Описан метод изучения того, как рН реагирует на сигналы окружающей среды в гликосомах кровавой формы африканских трипаносом. Этот подход включает в себя чувствительный к рН наследственный белковый сенсор в сочетании с проточной цитометрией для измерения динамики рН, как в виде анализа по времени, так и в формате высокопроизводительного скрининга.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Измерение динамических изменений рН гликосом у живой Trypanosoma brucei
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Метаболизм глюкозы имеет решающее значение для африканской трипаносомы, Trypanosoma brucei, как важнейший метаболический процесс и регулятор развития паразитов. Мало что известно о клеточных реакциях, возникающих при изменении уровня глюкозы в окружающей среде. Как у кровотоковых, так и у проциклических (стадия насекомого) паразитов гликосома содержит большую часть гликолиза. Эти органеллы быстро подкисляются в ответ на недостаток глюкозы, что, вероятно, приводит к аллостерической регуляции гликолитических ферментов, таких как гексокиназа. В предыдущей работе локализация химического зонда, используемого для измерения pH, была сложной задачей, что ограничивало его полезность в других приложениях.
В данной работе описывается разработка и использование паразитов, экспрессирующих гликозомно локализованный pHluorin2, наследуемый белковый биосенсор рН. pHluorin2 представляет собой ратиометрический вариант pHluorin, который демонстрирует pH-зависимое (кислотно-зависимое) снижение возбуждения на длине волны 395 нм с одновременным увеличением возбуждения на длине волны 475 нм. Трансгенные паразиты были получены путем клонирования открытой рамки считывания pHluorin2 в вектор экспрессии трипаносом pLEW100v5, что позволило индуцировать экспрессию белка на любой стадии жизненного цикла. Иммунофлуоресценцию использовали для подтверждения гликосомной локализации биосенсора pHluorin2, сравнивая локализацию биосенсора с гликосомным резидентным белком альдолазой. Чувствительность датчика была откалибрована при различных уровнях pH путем инкубации клеток в серии буферов с диапазоном pH от 4 до 8, подход, который мы ранее использовали для калибровки датчика pH на основе флуоресцеина. Затем мы измерили флуоресценцию pHluorin2 на длинах волны 405 нм и 488 нм с помощью проточной цитометрии для определения гликосомального рН. Мы валидировали эффективность живых трансгенных паразитов, экспрессирующих pHluorin2, отслеживая рН с течением времени в ответ на депривацию глюкозы, известный триггер гликозомального закисления у паразитов ЛП. Этот инструмент имеет ряд потенциальных применений, в том числе потенциально может быть использован для высокопроизводительного скрининга наркотиков. Помимо гликозомального рН, сенсор может быть адаптирован к другим органеллам или использован в других трипаносоматидах для понимания динамики рН в условиях живой клетки.
Введение
Паразитические кинетопластиды, как и большинство живых организмов, полагаются на глюкозу как на фундаментальный компонент центрального метаболизма углерода. В эту группу входят важные с медицинской точки зрения организмы, такие как африканская трипаносома, Trypanosoma brucei; американская трипаносома T. cruzi; и паразиты рода Leishmania. Метаболизм глюкозы имеет решающее значение для роста паразитов на стадиях патогенного жизненного цикла. Например, при лишении глюкозы форма кровотока (BSF) африканской трипаносомы быстро погибает. Примечательно, что гликолиз служит единственным источником АТФ на этой стадии инфекции1.....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Использование трипаносом T. brucei brucei 90-13 BSF, мономорфной линии паразитов, требует рассмотрения вопросов безопасности, поскольку они считаются организмами 2-й группы риска, с которыми следует обращаться на объектах 2-го уровня биобезопасности.
1. Культивирование и трансфекция трипаносом
- Культура трипаносом T. brucei brucei 90-13 BSF в среде HMI-9 дополнена 10% термоинактивированным FBS и 10% Nu-Serum при 37 °C в 5% CO210.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы сохранить культуру здоровой, поддерживайте плотность клеток в пределах 2 × 104 и 5 × 106 кле....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Локализация pHLuorin2-PTS1 в гликосомах у BSF T. brucei
Для оценки субклеточной локализации pHluorin2-PTS1 паразитов подвергали иммунофлюоресцентным анализам. Сигнал от трансгена, локализованного с антисыворотками, повышенными против гликозомно-резидентного белка альдолазы (TbAldolase) (рис. 2A). Средний коэффициент корреляции Пирсона колокализации между анти-TbAldolase и pHluorin2-PTS1 составил 0,895, что указывает на то, что pHluorin2-PTS1 был в основном локали.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Восприятие окружающей среды и механизмы реагирования африканской трипаносомы плохо изучены. Известно, что изменения в доступности питательных веществ вызывают различные реакции у паразита, включая закисление гликосом. В данной работе мы описали метод изучения реакции гликосомного рН на возмущения окружающей среды в живых клетках с использованием наследуемого белкового сенсора, pHluorin2 и проточной цитометрии.
Существует несколько важных этапов в использовании датчика. Во-первых, важна характе.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Благодарности
pHluorin2-PTS1 был клонирован в pLEW100v5 компанией Twist Bioscience, которая предоставила конструкцию в векторе клонирования с высокой степенью копии; pLEW100v5 был подарком от доктора Джорджа Кросса. Антисыворотка, выращенная против T. brucei aldolase, можно получить у доктора Мередит Т. Моррис из Университета Клемсона по запросу. Работа лабораторий JCM и KAC была частично поддержана премией Национальных институтов здравоохранения (R01AI156382). SSP был поддержан NIH 3R01AI156382.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Колбы для культуры тканей объемом 50 мл (необработанные, стерильные) | VWR | 10861-572 | |
| 75 см<суп>2 колба для культуры тканей (необработанная, стерильная) | Corning | 431464U | |
| 80 &микро; L плоскодонный 384-луночный планшет | BrandTech | 781620 | |
| Амакса Т-клеточный нуклеофектор Комплект | Lonza | VPA-1002 | |
| Attune NxT Проточный цитометр | invitrogen от Thermo Fisher Scientific | A24858 | FlowJo программное обеспечение |
| BRANDplates 96-Well, плоская донная пластина | Millipore Sigma | BR781662 | |
| Coloc 2 плагин ImageJ | https://imagej.net/plugins/coloc-2 | ||
| CytKick Max Auto Sampler | invitrogen от Thermo Fisher Scientific | A42973 | |
| Проточный цитометр CytoFLEX | Beckman-Coulter | ||
| Электронная микроскопия науки 16% параформальдегид водный раствор, класс EM, 10 мл ампула | Fisher Scientific | 50-980-487 | |
| GraphPad Prism | статистическое программное обеспечение | ||
| Нигерицин (соль натрия) | Cayman Chemical | 11437 | |
| Nucleofector 2b | Lonza | Снят с производства Продукт | |
| OP2 Liquid Handler | opentrons | OP2 | |
| поли-L-лизин, 0,1% (w/v) в H2O | Sigma Life Science | CAS:25988-63-0 | Робот для дозирования для анализа HTS |
| Тиазол красный (TO-PRO-3) | biotium | #40087 | Мы изготовили специальную подставку для акриловой пластины, чтобы эту марку пластины можно было обнаружить и использовать на нашем CytKick Max Auto Пробоотборник |
| валиномицина | Cayman Chemical 10009152 | Пипетирование робот для ВТСП анализа | |
| Для калибровки pH | |||
| Для калибровки pH |
Ссылки
- Coley, A. F., Dodson, H. C., Morris, M. T., Morris, J. C. Glycolysis in the African trypanosome: Targeting enzymes and their subcellular compartments for therapeutic development. Molecular Biology International. 2011, 123702(2011).
- Mcconville, M. J., Saunders, E. C., Kloehn, J., Dagley, M. J.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
