель.
    3. Перемещайте пластину несколькими быстрыми, короткими движениями вперед-назад и из стороны в сторону, чтобы равномерно распределить клеточные комки.
    4. Поместите планшет в инкубатор с температурой 37 °C и влажностью 5%CO2 и 95%. Измените клеточную среду с помощью полной среды для стволовых клеток. Выполняйте смену среды ежедневно или через день; Для последнего добавьте в 2 раза больше объема носителя.
    5. Визуально осматривайте культуры, чтобы отслеживать их рост по мере того, как они достигают стадии, подходящей для дифференциации.

figure-protocol-2
Рисунок 1: Оптимальный размер комка. Изображения скоплений клеточной линии iPSC SCTi003A, показывающие пример оптимального размера скопления. Масштабная линейка = 200 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

2. Дифференцировка ИПСК и генерация кишечных органоидов

ВНИМАНИЕ: Все работы выполняются в шкафу биобезопасности (BSC) в соответствии со стандартными асептическими методами. Необходимо соблюдать стандарты безопасности OSHA для лабораторий, включая надлежащее использование средств индивидуальной защиты, таких как лабораторные халаты, перчатки и очки.

  1. Перед началом работы подготовьте следующие материалы: подготовьте аликвоты дифференцировочной среды, необходимой для каждой стадии. После размораживания аликвот используйте их сразу. Не замораживайте повторно. В таблице 5 приведено общее руководство по каждому типу и объему среды, необходимой для 24-луночного планшета.
    Примечание: Оптимальное время на каждой стадии дифференцировки может варьироваться в зависимости от клеточной линии. Для повышения эффективности дифференцировки рекомендуется проверять экспрессию клеточного маркера каждой стадии. Периодическая оценка экспрессии генов в культурах iPSCS не была включена в данное исследование, поскольку мы использовали партии, сертифицированные поставщиком, на низких проходах, но она рекомендуется в качестве этапа контроля качества для новых/еще не квалифицированных линий iPSC на последующих этапах дифференцировки.
  2. Стадия 1: Дефинитивная энтодерма (ДЭ)
    1. Чтобы оценить готовность к началу дифференциации, проверьте соответствие следующим критериям.
      1. С помощью микроскопа оцените слияние колоний стволовых клеток и степень спонтанной дифференцировки в культуре. Не стоит полагаться только на морфологическую оценку. Оптимальное слияние должно составлять от 85% до 90% (выше ~105 клеток/см2), а минимальная наблюдаемая спонтанная дифференцировка должна составлять <5% дифференцировки.
      2. Соберите клетки из жертвенной лунки для проточной цитометрии, характеризующей маркеры hiPSC, прежде чем приступать к следующему этапу. Для определения характеристик репрезентативной проточной цитометрии была использована стратегия прямого и бокового смещения. Если клетки соответствуют оптимальным критериям, приступают к дифференцировке. Критерием прохождения клеток является экспрессия >85% в идеале 3 маркеров (табл. 4), особенно в случае новых/еще не квалифицированных линий иПСК в лаборатории.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Культуры iPSC, выращенные на разных матрицах, подвергаются одному и тому же общему процессу, с выращиванием iPSC только на Matrix 4-XE, требуя более щадящей смены среды, чтобы не нарушить полувнедренные клетки. Ожидается значительная гибель клеток во время индукции дефинитивной энтодермы, так как клетки особенно чувствительны на этой стадии. Соблюдайте осторожность при смене среды, стремясь свести к минимуму продолжительность воздействия клеток за пределами инкубационной среды при температуре 37 °C.
    2. Начните дифференцировку клеточных колоний, как описано ниже.
      1. День 0: Прогрейте аликвоту среды DE до 37 °C. Чтобы избежать денатурации сред в циклах нагревания-охлаждения, убедитесь, что прогрев требуется только в объеме, необходимом для дня 0 (0,7 мл/лунка).
      2. Отсасывайте среду из ИПСК Осторожно добавьте 0,7 мл DE Medium на лунку вниз по стенке лунки. Избегайте резкого пипетирования, которое может отсоединить или повредить колонии. Инкубируйте планшет при температуре 37 °C с 5%CO2 и влажностью 95% в течение 24 часов.
      3. День 1: Нагрейте аликвоту среды ДЭ, содержащую только объем, необходимый для Дня 1 (0,5 мл/лунку) до 37 °С. Отсадите среду ДЭ из клеток и осторожно добавьте 0,5 мл среды ДЭ на лунку вниз по стенке лунки. Инкубировать при 37 °C с 5%CO2 и влажностью 95% в течение 24 часов.
      4. День 3: Клетки готовы к анализу на окончательное формирование энтодермы. Рекомендуемые маркеры приведены в таблице 4 . Прежде чем приступить к следующему этапу, пожертвуйте лунку для проведения проточной цитометрии, характеризующей специфические маркеры, связанные с ДЭ. Для определения характеристик репрезентативной проточной цитометрии была использована стратегия прямого и бокового смещения. Рекомендуется проверять экспрессию более 1 маркера, особенно в случае новых/еще не квалифицированных линий iPSC в лаборатории.
  3. Стадия 2: Средняя кишка / задняя кишка (MH)
    1. День 3: Прогрейте только необходимый объем среды MH на 3-й день (0,5 мл/лунку) до 15 - 25 °C. Асасируйте среду ДЭ из клеток и замените на 0,5 мл среды MH. Инкубировать при 37 °C с 5%CO2 и влажностью 95% в течение 24 часов.
    2. Дни 4 - 9: Перед ежедневными изменениями среды используйте микроскоп с 2-кратным или 4-кратным увеличением для оценки образования сфероидов путем проверки видимых 3D-структур (может произойти с 4-го дня); свободно плавающие сфероиды (могут возникать с 5-го дня).
    3. Как только сфероиды начнут отделяться, используйте пипеттор объемом 1 мл, чтобы аккуратно перенести среду из клеток в стерильную коническую пробирку объемом 15 мл, чтобы оценить количество сфероидов, отделившихся от клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте любых поперечных сил, которые могут отделить 3D-конструкции от монослоя; Когда все будет готово, сфероиды отсоединятся самостоятельно.
    4. Если отделяется менее 50 сфероидов, центрифугируйте при 200 x g в течение 5 мин, удаляйте старую среду и повторно суспендируйте сфероиды на 0,5 мл/лунку среды и перекачивайте в соответствующую лунку до тех пор, пока не созреет достаточное количество сфероидов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжительность воздействия среды средней и задней кишки играет решающую роль в определении региональной идентичности развивающихся органоидов тонкого кишечника, таких как двенадцатиперстная кишка (более короткая экспозиция) или подвздошная кишка (более длительная экспозиция). Чтобы получить более однородные культуры с одинаковой идентичностью, стремитесь собирать сфероиды, подвергшиеся воздействию среды средней и задней кишки одновременно.
    5. Повторяйте шаг 2.3.3 до тех пор, пока не будет отделено достаточное количество сфероидов для встраивания и начала культивирования органоидов кишечника человека (hIO).
    6. Прежде чем приступить к следующему этапу, отделите образец сфероидов и выполните проточную цитометрическую характеристику специфических маркеров, связанных со средней кишкой/задней кишкой (МН). Для определения характеристик репрезентативной проточной цитометрии была использована стратегия прямого и бокового смещения. Список часто используемых маркеров приведен в таблице 4 . Рекомендуется проверять экспрессию более 1 маркера, особенно в случае новых/еще не квалифицированных линий iPSC в лаборатории.
  4. Этап 3: Встраивание сфероида
    1. Перед началом процедуры подготовьте следующее.
      1. Разморозьте аликвоты Матрицы 1-НПА и Матрицы 3-НПА на льду. Учитывайте количество собранных сфероидов, чтобы определить общее количество необходимой матрицы, если потребуется 30-40 μл матрицы на купол.
      2. Приготовьте 25 мл холодного Advance DMEM/F-12, содержащего 15 мМ HEPES. Высококонцентрированные ЭКМ вязкие и их трудно пипетировать. Поместите коробку со стерильными наконечниками для пипеток объемом 100 л при температуре -20 °C для приготовления холодных наконечников, которые могут помочь процессу. Приготовьте аликвоты кишечной органоидной питательной среды (OGM), для которой требуется 4 кормления (0,5 мл/лунка на корм). Подготовка приведена в таблице 5 .
      3. Разморозьте аликвоту добавки OGM на льду. После размораживания аликвот используйте их сразу. Не замораживайте повторно. Хранить полный OGM при температуре 2-8 °C до 2 недель.
      4. Приготовьте OGM, содержащий в 3 раза больше добавки по сравнению со стандартной формулой для (3x OGM). Достаньте Matrix 4-XFO1 из холодильника и дайте им нагреться до комнатной температуры (25 °C).
    2. Для системы животного происхождения выполните описанные ниже действия.
      1. Поместите в инкубатор стерильную 24-луночную тарелку для культивирования тканей, чтобы она нагрелась до 37 °C во время подготовки сфероидов и матриц. Дайте собранным сфероидам осесть на дно конической пробирки объемом 15 мл. Осторожно аспирируйте и выбросьте надосадочную жидкость.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы сделать более точное сравнение влияния матриц, убедитесь, что сфероиды, собранные из ИПСК, дифференцированы на каждой матрице в отдельных пробирках.
      2. Добавьте 1 мл DMEM/F-12 с 15 мМ HEPES к сфероидам. Центрифугируйте при 300 x g в течение 5 минут при комнатной температуре (15 - 25 °C).
      3. Аккуратно удалите как можно больше надосадочной жидкости. Рекомендуется начинать удаление с пипетки объемом 1 мл и переключаться на пипетки объемом 100 мкл и даже 10 мкл, чтобы удалить как можно больше, не нарушая гранулу сфероидов.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Чем больше оставшийся объем носителя, тем более разбавленными будут матрицы. Разбавленные матрицы могут привести к проблемам с гелеобразованием или более мягким куполам. Более мягкие купола повышают вероятность обрушения с минимальными нарушениями.
      4. С помощью пипетки с холодным наконечником для дозатора объемом 100 мкл добавьте 40 мкл/50 сфероидов холодной (2–8 °C) матрицы 1-ABO или матрицы 3-ABO в соответствующую пробирку. Аккуратно распределите сфероиды в матрице пипетированием вверх и вниз ~5x. Не опорожняйте наконечник пипетки полностью, так как это может привести к образованию пузырьков.
      5. Достаньте планшет из инкубатора и с помощью холодного наконечника для пипетки аккуратно перенесите внедренные сфероиды в центр планшета, следуя инструкциям, показанным на рисунке 2. Избегайте слишком быстрого введения Matrix 1-ABO и Matrix 3-ABO в чашку для культивирования, так как это приведет к сплющиванию купола.
      6. Осторожно перенесите планшет в инкубатор с температурой 37 °C и инкубируйте в течение 30 минут, чтобы обеспечить гелеобразование купола. Будьте особенно осторожны с любой тряской или резким движением во время транспортировки и в инкубаторе.
      7. Во время инкубации купола для желирования подогрейте до 37 °C достаточный объем кишечного OGM (0,5 мл/лунку) для количества используемых лунок.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Нагревайте только необходимый объем. Избегайте циклов нагрева-охлаждения. Убедитесь, что носитель теплый, прежде чем добавлять его в купол; Холодные среды могут привести к обрушению купола.
      8. Через 30 минут осторожно добавьте 0,5 мл кишечной ОГМ на стенку лунки, чтобы не нарушить купол. Инкубировать при 37 °C с 5%CO2 и влажностью 95%. Выполняйте полную смену среды каждые 3 - 4 дня, удаляя среду, а затем добавляйте свежую среду.
    3. Для органоидных систем Matrix 4-XF выполните описанные действия.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Система органоидов Matrix 4-XF включает в себя четыре различных варианта (O1-O4); Рецептура каждого типа различается по биофункциональным лигандам, жесткости и разлагаемости. Следовательно, рекомендуется провести первоначальные эксперименты для определения оптимального типа для конкретного приложения. Этот протокол описывает использование четырех вариантов для поиска оптимальной формулы кишечных органоидов, полученных из ИПСХ. Кроме того, несмотря на то, что можно использовать несколько протоколов культивирования (например, 3D-инкапсуляция, купольная инкапсуляция), этот протокол включает использование купольного метода таким образом, что его можно напрямую сравнить с распространенными методами, используемыми при работе с системами базальных мембран животного происхождения.
      1. Добавьте 1 мл/лунку холодного надвижного DMEM/F-12, содержащего 16 мМ HEPES, к сфероидам, полученным на системе Matrix 4-XFO4. Центрифугируйте при 300 x g в течение 5 минут при комнатной температуре (15 - 25 °C).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы найти оптимальную формулу для применения, перед центрифугированием обязательно распределите сфероиды по 4 отдельным пробиркам. Сфероиды, полученные на матрицах животного происхождения, также могут быть превращены в кишечные органоиды с помощью этой системы.
      2. С помощью пипеттора объемом 1 мл удалите надосадочную жидкость, не потревожив сфероиды. Добавьте 50 мкл 3x OGM в гранулу сфероидов (~100 сфероидов). Добавьте 100 μL выбранного Matrix 4-XFO в 50 μL сфероидальной суспензии и аккуратно перемешайте 5-10x раз. Поддерживайте Matrix 4-XFO до 3x OGM в соотношении 2:1 об/в, чтобы конечная концентрация была 1x.
      3. Добавьте 40 мкл гидрогелево-сфероидной смеси в центр 24-луночного тканевого культурального планшета. Осторожно переложите планшеты в инкубатор с температурой 37 °C и инкубируйте в течение 30 минут.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Matrix 4-XFO не требует инкубации при температуре 37 °C для гелеобразования; тем не менее, рекомендуется подвергать органоиды воздействию аналогичных условий по сравнению с системами Matrix 1-ABO и Matrix 3-ABO, которым требуется 37 °C для лучшего гелеобразования куполов.
      4. Через 30 минут осторожно добавьте 0,5 мл кишечной ОГМ на стенку лунки, чтобы не потревожить купол. Инкубировать при 37 °C с 5%CO2 и влажностью 95%. Выполняйте полную смену среды каждые 3 - 4 дня, удаляя среду и добавляя свежую среду.
  5. Пассирование и созревание hIO
    1. Приготовьте те же химические вещества, растворы и реагенты, что и на шаге 2.4.1.
    2. Добавьте 1-2 мл раствора для промывки, препятствующего прилипанию, в коническую пробирку объемом 15 мл (1 на условие) и взболтайте, чтобы покрыть пробирку.
    3. Удалите раствор, препятствующий прилипанию, и промойте пробирки 5 мл D-PBS (без Ca++ и Mg++). Закройте все пробирки с покрытием и держите их при комнатной температуре (15 - 25 °C) до тех пор, пока они не понадобятся.
    4. Отсасывайте среду из куполов. С помощью пипетки объемом 1 мл добавьте 1 мл холодного DMEM/F-12 непосредственно в купол. Цель состоит в том, чтобы отделить купола от плиты.
    5. Добавьте в лунку еще 1 мл холодного DMEM/F-12 и проводите пипеткой вверх и вниз, чтобы собрать оставшиеся органические вещества. Переложите в покрытые покрытием конические пробирки объемом 15 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь в успешном сборе органоидов путем визуального осмотра лунки под микроскопом. Если наблюдаются какие-либо остаточные органоиды, повторите шаг 2.5.5.
    6. С помощью пипеттора объемом 1 мл выполняйте пипетирование суспензии вверх и вниз для распада органоидов до тех пор, пока не будет получена однородная фрагментная суспензия с желаемым размером органоида (например, 100 - 500 мкм).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте пипетку объемом 200 μл, чтобы убедиться, что органоиды соответствуют рекомендуемому размеру. Использование пипетки объемом 200 мкл способствует дополнительному фрагментированию по мере необходимости, обеспечивая плавное прохождение фрагментов через наконечник пипетки объемом 200 мкл.
      ВНИМАНИЕ: Избегайте разбиения фрагментов на отдельные клетки путем резкого или длительного пипетирования.
    7. Установите желаемую плотность органоидов либо путем подсчета фрагментов, либо с помощью коэффициента расщепления. Отделите аликвоту и выполните подсчет, используя ту же процедуру, что и в шагах 1.4.6-1.4.9 для подсчета комков.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальная плотность органоидов должна быть оптимизирована для каждой линии; Как правило, рекомендуется плотность 40 - 80 кишечных органоидов на купол.
    8. Убедитесь, что пробирка помещена на лед во время процесса подсчета органоидов. Примерно через 5 минут фрагменты органоидов осядут на дно пробирки под действием силы тяжести.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чем больше объем раствора органоида, тем больше времени потребуется для его оседания на дно.
    9. Аккуратно удалите как можно больше надосадочной жидкости и мутного слоя, образовавшегося поверх органоидов. На ранних стадиях, когда органоиды созревают, эта мутная фаза охватывает матрицу и отдельные клетки.
    10. Добавьте 2 мл холодного DMEM/F-12 путем пипетирования непосредственно на гранулу. Центрифуга при 200 x g в течение 5 мин при комнатной температуре (15 - 25 °C).
    11. В случае системы животного происхождения необходимо тщательно удалить и утилизировать надосадочную жидкость, выполнив те же действия, которые описаны в шагах 2.4.2.4-2.4.2.9.
    12. В случае системы Matrix 4-XFO осторожно удалите надосадочную жидкость, выполнив те же действия, что и шаги 2.4.3.2-2.4.3.4.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При работе с системой Matrix 4-XFO рекомендуется использовать раствор для восстановления гидрогелевых органоидов без ксеноса для оптимального удаления остатков гидрогеля. Это решение для восстановления особенно рекомендуется при переходе с гидрогелевых систем животного происхождения на безксеногенные для обеспечения удаления любого ксеногенного материала.

figure-protocol-3
Рисунок 2. Схема методики, рекомендуемой для формирования купола. На схеме описан пошаговый процесс, рекомендуемый для успешного формирования купола для всех систем. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

3. Характеристика размеров ввода-вывода

ПРИМЕЧАНИЕ: Размер органоидов был охарактеризован светлыми изображениями, полученными с 4-кратным и 10-кратным увеличением. Анализ обработки изображений был автоматизирован с помощью MATLAB. Общие этапы процесса описаны ниже, а пример кода включен в Дополнительный файл 1.

  1. Определите каталог, содержащий изображения, и перечислите все файлы изображений в каталоге. Инициализируйте таблицу для сохранения результатов. Чтение изображений светлого поля в файле.
  2. Определите преобразование пикселей в μm и установите масштаб. Если изображение не содержит масштабной линейки, запросите у пользователя коэффициент преобразования пикселей в мкм.
  3. Преобразуйте изображение в оттенки серого. Примените фильтр Гаусса для уменьшения шума на изображении. Установите порог для отфильтрованного изображения, чтобы отделить органоиды от фона.
  4. Заполните небольшие отверстия и удалите мелкие объекты, чтобы очистить двоичное изображение. Выполняйте анализ связных компонентов для идентификации отдельных органоидов и расчета их свойств, таких как площадь, центроид, длина большой оси и длина малой оси.
  5. Рассчитайте размер органоида на основе длины большой и малой оси. Отобразите сегментированные органоиды на исходном изображении и пометьте их размером. Распечатайте размеры органоидов и сохраните результаты в файле .cvs.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Первая пара изображений была проанализирована вручную для определения оптимальных параметров стандартного отклонения фильтра Гаусса и площади до порогового значения. Код в дополнительном файле 1 представляет собой пример базовой структуры для анализа размеров органоидов по изображениям в светлом поле; Тем не менее, требуется дальнейшая доработка, чтобы соответствовать конкретным требованиям для каждого типа изображения и качества. Тот же процесс можно проделать с помощью программного обеспечения с открытым исходным кодом, такого как FIJI от Image J.
  6. Выполните следующие действия, чтобы использовать программное обеспечение FIJI.
    1. Определите преобразование пикселей в μm и установите масштаб. Если изображение не содержит масштабной линейки, запросите у пользователя коэффициент преобразования пикселей в μm, нажав «Анализ» > «Установить масштаб».
    2. Преобразуйте изображение в оттенки серого, нажав кнопку Изображение > Тип > 8 бит. Примените фильтр Гаусса для уменьшения шума на изображении, щелкнув Обработка > Фильтр > Гауссова размытость > Сигма (радиус) используется: 2.
    3. Установите пороговое значение для отфильтрованного изображения, чтобы отделить органоиды от фона, щелкнув Изображение > Порог > MaxEntropy > Применить.
    4. Заполните небольшие отверстия и удалите мелкие объекты, чтобы очистить двоичное изображение, нажав «Обработать > шума» > «Удалить выбросы» > 20 пикселей.
    5. Выполните анализ соединенных компонентов для идентификации отдельных органоидов и вычисления их свойств, таких как площадь, центроид, длина большой оси и длина малой оси, щелкнув «Анализ» > «Задать измерение» > «Убедиться, что площадь, периметр и диаметр включены > «Анализ» > «Анализ частиц» > «Показать контуры».
  7. Статистический анализ
    1. Оцените нормальное распределение данных с помощью теста Сафиро-Уилка с использованием программного обеспечения JMP (SAS). Чтобы изучить статистические различия между группами, выполните двусторонний ANOVA и проведите апостериорное тестирование с использованием непараметрического метода Вилкоксона в программном обеспечении JMP(SAS). Значимость установлена на уровне альфа p ≤ 0,05.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Следуя этому протоколу, коммерчески доступные базальные мембраны и гидрогелевая система, не содержащая ксено, были успешно использованы для культивирования клеток hiPSC и их дифференцировки в hIO. Основной целью этих экспериментов была систематическая оценка эквивалентности матриц из различных источников для работы hiPSC и hIO. Первый раздел этого протокола был посвящен поддержанию и характеристике здоровой культуры iPSC, которая обеспечивает эффективное производство кишечных органоидов. Описан и сравнен процесс покрытия посуды культуральной посуды матрицами животного происхождения Matrix 1-AB, Matrix 2-AB и Matrix 3-AB с безксеносодержащей гидрогелевой системой Matrix 4-XF.

Как показано на рисунке 3A, hiPSCs BXS 0116 (производные CD34+) демонстрируют сопоставимую морфологию при культивировании на трех матрицах, полученных от животных. Тем не менее, сравнение клеточной линии BXS 0116 с SCTi003-A (полученным из PBMC), культивируемым в лунках, покрытых Matrix 1-AB, подчеркивает, что внутренние различия между клеточными линиями (показаны в таблице 6) могут привести к вариациям в отношении пролиферации, дифференцировки и морфологии клеток. Например, в то время как для генерации DE для клеточных линий SCTi003-A потребовалось 3 дня, для BXS0116 линии потребовалось 5 дней. Более того, как показано на рисунке 3B-C, культивирование hiPSCs в гидрогелевых системах Matrix 4-XF приводит к образованию колоний в частично встроенной 3D-колонии, которая резко отличается от плоской морфологии культуры hiPSC на планшетах, покрытых Matrix 1-AB или эквивалентными системами. Кроме того, одним из ключевых аспектов, на которые следует обратить внимание в ходе этих экспериментов, является то, что создание гидрогелевой системы, не содержащей ксено, с использованием 3-кратных факторов роста может значительно улучшить жизнеспособность клеток и экспрессию маркеров стволовых клеток. В целом, культуры hiPSC на матрицах животного происхождения и свободном от ксеноса Matrix 4-XF, изготовленном с 3-кратной концентрацией факторов роста, приводили к эквивалентной экспрессии SSEA-4 (маркера стволовых клеток)22; однако гидрогелевая система способствует образованию частично внедренных 3D-колоний.

Второй раздел этого протокола посвящен дифференциации ИПСК для генерации ГИО. В данном случае коммерчески доступный набор, разработанный на основе Spence et al.23 , был использован для дифференциации в определенную энтодерму (DE), затем в среднюю кишку/заднюю кишку (MH) и, наконец, для сбора сфероидов для созревания в IO (рис. 4C). Для эффективного создания ИО решающее значение имеет изучение того, что культура hiPSC имеет минимальную спонтанную дифференцировку, до начала протокола дифференцировки. Как показано на рисунке 4А, чем ниже экспрессия маркеров стволовых клеток, таких как SSEA-4, при начале дифференцировки ДЭ, тем менее эффективным будет процесс на каждом этапе (т.е. более низкая экспрессия маркеров МН) и последующая плохая генерация ГИО. Использование компактного настольного устройства проточной цитометрии позволило быстро получить доступ к результатам проточной цитометрии и принять решение о качестве дифференцировки перед переходом к следующему этапу. Любопытное наблюдение заключалось в том, что поддерживаемый Matrix 2-AB hiPSC приводил к меньшему количеству высвобождений сфероидов на стадии средней и задней кишки по сравнению с другими системами животного происхождения. Еще один ключевой аспект, на который следует обратить внимание, заключается в том, что, поскольку колонии hiPSC, поддерживаемые в Матрице 4-XF, уже имели трехмерную структуру в начале дифференциации, эти системы привели к образованию более крупных сфероидов.

Сфероиды встраивали в матрицу 1-ABO, матрицу 3-ABO и матрицу 4-XFO1-Матрицу 4-XFO4 и превращали в hIO с помощью набора. После созревания сфероидов в течение 7 дней они проходили и встраивались в соответствующие системы матриц. Рост органоида в каждой системе отслеживался в течение 7 дней по светлым изображениям. В то время как культура начиналась с органоидов относительно одинакового размера, через 5 дней размер hIO варьировался в зависимости от матрицы, в которую они были встроены (рис. 5). Из четырех Matrix 4-XFO состав, который привел к получению более крупных органоидов, был Matrix 4-XFO3. Системы Matrix 4-XFO имеют различные лиганды и механические свойства для различных областей применения24. В частности, жесткость25 Matrix 4-XFO3 ближе к жесткости кишечника человека26, чем у других составов Matrix 4-XFO, что подтверждает недавние выводы о роли механических свойств ECM на расширение органоидов 12,27,28. Наши репрезентативные результаты показывают, что Matrix 1-ABO и Matrix 3-ABO в равной степени способствуют росту и расширению кишечных органоидов.

figure-results-1
Рисунок 3: Выбор матричной системы для поддержания iPSC. (A) Репрезентативные изображения двух клеточных линий, выращенных на покрытии культуральной посуды с помощью трех различных матричных систем животного происхождения. (B) Репрезентативные изображения, сравнивающие использование Matrix 4-XF с добавками 1-кратного и 3-кратного фактора роста, показывают, что увеличение добавок фактора роста улучшает жизнеспособность hiPSC на гидрогеле Matrix 4-XF. (C) Проточное цитометрическое сравнение экспрессии SSEA-4 матрицы 1-AB, матрицы 3-AB, матрицы 4-XF (3X) показывает эквивалентную экспрессию, в то время как матрица 4-XF (1X) привела к снижению экспрессии SSEA-4. Столбцы представляют среднее значение ± SD n = 5; двусторонний ANOVA и апостериорное тестирование с помощью непараметрического метода Вилкоксона для проверки значимости. Масштабная линейка = 200 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-2
Рисунок 4: Дифференцировка иПСК на определенную энтодерму (ДЭ) и среднюю кишку/заднюю кишку (МГ). (А) Репрезентативные изображения дифференцировки иПСК в ДЭ, начиная с различных уровней маркера SSEA4, подчеркивают важность начала дифференцировки с популяцией ИПСК с высокой экспрессией маркеров стволовых клеток. Красные стрелки указывают на области спонтанной дифференцировки до начала ДЭ. (B) Пример анализа проточной цитометрии экспрессии маркера стволовых клеток SSEA4 до начала дифференцировки и маркера ДЭ FOXA2 после 3 дней дифференцировки ДЭ при плохой дифференцировке ДЭ (слева) и хорошей дифференцировке (справа). Каждый график представляет собой анализ клеток, извлеченных из 1; Для статистического анализа рекомендуется усреднить результаты, полученные не менее чем из 3 прогонов проточной цитометрии. (C) Репрезентативные изображения дифференцировки iPSC в hIO на всех изученных матрицах. Масштабная линейка = 200 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-3
Рисунок 5: Выбор матричной системы для встраивания сфероида и созревания hIO. (A) Примеры изображений созревания hIO, встроенных в матрицу 4-XFO 1-4. Модуль упругости систем Matrix 4-XFO составляет около 50-300 Па, с наибольшим для Matrix 4-XFO3 > Matrix 4-XFO4 > Matrix 4-XFO2 > Matrix 4-XFO1. Жесткость Matrix 1-ABO и Matrix 3-ABO колеблется от 440-800 Па в зависимости от партии. (B) Образцы изображений созревания hIO были встроены в Матрицу 1-ABO, Матрицу 3-ABO и Матрицу 4-XFO3 в день встраивания (День 0) и после 1 недели культивирования (День 7). (C) Данные, показывающие сравнение размеров hIO, полученные в различных матричных системах. Столбцы представляют среднее значение ± SD n = 7; двусторонний ANOVA и апостериорное тестирование с помощью непараметрического метода Вилкоксона для проверки значимости. Масштабная линейка = 200 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-4
Рисунок 6: Репрезентативные иммунофлуоресцентные изображения кишечных органоидов, выращенных в различных матрицах, подтверждают популяцию эпителиальных клеток. Цельные кишечные органоиды, выращенные в различных матрицах, фиксировали и окрашивали молекулой адгезии эпителиальных клеток (EpCAM) (зеленый) и компенсировали клеточные ядра DAPI (синий). Все органоиды демонстрируют EpCAM-положительные клетки, подтверждая популяцию эпителиальных клеток, локализованную на внешней поверхности органоидов. Масштабная линейка = 200 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1: Краткая информация о получении, хранении и разведении аликвот матриц, используемых для нанесения покрытий на культуральную посуду, используемую для iPSC. * Для получения точного коэффициента разбавления проверьте рекомендуемый коэффициент разбавления и/или концентрацию белка в Сертификате анализа каждой партии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 2: Справочная таблица объема растворов покрытий на площадь поверхности культуральной посуды и mTeSR Plus Medium. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 3: Справочная таблица объема растворов прекурсоров Matrix 4-XF на площадь поверхности культуральной посуды и всей среды стволовых клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 4: Список общих маркеров, рекомендуемых для характеристики ИПСК и ГИО в процессе работы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 5: Краткая информация о средах, необходимых при дифференцировке ИПСК в кишечные органоиды. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 6: Конкретные подробности о двух линиях hiPSC, использованных в этом исследовании. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Дополнительный файл 1: Общий код MATLAB для изменения в соответствии с конкретным типом изображения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Выбор оптимальной микросреды для работы со стволовыми клетками и органоидами является ключевым ранним шагом при использовании этих платформ для широкого спектра применений. Наши репрезентативные результаты показывают, что матрица 4-XFO3 в сочетании с более высокой концентрацией факторов роста приводит к образованию более крупных органоидов, что позволяет предположить, что физические свойства гидрогелей без ксеноса могут быть использованы для оптимизации генерации органоидов с использованием этих систем. Ранее было показано, что уникальные характеристики внеклеточного матрикса (ВКМ) тесно переплетаются с идентичностью клеток внутриоргана12. Поскольку клетки воспринимают внешние силы через интегрины и другие рецепторы, механические характеристики ВКМ оказывают глубокое влияние на стволовые клетки, и в ответ стволовые клетки могут генерироватьвнутренние силы. Взаимодействие между стволовыми клетками и их микроокружением является ключевым фактором в инициировании различных сигнальных путей12. Кроме того, было показано, что ВКМ может служить резервуаром для хранения и высвобождения факторов роста и других сигнальных молекул, влияющих на поведение клеток. Таким образом, наши репрезентативные результаты и десятилетия исследований подчеркивают важность учета биохимических и физических аспектов нативного клеточного микроокружения и свойств тканей при выборе матричных систем для исследований in vitro 29,30.

В протоколе было разъяснено несколько важных шагов и рекомендаций, чтобы проинформировать пользователей о потенциальных проблемах и способах их избежать. Тем не менее, в этих методах представлены два важнейших шага, которые имеют решающее значение для успешной реализации этого протокола. Во-первых, проверка специфических маркеров, связанных с популяцией стволовых клеток, имеет решающее значение для определения оптимальной системы покрытия для поддержания популяции стволовых клеток в готовности к эффективной контролируемой дифференцировке. Аналогичным образом, подтверждение экспрессии маркеров, связанных с каждым этапом дифференцировки, имеет важное значение для принятия решения о том, когда переходить к следующему этапу. Этот протокол содержит общие рекомендации относительно минимального времени, необходимого на каждом этапе. Тем не менее, оптимальное время на каждой стадии будет варьироваться для разных клеточных линий и условий эксперимента (например, генотипа, жесткости). Таким образом, определение характеристик маркеров, специфичных для нескольких стадий, является лучшим подходом к повышению эффективности генерации hIO.

Вторым важным шагом было включение более высокой концентрации факторов роста при использовании системы Matrix 4-XF, не содержащей ксеносов, что имеет первостепенное значение. Одним из часто выделяемых ограничений систем биоматериала, не содержащих ксено, является недостаток факторов роста31. Тем не менее, эта слабость может стать сильной стороной: полный контроль над факторами роста в системах для улучшения воспроизводимости. В то время как этот протокол описывает использование коммерчески доступных сред и набора добавок фактора роста, то же самое обоснование может быть использовано при изготовлении полного средства внутри компании с отдельными компонентами. Удельное соотношение гидрогель/среда определяет, насколько выше должна быть концентрация факторов роста; Например, соотношение 2:1 может потребовать 3-кратной концентрации факторов роста, чтобы в конечном итоге получить концентрацию, репрезентативную для стандартной используемой полной среды. Полный контроль над факторами роста, присутствующими в системе, полезен для ответа на механистические вопросы и позволяет избежать проблем с регулированием во многих приложениях.

Этапы обработки изображений, описанные на шаге 3, ограничены качеством изображений и типом получаемых изображений. Может потребоваться доработка в соответствии с конкретными требованиями каждого типа изображения и качества. Тем не менее, общие этапы процесса и пример кода MATLAB базовой структуры для анализа размеров органоидов по светлопольным изображениям помогают определить рабочий процесс, который может быть дополнительно оптимизирован и расширен. Кроме того, доступ к светлопольному микроскопу более распространен, чем к другим типам микроскопов. Несмотря на то, что отсутствие доступа и знакомства с MATLAB может ограничить использование этого кода, общие этапы процесса совместимы с программным обеспечением с открытым исходным кодом, таким как Fiji от Image J. Размер органоида сам по себе не является рекомендуемой метрикой для оценки зрелости; рекомендуется провести оценку специфических маркеров, репрезентативных для органа-мишени; некоторые из этих маркеров кишечной ткани включены в таблицу 4. На рисунке 6 показан пример иммунофлуоресцентного окрашивания цельных органоидов молекулой адгезии эпителиальных клеток (EpCAM), которая локализуется на наружной поверхности (базолатеральной) органоидов. В то время как EpCAM визуализировался в органоидах, культивируемых во всех системах ECM, были различия в размерах этих органоидов. Таким образом, информация о размерах органоидов помогает оптимизировать условия культивирования. Кроме того, в исследованиях реакции на лекарственные препараты размер органоидов служит метрикой реакции на тестируемое соединение; Изменения в размерах могут отражать эффективность или токсичность тестируемых соединений. Важно отметить, что создание нескольких партий органоидов со стандартизированным размером является актуальной проблемой в этой области, но это важный показатель экспериментальной воспроизводимости, позволяющий сравнивать результаты в различных экспериментах или лабораториях. В целом, автоматизированный рабочий процесс, позволяющий извлекать важную информацию об органоидах из изображений светлого поля, является полезным инструментом для многих исследователей.

Обе системы, матрицы животного происхождения и гидрогели без ксеносов, имеют свои преимущества и недостатки. Матрица 2-AB, приводящая к меньшему количеству выбросов сфероидов во время стадии MH, чем другие матрицы животного происхождения, может быть результатом вариаций от партии к партии, что является широко известной характеристикой коммерчески доступных матриц животного происхождения. Важно отметить, что концентрация коммерчески доступных систем ECM варьируется; Например, для приготовления растворов для нанесения покрытий использовались коэффициенты разбавления, указанные в спецификациях продукта, что может привести к незначительным различиям в концентрациях матриц животного происхождения. Эти различия в концентрации белка могут существенно влиять на дифференцировку, что приводит к различиям в эффективности дифференцировки при использовании одного и того же продукта из разных партий. Чтобы сделать выбор между этими системами, учитывайте такие факторы, как конкретные экспериментальные цели, этические соображения и нормативные требования. Например, в случаях сравнения экспериментальных результатов in vitro с моделью животного на мыши, чтобы ответить на вопросы по биологии опухолей и рака, использование матриц, полученных от мыши Engelbreth-Holm Swarm EHS, может быть отличным выбором. Кроме того, поскольку такие продукты, как Matrigel, используются на протяжении десятилетий, существует множество протоколов, данных и ссылок. Тем не менее, использование четко определенных матриц без ксеносов, которые позволяют настраивать физические и химические свойства, может быть более подходящим вариантом, когда исследовательский вопрос связан с заболеваниями человека или методами лечения. Кроме того, большинство гидрогелевых систем без ксеносов разработаны в соответствии с нормативными стандартами, что делает их подходящим выбором для исследований, требующих соблюдения надлежащей производственной практики (GMP) или других нормативных рекомендаций.

Таким образом, в то время как матрицы животного происхождения широко используются для поддержания iPSC и получения органоидов благодаря их биосовместимости, гидрогелевые системы, не содержащие ксено, имеют преимущества с точки зрения воспроизводимости, экономической эффективности, соответствия нормативным требованиям и этических соображений. Выбор между ними зависит от конкретных потребностей исследования или клинического применения. Гидрогелевые системы, не содержащие ксено, набирают популярность как более универсальная и устойчивая альтернатива, которая может поддерживать использование органоидов и микрофизиологических систем для доклинических исследований в шорт-листе терапевтических кандидатов. Это приложение может значительно улучшить раннюю разработку лекарств и помочь решить текущие проблемы клинического перевода в фармацевтической отрасли.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Доктор Джон Хуанг является основателем и генеральным директором компании TheWell Bioscience.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы признают предыдущее обучение и общие рекомендации относительно начала работы с hiPSC и органоидами от докторов Кристины Пакак, Сильвели Сусуки-Хатано и Рассела Д'Соузы. Они благодарят доктора Челси Симмонс за ее руководство по использованию гидрогелевых систем для работы с клеточными культурами in vitro . Кроме того, авторы хотели бы поблагодарить докторов Кристин Родригес и Томаса Эллисона из STEMCELL Technologies за их рекомендации по культивированию ИПСК Авторы также благодарят компанию TheWell Bioscience за покрытие расходов на публикацию.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
24-луночный планшет (обработанный культурой, стерильный)Falcon353504
37 градусов; C водяная баняVWR
96-луночная пластина Fisher ScientificFB012931
Advanced DMEM/F12Life Technologies12634
Антиадгезионный раствор для промывкиSTEMCELL Technologies7010
Шкаф биологической безопасности (BSC)Labconco Логический
светлопольный микроскопEcho RebelREB-01-E2
BXS0116ATCCACS-1030
Центрифуга с контролем температуры (4&�; C возможности)ThermoScientific75002441
Конические пробирки, 15 мл, стерильныеThermo Fisher Scientific339650
Конические пробирки, 50 мл, стерильныеThermo Fisher Scientific339652
Cultrex RGF BME, тип 2Bio-techne3533-005-02
Cultrex Stem Cell Qualified RGF BME Bio-techne3434-010-02
D-PBS (без Ca++ и Mg++)Thermo Fisher Scientific14190144
GeltrexLDEV-free, hESC-qualified Reduce Growth FactorGibco A14133-02
GlutaMAX SupplementThermo Fischer Scientific35050-061
Guava Muse Cell Analyzer или другое оборудование для проточной цитометрии (опционально)Luminex0500-3115
HEPES буферный растворThermo Fischer Scientific15630-056
Heralcell Vios Инкубатор для клеточных культур (37 ° C, 5% CO2)Thermo Scientific 
JMP SoftwareSAS InstituteJMP 16
MATLABMathWorks, IncR2022b
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Матрица базальной мембраны LDEV freeCorning 
Matrigel Matrix с высокой концентрацией (HC), сниженным фактором роста (GFR) без LDEV 
mTeSR Plus Medium STEMCELLTechnologies100-0276
Nunclon Delta поверхностно обработанный 24-луночный планшетThermo Scientific144530
PE Мышь Anti-human CD326 (EpCAM)BD Pharmingen566841
PE Mouse Anti-human CDX2 BD Pharmingen563428
PE Мышь античеловеческая FOXA2BD Pharmingen561589
PerCP-Cy 5.5 Мышь античеловеческая SSEA4 BD Pharmingen561565
ReLeSRSTEMCELL5872
SCTi003-ASTEMCELL Technologies200-0510
Серологические пипетки (10 мл)FisherScientific 13-678-11E
(5 мл)Fisher Scientific13-678-11D
STEMdiff Кишечный органоид для роста Среда для ростаSTEMCELL Technologies5145
STEMdiff Набор кишечных органоидов STEMCELLTechnologies5140
Vitrogel Гидрогелевая матрицаTheWell BioscienceVHM01
VitroGel ORGANOID Discovery KitTheWell BioscienceVHM04-K
51033775356231354263Серологические пипетки

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hynes, R. O. Integrins: Bidirectional, allosteric signaling machines. Cell. 110 (6), 673-687 (2002).
  2. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. J Cell Sci. 123, Pt 24 4195-4200 (2010).
  3. Hinz, B., Gabbiani, G. Fibrosis: Recent advances in myofibroblast biology and new therapeutic perspectives. F1000 Biol Rep. 2, 78(2010).
  4. Pickup, M. W., Mouw, J. K., Weaver, V. M. The extracellular matrix modulates the hallmarks of cancer. EMBO Rep. 15 (12), 1243-1253 (2014).
  5. Rozario, T., DeSimone, D. W. The extracellular matrix in development and morphogenesis: A dynamic view. Dev Biol. 341 (1), 126-140 (2010).
  6. Even-Ram, S., Artym, V., Yamada, K. M. Matrix control of stem cell fate. Cell. 126 (4), 645-647 (2006).
  7. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
  8. Tran, O. N., et al. Organ-specific extracellular matrix directs trans-differentiation of mesenchymal stem cells and formation of salivary gland-like organoids in vivo. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 306(2022).
  9. Nikolaev, M., et al. Homeostatic mini-intestines through scaffold-guided organoid morphogenesis. Nature. 585 (7826), 574-578 (2020).
  10. Gjorevski, N., et al. Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture. Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).
  11. Gjorevski, N., et al. Tissue geometry drives deterministic organoid patterning. Science. 375 (6576), (2022).
  12. Heo, J. H., Kang, D., Seo, S. J., Jin, Y. Engineering the extracellular matrix for organoid culture. Int J Stem Cells. 15 (1), 60-69 (2022).
  13. Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (10), 647-664 (2014).
  14. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  15. Jung, P., et al. Isolation and in vitro expansion of human colonic stem cells. Nat Med. 17 (10), 1225-1227 (2011).
  16. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125(2014).
  17. Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).
  18. Greenlee, A. R., Kronenwetter-Koepel, T. A., Kaiser, S. J., Liu, K. Comparison of Matrigel and gelatin substrata for feeder-free culture of undifferentiated mouse embryonic stem cells for toxicity testing. Toxicol In Vitro. 19 (3), 389-397 (2005).
  19. Geltrex LDEV-Free, HESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix User Guide (Pub.No. MAN0007336 3.0. Fisher Scientific. , Available from: https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.cn/TFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2FGeltrex_LDEV_Free_hESC_qualified_PI.pdf (2024).
  20. biotechne R&D Systems. Cultrex Stem Cell Qualified Reduced Growth Factor. biotechne R&D Systems. , (2024).
  21. VitroGel Organoid Protocol. TheWell Bioscience. , Available from: https://www.thewellbio.com/video-protocols (2024).
  22. Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470 (7332), 105-110 (2011).
  23. Henderson, J. K., et al. Preimplantation human embryos and embryonic stem cells show comparable expression of stage-specific embryonic antigens. Stem Cells. 20 (4), 329-337 (2002).
  24. Haruna, N. F., Huang, J. Investigating the dynamic biophysical properties of a tunable hydrogel for 3D cell culture. J Cytol Tissue Biol. 7, 30(2020).
  25. Cherne, M. D., et al. A synthetic hydrogel, VitroGel ORGANOID-3, improves immune cell-epithelial interactions in a tissue chip co-culture model of human gastric organoids and dendritic cells. Front Pharmacol. 12, 707891(2021).
  26. Stewart, D. C., et al. Quantitative assessment of intestinal stiffness and associations with fibrosis in human inflammatory bowel disease. PLoS One. 13, e0200377(2018).
  27. Hernandez-Gordillo, V., et al. Fully synthetic matrices for in vitro culture of primary human intestinal enteroids and endometrial organoids. Biomaterials. 254, 120125(2020).
  28. Broguiere, N., et al. Growth of epithelial organoids in a defined hydrogel. Adv Mater. 30, 1801621(2018).
  29. Barthes, J., et al. Cell microenvironment engineering and monitoring for tissue engineering and regenerative medicine: The recent advances. BioMed Res Int. 2014, 921905(2014).
  30. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
  31. Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L. Synthetic alternatives to Matrigel. Nat Rev Mater. 5 (7), 539-551 (2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Basement Membrane MatricesHuman Stem CellsIntestinal OrganoidsXeno Free HydrogelOrganoid GenerationStem Cell MaintenanceExtracellular MatrixOrganoid CultureInduced Pluripotent Stem CellsOrganoid Differentiation

Related Articles