Method Article

Моделирование лигандов в карты, полученные с помощью электронной криомикроскопии

DOI:

10.3791/66310

⸱

July 19th, 2024

 ,  , 
1National Centre for Biological Sciences, Tata Institute of Fundamental Research, 2Institute for Stem Cell Science and Regenerative Medicine

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол знакомит с инструментами, доступными для моделирования низкомолекулярных лигандов в криоЭМ-картах макромолекул.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Расшифровка белок-лигандных взаимодействий в макромолекулярном комплексе имеет решающее значение для понимания молекулярного механизма, лежащих в основе биологических процессов и разработки лекарств. В последние годы криогенная электронная микроскопия образцов (криоЭМ) стала мощным методом определения структур макромолекул и исследования режима связывания лигандов с разрешением, близким к атомному. Идентификация и моделирование небелковых молекул на картах cryoEM часто является сложной задачей из-за анизотропного разрешения на интересующей молекуле и присущего данных шума. В этой статье читатели знакомятся с различными программами и методами, используемыми в настоящее время для идентификации лигандов, построения моделей и уточнения атомных координат с использованием выбранных макромолекул. Одним из простейших способов идентификации присутствия лиганда, как показано на примере фермента енолазы, является вычитание двух карт, полученных с лигандом и без него. Дополнительная плотность лиганда, вероятно, будет выделяться на карте различий даже при более высоком пороге. Существуют случаи, как показано в случае метаботропного глутаматного рецептора mGlu5, когда такие простые разностные карты не могут быть сгенерированы. Недавно представленный метод получения карты пропуска Fo-Fc может служить инструментом для валидации и демонстрации присутствия лиганда. Наконец, на примере хорошо изученной β-галактозидазы анализируется влияние разрешения на моделирование лигандов и молекул растворителей в картах криоЭМ, а также представлен взгляд на то, как криоЭМ может быть использован в разработке лекарств.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Клетки выполняют свои функции, осуществляя бесчисленные химические реакции одновременно и независимо, каждая из которых тщательно регулируется, чтобы обеспечить их выживание и приспособляемость в ответ на сигналы окружающей среды. Это достигается за счет молекулярного распознавания, которое позволяет биомолекулам, особенно белкам, образовывать переходные или стабильные комплексы с другими макромолекулами, а также с малыми молекулами или лигандами. Таким образом, белок-лигандные взаимодействия являются фундаментальными для всех процессов в биологии, которые включают регуляцию экспрессии и активности белков, распознавание субстратов и кофакторов ферментами, а также то, как клетки воспринимают и ретранслируютсигналы. Лучшее понимание кинетических, термодинамических и структурных свойств комплекса белок-лиганд раскрывает молекулярную основу лигандного взаимодействия, а также способствует рациональному дизайну лекарств за счет оптимизации лекарственного взаимодействия и специфичности. Экономичным и быстрым подходом к изучению взаимодействия белка и лиганда является использование молекулярного докинга, который представляет собой вычислительный метод, который виртуально экранирует широкий спектр малых молекул и предсказывает способ связывания и аффинность этих лигандов к белкам-мишеням. Тем не менее, экспериментальные данные о структурах с высоким разрешением, определенных с помощью рентгеновской дифракции (XRD), ядерного магнитного резонанса (ЯМР) или электронной криомикроскопии (криоЭМ), обеспечивают существенное доказательство таких предсказаний и помогают в разработке новых и более эффективных активаторов или ингибиторов для данной мишени. В этой статье используется аббревиатура «cryoEM», как обычно называют эту технику. Тем не менее, в настоящее время ведутся споры о выборе правильной номенклатуры, и в последнее время был предложен термин криогенныйобразец Electron Microscopy (cryoEM) для обозначения того, что образец находится при криогенной температуре и визуализирован электронами4. Точно так же отображения, полученные с помощью криоЭМ, называются электронным потенциалом, электростатическим потенциалом или кулоновским потенциалом, и для простоты здесь мы используем криоЭМ карты 5,6,7,8,9,10.

Несмотря на то, что дифрактометрия является золотым стандартом в определении структуры белков-лигандных комплексов с высоким разрешением, криоЭМ после революцииразрешения 11 набирает обороты, о чем свидетельствует всплеск карт кулоновского потенциала или карт криоЭМ, депонированных в базе данных электронной микроскопии (EMDB) за последние нескольколет14. Благодаря достижениям в области подготовки образцов, визуализации и обработки данных, количество отложений в Банке данных о белках (PDB)14 с использованием криоЭМ увеличилось с 0,7% до 17% в период с 2010 по 2020 год, при этом примерно 50% зарегистрированных структур в 2020 году были определены с разрешением 3,5 Å или выше15,16. CryoEM быстро получила распространение в сообществе структурной биологии, в том числе в фармацевтической промышленности, поскольку она позволяет изучать гибкие и некристаллические биологические макромолекулы, особенно мембранные белки и мультибелковые комплексы, с околоатомным разрешением, преодолевая процесс кристаллизации и получая хорошо дифрагирующие кристаллы, необходимые для определения структуры с высоким разрешением с помощью XRD.

Точное моделирование лиганда на карте криоЭМ имеет первостепенное значение, поскольку он служит схемой комплекса белок-лиганд на молекулярном уровне. Существует несколько автоматизированных инструментов для построения лигандов, используемых в рентгеновской кристаллографии, которые зависят от формы и топологии плотности лиганда, чтобы вписать или построить лиганд в электронную плотность 17,18,19,20. Тем не менее, если разрешение меньше 3 Å, эти подходы, как правило, приводят к менее желательным результатам, поскольку топологические особенности, от которых они зависят при распознавании и построении, становятся менее определенными. Во многих случаях эти методы оказались неэффективными в точном моделировании лигандов в криоЭМ-карты, поскольку эти карты были определены в диапазоне низкого и среднего разрешения, обычно от 3,5 Å до 5 Å17.

Первый этап 3D-определения структуры комплекса белок-лиганд с помощью криоЭМ включает либо совместную очистку лиганда с белком (когда лиганд имеет высокое сродство связывания с белком), либо инкубацию белкового раствора с лигандом в течение определенного периода времени перед получением сетки. Затем небольшой объем образца помещают на очищенную плазмой дырчатую сетку ПЭМ, после чего следует мгновенная заморозка в жидком этане и, в конечном итоге, визуализация с помощью крио-ПЭМ. Двухмерные проекционные изображения от сотен тысяч до миллионов отдельных частиц усредняются для реконструкции трехмерной (3D) кулоновской карты потенциала макромолекулы. Идентификация и моделирование лигандов и молекул растворителей на этих картах во многих случаях сопряжены со значительными трудностями из-за анизотропного разрешения по всей карте (т.е. разрешение не равномерно по всей макромолекуле), гибкости в области, где связан лиганд, и шума в данных. Многие инструменты моделирования, доработки и визуализации, которые были разработаны для XRD, в настоящее время адаптируются для использования в криоЭМ для тех же целей 18,19,20,21. В этой статье представлен обзор различных методов и программного обеспечения, используемых в настоящее время для идентификации лигандов, построения моделей и уточнения координат, полученных с помощью криоЭМ. Был предоставлен пошаговый протокол, иллюстрирующий процессы, связанные с моделированием лигандов с использованием специфических комплексов белок-лиганд с различным разрешением и сложностью.

Первым шагом в моделировании лигандов в картах криоЭМ является идентификация плотности лиганда (небелкового) в карте. Если связывание лиганда не вызывает каких-либо конформационных изменений в белке, то расчет простой карты различий между комплексом белок-лиганд и апо-протеином по существу выделяет области повышенной плотности, предполагая присутствие лиганда. Такие различия можно заметить сразу, так как для этого просто требуется две карты, и даже промежуточные карты в процессе 3D-уточнения могут быть использованы для проверки наличия лиганда. Кроме того, если разрешение достаточно высокое (<3,0 Å), то карта различий также может дать представление о расположении молекул воды, а также ионов, взаимодействующих с лигандом и белковыми остатками.

В отсутствие карты апо-белка теперь можно использовать Servalcat22, который доступен в качестве отдельного инструмента, а также был интегрирован в программный пакет CCP-EM 23,24 в рамках доработки Refmac и в CCP4 8.0 версии25,26. Servalcat позволяет рассчитать карту взвешенной разности FSC (Fo-Fc) с использованием незаточенных полукарт и модели апопротеина в качестве входных данных. Отображение пропуска Fo-Fc представляет собой несоответствие между экспериментальным отображением (Fo) и отображением, полученным из модели (Fc). В отсутствие лиганда в модели положительная плотность в карте Fo-Fc, которая перекрывается с экспериментальной картой EM, обычно предполагает наличие лиганда. Здесь предполагается, что белковая цепь хорошо вписывается в карту, а оставшаяся положительная плотность указывает на местоположение лиганда. Тем не менее, важно тщательно изучить, является ли положительная плотность результатом неточностей моделирования, таких как неправильный ротамер боковой цепи белка.

Второй шаг включает в себя получение или создание файла декартовых координат лиганда с четко определенной геометрией на основе имеющейся химической информации. Стандартные лиганды (например, АТФ и НАДФ+), которые уже доступны в библиотеке мономеров CCP4, могут быть использованы для уточнения путем извлечения файлов координат и геометрии через их код присоединения мономера. Однако для неизвестных или нестандартных лигандов доступны различные инструменты для создания файлов геометрии. Некоторые из примеров включают eLBOW27 - (электронный конструктор лигандов и верстак оптимизации) в Phenix28, Lidia - встроенный инструмент в Coot29, JLigand/ACEDRG30,31, CCP-EM23,24, Ligprep32-a модуль Glide в составе пакета Schrodinger. Затем файл координат лиганда подгоняется по плотности, руководствуясь как экспериментальной криоЭМ-картой, так и разностной картой в Coot. За этим следует уточнение в реальном пространстве в Phenix28 или взаимное уточнение в Refmac33. Требуется рабочая станция Linux или ноутбук, оснащенный хорошей видеокартой и вышеупомянутым программным обеспечением. Большинство из этих программ включены в различные сюиты. CCP-EM24 и Phenix28 находятся в свободном доступе для академических пользователей и включают в себя различные инструменты, которые используются в этой статье, включая Coot, Refmac5 33,34,35,36, Servalcat, phenix.real_space_refine и т.д. Аналогичным образом, Chimera37 и ChimeraX38 предоставляют бесплатные лицензии для академических пользователей.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Моделирование фосфоенолпирувата (ПЭП) в енолазе из Mycobacterium tuberculosis

  1. Идентификация плотности лиганда в криоЭМ-карте ПЭП-енолазного комплекса
    1. Загрузите незаточенные полукарты (emd_30988_additional_1.map и emd_30988_additional_2.map) апо-енолазы из дополнительных данных EMDB (см. Таблицу материалов).
    2. Откройте ChimeraX (см. Таблицу материалов). Откройте полукарты апоэнолазы, нажав на кнопку «Открыть » на панели инструментов и выбрав имена файлов. Введите vop add #1 #2 в командной строке, чтобы объединить обе полукарты для получения апо-енолазы незаточенной карты.
      ПРИМЕЧАНИЕ: #1 и #2 обозначают две полукарты для фермента апо-енолазы, как упоминалось в шаге 1.1.1.
    3. Переименуйте объединенную карту (ChimeraX map ID: #3), набрав rename #3 Apo-enolase-unsharpened-map. Раскрасьте карту в серый цвет на панели модели. На карте указано, что енолаза является октамерной в растворе с D4-симметрией.
    4. Повторите шаги 1.1.1-1.1.3, используя следующие полукарты emd_30989_additional_1.map (идентификатор карты: 4) и emd_30989_additional_2.map (ID карты: 5) для получения PEP-enolase-unsharpened-map (ID карты: #6).
    5. Чтобы вычислить разностную карту, сначала подогнайте две карты (PEP-енолаза и апо-енолаза незатопленные карты из шага 1.1.3 и шага 1.1.4) друг к другу, нажав на кнопку Вписать (карта в карте) на панели карты (панели инструментов) в ChimeraX.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Нормализация между двумя картами не выполняется. В некоторых случаях может потребоваться нормализация для приведения карт к одному и тому же масштабу.
    6. Вычтите карту PEP-енолазы из карты апо-енолазы, набрав в командной строке vop subtract #6 #3 .
      ПРИМЕЧАНИЕ: #6 = PEP-enolase незаточенная карта, #3 = Apo-enolase незаточенная карта.
    7. Раскрасьте вычитаемую карту (ID карты:7) в зеленый цвет, обозначающий положительную плотность (в соответствии с принятым в рентгеновской кристаллографии соглашением)39.
    8. Загрузите координаты октамерной енолазы M. tuberculosis (PDB: 7e4x) из Банка данных белков (PDB), нажмите « Открыть » на панели инструментов и выберите имя файла.
    9. Переименуйте модель в 7e4x.pdb, набрав в командной строке rename #8 Apo_enolase.pdb . #8 обозначает Apo_enolase.pdb в ChimeraX.
    10. Выберите модель на панели моделей. Нажмите правой кнопкой мыши на панели инструментов. Нажмите кнопку Переместить молекулу, чтобы расположить модель в непосредственной близости от карты PEP-енолазы (#1) и выровнять модель относительно карты. Подгоните эту модель в PEP-enolase-unsharpened-map, набрав fit #8 в #6 в командной строке. Здесь карта имеет номер 6, а модель — 8.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В некоторых случаях локального подгонки в ChimeraX может быть недостаточно для выравнивания модели. В этих случаях в Phenix может быть выполнен дополнительный этап глобальной аппроксимации (DockinMap, см. Таблицу материалов).
    11. Сохраните установленную модель, набрав в командной строке save Apo-enolase.pdb #8 .
  2. Моделирование и уточнение ПЭП в заточенной В-фактором криоЭМ карте ПЭП-енолазного комплекса
    1. Откройте "coot" (см. Таблицу материалов) из терминала, набрав ./Coot &.
    2. Отобразите "Apo-enolase.pdb", нажав на "Файл" > "Открыть координаты Apo-enolase.pdb". Файл координат отображается связями (цвет по атомам).
    3. Загрузите карту повышения резкости Enolase, привязанную к PEP, т.е. emd_30989.map из EMDB. Отобразите то же самое, нажав на Файл > Открыть карту > emd_30989.map . Установите порог на 7.00 σ , прокрутив среднюю кнопку мыши.
    4. Чтобы найти несмоделированные BLOB > щелкните Проверить несмоделированные BLOB-объекты > Найти BLOB-объекты.
    5. Найдите несмоделированную плотность лиганда рядом с остатками активного центра, Ser 42, Lys-386 и Arg-364 модели енолазы.
    6. Получите файл модели мономера PEP из библиотеки мономеров Coot, нажав « Файл» > «Получить мономер» и введя PEP в качестве 3-буквенного кода.
    7. Переместите молекулу PEP на плотность, используя опцию Rotate/Translate- Zone/Chain/Molecule в меню боковой панели. Используйте уточнение в реальном пространстве в Coot, чтобы вписать молекулу PEP в плотность, нажав на «Зона уточнения в реальном пространстве » в меню боковой панели. Объедините подогнанный лиганд с файлом Apo-enolase.pdb, используя опцию «Объединить молекулы » на вкладке редактирования . Сохраните модель как PEP-Enolase.pdb.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Можно также использовать лиганд> вариант Jiggle-Fit Ligand, чтобы подогнать лиганд.
    8. Чтобы добавить лиганды к остальным мономерам в файле координат, нажмите кнопку «Рассчитать > NCS Tools > NCS ligands». Появится отдельное окно под названием Find NCS-Related Ligands. Для параметра Белок с NCS выберите файл координат Apo-enolase.pdb и идентификатор цепочки A в качестве NCS Master Chain.
      1. Для молекулы, содержащей лиганд, выберите файл координат Apo-enolase.pdb и идентификатор цепи, J и номер остатка от 1 до 1. Нажмите на кнопку «Найти кандидатские позиции». Появится окно с именем «Подогнанные лиганды» со списком потенциальных позиций. Оцените подгонку, щелкнув по отдельным лигандам-кандидатам, и проанализируйте ее визуально.
        ПРИМЕЧАНИЕ: В Servalcat/Refmac может быть предоставлена только мономерная модель, а симметрия, использованная при реконструкции, может быть задана для получения расширенной модели.
    9. Дополнительная плотность молекул растворителя также наблюдалась вблизи лиганда. Кристаллические структуры енолазы высокого разрешения из различных гомологов позволяют предположить наличие двух ионов Mg2+ 40,41, что, вероятно, стабилизирует отрицательный заряд промежуточного продукта реакции. Моделируйте два иона Mg2+ в плотности активного центра, щелкнув по указателю на Place Atom и выбрав MG из списка типа Pointer Atom.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Геометрия и расстояние между связями могут быть использованы в качестве ориентира для выбора иона металла. В случаеMg2+ , связанного с атомами кислорода в белковых остатках, расстояние связи колеблется в пределах 2,1 Å -2,4 Å при октаэдрической геометрии. Однако в случае карт с низким разрешением координационная сфера часто бывает неполной, и расстояние также может варьироваться из-за ограничений разрешения.
    10. Повторите шаг 1.2.8 для того, чтобы добавить ионыMg2+ в мономеры, связанные с симметрией.
    11. Сохраните модель, нажав на Файл > Сохранить координаты > Выбрать имя файла > и введя Enolase+PEP+Mg.pdb.
    12. Откройте графический интерфейс Phenix (см. Таблицу материалов). Запустите задание по уточнению реального пространства с помощью Enolase+PEP+Mg.pdb и emd_30989.map в качестве входной модели и карты соответственно, используя параметры по умолчанию. Этот шаг выполняется итеративно с помощью Coot для достижения хорошей подгонки карты к модели и геометрии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Незаточенная карта различий используется для демонстрации присутствия лиганда, например, на рисунке. Для целей моделирования была использована и рекомендована карта с повышением резкости B-фактора. Карта с повышением резкости B-фактора также может быть использована для вычисления карты разностей в демонстрационных целях, в отличие от карты без резкости. Однако, если разрешение ниже в области, где связан лиганд, то один B-фактор, используемый для повышения резкости всей карты, может не показать плотность лиганда.
  3. Визуализация и генерация рисунка моделируемого лиганда
    1. Откройте уточненную модель Enolase+PEP+Mg из финального задания на уточнение Phenix в PyMOL42 (см. Таблицу материалов), нажав на кнопку Файл > Открыть и выбрав имя файла.
    2. Загрузите файл emd-30989.map (заточенная карта, привязанная к PEP), нажав на кнопку «Файл > открыть » и выбрав имя файла.
    3. Переименуйте карту в PEP-sharped , щелкнув по действиям > переименовать напротив объекта emd_30989 и набрав PEP-sharpened.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В большинстве случаев, например, при открытии в pymol, карты при открытии в pymol нормализуются, так как опция нормализации карты отмечена по умолчанию в pymol. Поскольку карты cryoEM центрируются в более крупном ящике, нормализация будет включать в себя все, что находится в коробке. Таким образом, нормализацию можно отключить перед вскрытием в пимоле.
    4. Выберите лиганды, нажав на отображение > последовательности.
    5. Введите в командной строке isomesh mesh_ligands, PEP-sharpened, 6.0, sele, carve=3.0 и нажмите Enter.
    6. Окрасьте mesh_ligand в синий цвет, щелкнув по последнему квадрату C рядом с mesh_ligand объектом.
    7. Покажите остатки активного центра, Ser-42, Asp-241, Glu-283, Asp-310, Arg-364 и Lys-386, взаимодействующие с PEP и Mg2+ в представлении стиков и сфер соответственно, и фермент енолаза в представлении мультфильмов.
    8. Трассировка лучей с помощью ввода ray 3600, 3600 для создания изображений в качестве публикации и сохранения в виде файла png, нажав на Файл > сохранить и выбрав PEP.png в качестве имени файла.

2. Моделирование лигандов в метаботропном глутаматном рецепторе mGlu5

  1. Идентификация и моделирование плотности лиганда на криоЭМ-карте агониста и антагониста, связанного mGlu5
    1. Загрузите две полукарты вместе с соответствующими файлами координат для каждого из связанных агонистов (EMD-31536, 7fd8.pdb) и антагонистов (EMD-31537,7fd9.pdb) комплексов mGlu5 .
    2. Откройте ChimeraX
      1. Откройте файл координат 7fd8.pdb, нажав кнопку «Открыть» и выбрав 7fd8.pdb.
      2. Введите delete ligand в командной строке и нажмите Enter.
      3. Аналогичным образом используйте команду delete/B для удаления цепочки B.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Лиганды и цепи могут быть удалены с помощью выпадающего меню вверху с помощью выбора и действий > атомов/связей > удаления.
      4. Сохраните нелигандированный pdb, набрав в командной строке следующее: save 7fd8_noligand_chainA.pdb #1. #1 обозначает ID модели.
      5. Повторите шаги 2.1.2.1-2.1.2.4 для 7fd9.pdb.
    3. Откройте CCP-EM. Создайте новый проект с именем mGlu5 и укажите директорию проекта и имя пользователя.
      1. Откройте Relion из опций на левой панели.
        1. Перейдите на вкладку Создание маски .
        2. Укажите одну из полукарт для EMD-31536 в качестве входных данных.
          ПРИМЕЧАНИЕ: Relion принимает карты с суффиксом .mrc, а карты EMD имеют суффикс .map. Файлы карты могут быть открыты в ChimeraX для изучения и сохранены в формате .mrc.
        3. На вкладке маска укажите размер пикселя 0,89 Å и начальный порог бинаризации 0,007.
        4. Запустите задание с псевдонимом 31536 (или любым другим именем, которое легко понять).
        5. Аналогично создадим маску для полукарты EMD - 31537.
      2. Откройте программу Refmac Servalcat из опций на левой панели в CCPEM.
        1. Укажите имя mGlu5_agonist.
        2. Импортируйте 7fd8_noligand_chainA файл .pdb, как описано в разделе модели 2.1.2.4. Укажите расположение двух полукарт и соответствующую маску, созданную в Relion.
        3. Укажите разрешение как 3.8 Å.
        4. Перейдите в настройки уточнения > Строгая симметрия и укажите C2 в качестве симметрии группы точек Relion.
        5. Запустите программу, нажав кнопку запуска вверху.
    4. Как только задание будет завершено, откройте результат в Coot (опция доступна вверху в разделе результатов). По умолчанию в Coot будет отображаться diffmap.mtz, где красный и зеленый цвета указывают на отрицательную и положительную плотности соответственно.
      1. Перейдите в Диспетчер отображения > свойства карты разностей с надписью DELFWT PHDELWT и измените уровень контура на 4.0 (абсолютное значение).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Выбор порога зависит от карты и разрешения.
      2. Скройте карту с меткой FWT PHWT и молекулу с меткой refined.pdb.
      3. Переместите карту с помощью мыши, чтобы визуализировать положительную плотность (окрашена в зеленый цвет) и переместите большую каплю в центр.
      4. Перейдите в Файл > Получить мономер, введите QUS и нажмите Enter.
      5. Перейдите в раздел «Расчет > моделирование молекулы > подгонке твердого тела » и дважды щелкните по мономеру QUS , чтобы настроить молекулу в соответствии с плотностью Fo-Fc.
      6. Используйте опцию объединения молекул на вкладке редактирования , чтобы добавить молекулу QUS в файл координат refined.pdb.
      7. Повторите шаги 2.1.4.3-2.1.4.6 для подгонки лиганда с кодом мономера NAG и CHS в меньшем объеме во внеклеточном и на вершине трансмембранного домена, соответственно.
      8. Сохраните координату как refined_ligands.pdb.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Разрешение трансмембранного (ТМ) домена ниже, поэтому оно здесь не обсуждается.
  2. Уточнение лигандированной структуры mGlu5
    1. Откройте CCPEM и клонируйте предыдущее задание уточнения (шаг 2.1.3.2) и запустите его с refined_ligands.pdb и картой повышения резкости (emd. 31536.mrc) в качестве входных данных, используя параметры по умолчанию и симметрию C2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если программа не распознает лиганд, то необходимо предоставить файлы CIF. Эти CIF файлы могут быть загружены из PDB или сгенерированы с помощью различных программ (подробнее см. шаг 3.1.1).
  3. Визуализация и генерация фигур в PyMOL
    1. Откройте модель refined_expanded.pdb из последнего задания уточнения Refmac в PyMOL.
    2. Перейдите в раздел «Файл > открыть » и перейдите в каталог заданий Refmac, чтобы загрузить файл diffmap_normalised_fofc.mrc (карта отличий от задания Servalcat на шаге 2.1.3.2).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если файлы с расширением .mrc не видны во время просмотра, измените тип файла на все файлы и перейдите к просмотру.
    3. Выберите лиганды с помощью отображения > последовательности.
    4. Перейдите к кнопке «Действия » и переименуйте выделение в лиганды.
    5. Введите следующее в командную строку и нажмите Enter: isomesh mesh_ligands, diffmap_normalised_fofc, 6.0, ligands, carve=2.5.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ширину сетки можно регулировать. Здесь используется ширина сетки 0.2, которая задается с помощью следующей команды: set mesh_width=0.2.
    6. Щелкните правой кнопкой мыши по одному из мономеров и перейдите к цепочке > цветом , чтобы указать цвет каждого мономера. Раскрасьте лиганд и сетку с помощью последнего прямоугольника, обозначенного как c , в объектах лиганда и mesh_ligands. Димер рецептора mGlu5 показан в мультфильме, а мономеры окрашены в бирюзовый и пшеничный цвета. Лиганды показаны в виде палочки, а сетка, контурирующая лиганды, окрашена в зеленый цвет.
    7. Используйте действия > ориентации/центрирования/масштабирования относительно объектов и настройте вручную, чтобы визуализировать сетку и сделать ее четкой. Выберите близлежащие остатки, которые могут взаимодействовать с лигандом, например, Tyr64, Trp100 для QUS, и, при необходимости, отобразите их боковую цепь или основную цепь, или обе в виде стержневого представления.
    8. Трассировка лучей для создания изображений с высоким разрешением и сохранения их в виде файла png.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вышеуказанные шаги повторяются для карты границ антагонистов EMD-31537 и соответствующего файла координат PDB-7fd9.

3. Моделирование ингибитора, дезоксигалакто-ноджиримицина (ДГН) и молекул растворителя на заточенной карте β-галактозидазы с высоким разрешением.

  1. Идентификация лиганда, DGN, с использованием полукарт из cryoEM
    1. Подготовка неизвестного словаря Лиганда для моделирования [Дезоксигалакто-ноджиримицин(DGN)]
      ПРИМЕЧАНИЕ: Файл словаря дезоксигалакто-ноджиримицина включен в библиотеку мономеров CCP4 как DGJ (3-буквенный идентификатор лиганда). Тем не менее, здесь он рассматривается как новый и неизвестный лиганд для иллюстрации процесса создания файлов словаря для неизвестных лигандов, DGN используется в качестве 3-буквенного кода.
      1. Откройте краткое описание соединения дезоксигалакто-ноджиримицина (DGN) на веб-странице PubChem и скопируйте строку смайликов для соединения дезоксигалакто-ноджиримицина.
      2. Откройте Phenix > лиганды > eLBOW.
      3. Укажите строку smiles в качестве входных данных.
      4. Укажите подходящий метод оптимизации построения лиганда. Здесь используется простая оптимизация.
      5. Вставьте строку химических улыбок в раздел определения лиганда.
      6. Укажите название задания, префикс выходного файла и идентификатор лиганда и нажмите кнопку «Выполнить».
        ПРИМЕЧАНИЕ: Выходные данные задания содержат файл координат DGN.pdb и файл словаря DGN.cif. Jligand29 также может быть использован для создания файла cif.
    2. Загрузите файл координат β-галактозидазы (6tsh.pdb) из PDB и удалите координаты белковых цепей (B, C, D), лиганда, DGN и других молекул растворителя с помощью текстового редактора или опции удаления цепи/зоны в Coot. Сохраните файл координат как apo-betaGal_chainA.pdb.
      ПРИМЕЧАНИЕ: ChimeraX или Pymol также можно использовать для удаления молекулы лиганда/растворителя.
    3. Загрузите полукарты (emd_10563_half_map_1.map и emd_10563_half_map_2.map) из дополнительных данных записи EMD-10563 от EMDB.
    4. Откройте CCPEM и используйте Relion для создания маски для карты с пороговым значением 0,01 (как описано в шагах 2.1.3.1.1-2.1.3.1.4).
    5. Запустите Servalcat (в наборе CCPEM, как описано в шаге 2) с полукартами, полученными на шаге 3.1.3, и апо-моделью на шаге 3.1.2 и симметрией D2.
      Примечание: Модель должна быть выровнена по одному из полуотображений или полных отображений для определения плотности лиганда. Это можно сделать, вписав модель в карту с помощью ChimeraX и сохранив координаты относительно половины карты. В этом примере полукарты и основная карта в EMDB имеют разные размеры коробок/сеток, и модель должна быть размещена в полукарте.
    6. Откройте лысуху.
      1. Откройте DGN.cif для словаря лиганда, созданного на шаге 3.1.1 с помощью Phenix eLBOW. Для этого перейдите в раздел «Файл» > «Импортировать словарь CIF» и просмотрите каталог заданий eLBOW.
      2. Откройте файлы координат белка и лиганда, apo-betaGal_chainA.pdb с шага 3.1.2 и DGN.pdb с шага 3.1.6 соответственно.
      3. Автоматически откройте файл diffmap.mtz из задания Servalcat (шаг 3.1.5) и визуализируйте карту с надписью DELFWT PHDELWT in Coot. Контурирование карты на пороге ~ 4 абсолютного значения.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Важно проверить статистику карты, набрав заголовок map.mrc или используя инструменты в Chimera. Можно получить всю необходимую информацию о размере пикселя, размере коробки, минимальной, средней и максимальной плотности, а также среднеквадратичном отклонении от средней плотности. Очень важно проверить размер пикселя и размер прямоугольника карт cryoEM. 3D-карта представляет собой объем карты белок-лиганд в сетке 3D-вокселей. В каждом вокселе хранится значение потенциала электрона или вероятность нахождения электрона в этом месте. Когда выбран определенный порог, то вокселы, которые имеют плотность ниже указанного значения, обнуляются. Это помогает свести к минимуму экспериментальный шум на карте и лучше визуализировать особенности карты43. Таким образом, карта должна быть очерчена на пороге, где объекты карты хорошо видны, а шум на карте минимален.
      4. Перейдите в раздел Лиганд > найдите лиганды. В появившемся новом окне выберите лиганд, карту различий и модель apo-betaGal_chainA.pdb. Оставьте остальные параметры в настройках по умолчанию и нажмите «Найти лиганды », чтобы начать поиск.
      5. Отображается список топ-хитов, показывающих потенциальную плотность лигандов, с копией, размещенной в каждой из плотностей. Вручную проверьте все попадания, в которые был помещен лиганд. Сохраняйте наиболее вероятные попадания и удаляйте неоднозначные.
        Примечание: Разница в плотности карты при высоком пороге явно указывает на присутствие лиганда в активном центре.
  2. Моделирование лиганда DGN и молекул растворителя
    1. Выполните реальное уточнение пространства в Coot, чтобы вписать лиганд (DGN.pdb) в карту плотности разности, а затем объедините координаты лиганда с apo-betaGal_chainA.pdb и сохраните его как betaGal_chainA+ligand.pdb.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Лиганды, которые были размещены в областях других цепочек, могут быть удалены и не объединяются при сохранении объединенного файла координат. Лиганды в других цепях могут быть сгенерированы лигандами NCS, как показано в примере 1, шаг 1.2.8, или в Refmac/Servalcat с использованием расширения симметрии.
    2. Запустите еще одну задачу Servalcat, как описано выше (шаг 3.1.5) с betaGal_chainA+ligand.pdb в качестве входной модели и полукартами (из шага 3.1.3) с симметрией D2.
    3. Плотность разности (по сравнению с заданием Servalcat на шаге 3.2.2) вокруг моделируемого лиганда предполагает наличие молекул растворителя, координирующихся с молекулой лиганда. Центральная плотность, близкая к лиганду, оказывается слишком большой для молекул воды.
    4. Основываясь на предыдущих биохимических и структурных данных, указывающих на присутствие Mg2+ в этом положении, ион Mg2+ моделируется здесь, щелкнув опцию «Поместить атом» и указав атом как MG.
    5. Моделируйте молекулы воды в разности плотностей в активном центре, которые указывают на наличие молекулы растворителя, кликнув по месту атома в указателе и выбрав воду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Coot также имеет возможность автоматического выбора молекул воды. Здесь, так как акцент делается только на активном участке, молекулы воды добавляются вручную.
    6. Объедините координаты для Mg2+ и воды с файлом betaGal+ligand.pdb и сохраните его как betaGal+ligand+solvent_chainA.pdb.
    7. С помощью betaGal+ligand+solvent_chainA.pdb выполните уточнение Refmac в Servalcat с симметрией D2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Карта различий на выходе из этой работы может служить средством проверки того, был ли лиганд точно смоделирован, поскольку карта различий должна показывать минимальную остаточную положительную или отрицательную плотность.
  3. Визуализация и генерация фигур с помощью PyMOL
    ПРИМЕЧАНИЕ: Описанные ниже шаги представляют собой несколько примеров создания фигур с использованием моделей и карт, которые можно использовать для иллюстрации присутствия лигандов и растворителей.
    1. Откройте файл refined_expanded.pdb из последнего задания Servalcat (шаг 3.2.6) с смоделированными лигандом и растворителем.
    2. Выберите разные цепочки отдельно, чтобы окрасить их в пурпурный, желтый, зеленый и бирюзовый цвета, как описано в примере 2.
    3. Перейдите в раздел «Отобразить > последовательность», сделайте отдельные выделения для молекул воды, магния и DGN, и переименуйте объекты в воду, MG и DGN соответственно.
    4. Отобразите MG и молекулы воды в виде сфер, выбрав объекты, щелкнув правой кнопкой мыши, и покажите > сферу. Аналогичным образом отобразите лиганд в виде палочек и соответствующим образом окрасьте лиганды и растворители. В этом случае лиганд был окрашен гетероатомом в желтый цвет, ион магния окрашен в фиолетовый цвет, а молекулы воды окрашены в красный цвет.
    5. Выберите DGN, MG и молекулы воды. Щелкните правой кнопкой мыши и выберите действия> скопировать в объект и назвать его лигандами.
    6. Откройте файл diffmap_normalised_fo.mrc из задания Servalcat на шаге 3.2.6 и переименуйте его в ligand_fo.mrc. Введите следующую команду: isomesh mesh_ligands_fo, ligand_fo, 3, ligands, carve=2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Опция вырезания 2 Å применяется вокруг атомов, и в зависимости от разрешения и качества карт можно использовать значения 3-5. Кроме того, при открытии карт криоЭМ в PyMOL рекомендуется отключить normalize_ccp4_maps.
    7. Используйте действия > ориентации/масштабирования параметров и настройте вручную, чтобы визуализировать лиганды и близлежащие взаимодействующие остатки (где это применимо), как показано на шаге 2.3.7.
    8. Трассировка лучей этих сцен для сохранения изображений с высоким разрешением используется с помощью команды ray 3600, 3600.
    9. Сохраните сцену как файл .png.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги являются необязательными и описывают процесс визуализации (1) разностной плотности (Fo-Fc) для немоделируемого лиганда, DGN, (2) плотности (Fo) моделируемого лиганда, DGN, а также разностной плотности (Fo-Fc) для несмоделированных растворителей и, наконец, (3) плотности (Fo) для моделируемого лиганда, DGN и молекул растворителя в активном центре.
    10. Чтобы продемонстрировать присутствие лиганда, DGN и окружающих молекул растворителя с помощью карты различий, откройте diffmap_normalised_fofc.mrc из задания Servalcat на шаге 3.1.5. Переименуйте файл карты в unliganded_fofc.mrc, щелкнув действия > переименовать рядом с объектом карты. Введите в командной строке следующее: isomesh mesh_ligands_fofc, unliganded_fofc, ligands, level=6, carve=2.
    11. Чтобы продемонстрировать плотность моделируемого лиганда, DGN и окружающую несмоделированную плотность растворителя, откройте diffmap_normalised_fo.mrc , а также diffmap_normalised_fofc.mrc из задания servalcat на шаге 3.2.2. Переименуйте diffmap_normalised_fo.mrc в DGN_fo , а diffmap_normalised_fofc.mrc в DGN_unmodelled_solvents_fofc.
    12. Выберите MG и воду в меню «Отображение > последовательность», щелкните правой кнопкой мыши и выберите действия, которые > скопировать в объект, и назовите их растворителями.
    13. Введите в командной строке следующее: isomesh mesh_DGN_fo, DGN_fo, DGN, level=3, carve=2; isomesh mesh_solvent_fofc, DGN_unmodelled_solvents_fofc, solvents, level=6, carve=2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: mesh_DGN_fo покажет плотность лиганда, а mesh_solvent_fofc покажет плотность пропуска для MG и воды.
    14. Наконец, чтобы визуализировать смоделированные лиганды, а также окружающие молекулы растворителя в активном центре, откройте файл diffmap_normalised_fo.mrc из задания Servalcat на шаге 3.2.6 и переименуйте его в ligand_fo.mrc.
    15. Введите в командной строке следующее: isomesh mesh_ligand_fo, ligand_fo, selection=ligands, level=3, carve=2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь мы использовали diffmap_normalised_fo.mrc, но окончательная заточенная карта может быть использована для отображения плотности лигандов и окружающих остатков. Хорошей практикой является указание типа используемой карты, значений резкости B-фактора в легенде рисунка.
    16. Ширину сетки и размер сферы можно установить, набрав следующие команды: установите mesh_width=0.2 и установите sphere_scale=0.25 , чтобы уменьшить размер сферы.
    17. Окрасите сетку fo в синий цвет, а сетку fofc в зелёный.
    18. Используйте действия > ориентации/масштабирования параметров и настройте вручную, чтобы визуализировать лиганды и близлежащие взаимодействующие остатки (где это применимо), как показано на шаге 2.3.7.
    19. Трассировка лучей этих сцен для сохранения изображений с высоким разрешением используется с помощью команды ray 3600, 3600.
    20. Сохраните отдельные сцены в виде файлов .png.

4. Влияние разрешения на моделирование лиганда в β-галактозидазе

  1. Откройте Терминал и перейдите в каталог, содержащий две полукарты.
  2. Откройте две полукарты (шаг 3.1.3) в формате .map в ChimeraX, визуализируйте их и сохраните как emd10563_half1_1_unfil.mrc и emd10563_half2_1_unfil.mrc.
  3. Маска, созданная на шаге 3.1.4, может быть использована в качестве входных данных.
  4. Запустите задание постобработки в Relion, используя полукарты и маски из шагов 4.2-4.3, с параметрами по умолчанию.
  5. Повторите шаг 4.4, теперь с включенной функцией пропуска FSC-взвешивания и указанием специального фильтра нижних частот 3 Å.
  6. Повторите шаг 4.4 с специальным фильтром нижних частот 3,5 Å.
  7. Откройте карты (postprocess.mrc) из шагов 4.4-4.6, отфильтруйте в разных разрешениях и файл координат модели, 6tsh.pdb (выровненных по полукартам в ChimeraX) из шага 3.1.2 в PyMOL. Переименуйте различные карты в 3.0, 3.5 и 2.3 в соответствии с их разрешениями.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Можно подтвердить фильтрацию карт нижних частот, визуализировав их в ChimeraX или Coot.
  8. Визуализируйте влияние разрешения на плотность молекул лиганда и растворителя путем создания сетки 2 Å вокруг молекул лиганда и растворителя с пороговым значением 6σ, как описано в шаге 3.3.6, с картами, отфильтрованными для различных разрешений.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Пример 1
Фермент энолаза из M. tuberculosis катализирует предпоследнюю стадию гликолиза и превращает 2-фосфоглицерат в фосфоенолпируват (ПЭП), который является важным промежуточным продуктом для нескольких метаболических путей44,45. Данные CryoEM для образцов апо-енолазы и PEP-связанной енолазы собирали при одинаковом размере пикселя 1,07 Å, а обработку изображения проводили с помощью Relion 3.146,47. Структуры апо-енолазы и ПЭП-енолазы определяли при 3,1 Å и 3,2 Å соответственно48. Карты и модели были депонированы в EMDB и PDB49,50 (EMD-30988, EMD-30989, PDB-7e4x и PDB-7e51). КриоЭМ-карта фермента показывает, что он является октамером в растворе (рис. 1А). Для того, чтобы идентифицировать плотность лиганда в карте PEP-енолазы, были выбраны незаточенные карты апофермента и PEP-связанного фермента, а также рассчитана разностная карта в ChimeraX путем вычитания карты PEP-енолазы из карты апофермента. При высоком пороге наблюдалась отчетливая плотность (зеленый), что указывало на присутствие лиганда (рис. 1B). Моделирование белковой цепи на незаточенной карте ясно показало, что дополнительная плотность присутствует в активном центре белка (рисунок 1C). Затем лиганд, PEP, был смоделирован в заточенной карте B-фактора с использованием Coot, а модель белок+лиганд была уточнена в реальном пространстве с помощью Phenix. Два ионаMg2+ были смоделированы в плотности, наблюдаемой вблизи лиганда (рис. 1D). Лиганд, PEP, принимает ту же ориентацию, что и другие гомологи енолазы, и несколько активных остатков центра, таких как Lys-386, Arg-364, образуют водородные связи взаимодействия с лигандом PEP. Ионы Mg2+ образуют координационные связи металлов с Asp-241, Glu-283, Asp-310 и фосфатом PEP (Рисунок 1D).

Пример 2
При отсутствии доступной структуры апопротеина или в случае, если белок претерпевает большие конформационные изменения, расчет разностных карт, как описано выше, не представляется возможным. В 2021 году группа Гариба Муршудова в Лаборатории молекулярной биологии в Кембридже представила Servalcat22, который реализует рабочий процесс уточнения с помощью Refmac, а также рассчитывает разностную карту Fo-Fc после уточнения. Положительная разностная плотность Fo-Fc предполагает наличие молекул/лигандов, которые не были включены в модель во время уточнения, по сути, это карта пропуска. Тем не менее, рекомендуется сначала оценить соответствие модели карте в целом, а затем оценить карту плотности разницы.

Чтобы проиллюстрировать использование Servalcat/Refmac, был выбран mGlu5, димерный рецептор, связанный с G-белком, который связывается с нейромедиатором, L-глутаматом. При связывании агониста, L-квисквалата, внеклеточный домен переориентируется, что запускает вращение 7ТМ, приближая их для стабилизации активированного состояния. Таким образом, наблюдается большое конформационное изменение между апо/антагонистом и апо. агонист связан с состояниями51 (рисунок 2А и рисунок 2Е). Две полукарты для связанных комплексов агониста (EMD-31536) и антагониста (EMD-31537) были получены из EMDB, и карты криоЭМ показывают различное разрешение по всей молекуле и лучшее разрешение внеклеточного домена. Впоследствии они были использованы в качестве входных данных в Servalcat вместе с апо-белком в качестве модели для вычисления разностной карты или карты Fo-Fc для каждого набора данных. Эта карта отчетливо показывала присутствие различных молекул лиганда (небелковых). Разрешение, оцененное с помощью FSC (корреляции Оболочки Фурье) для комплексов, связанных с агонистом и антагонистом, составило 3,8 Å и 4,0 Å соответственно. В случае связанного с агонистом mGlu5 разностная карта Servalcat Fo-Fc показала присутствие как агониста (L-квисквалата) (рис. 2B), так и N-ацетилглюкозамина (NAG) (рис. 2C) в ECD рецептора (из-за более низкого разрешения TMD здесь мы фокусируемся только на ECD и верхней части TMD). Белковые остатки, включая Tyr-64, Trp-100, Ser-151 и Thr-175, взаимодействуют с агонистом. Плотность вблизи остатка Asn-210 указывала на присутствие N-ацетилглюкозамина (рис. 2C). Плотность, соответствующая холестерилгемисукцинату, который был добавлен во время очистки mGlu5, наблюдалась вблизи верхней части трансмембранной спирали 1 (рисунок 2D). Поскольку разрешение является умеренным, а лиганд, L-квисквалат, может быть размещен в различных направлениях, в качестве ориентира для моделирования лиганда была использована предварительная структура внеклеточного домена с лигандом (PDB-6N50). Связывание антагонистов стабилизирует открытое или спокойное состояние рецептора (рисунок 2E). Плотность, соответствующая антагонисту LY341495, наблюдалась на шарнире доли I и доли II домена венериной мухоловки в ECD. Антагонист взаимодействует с остатками, аналогичными остаткам агониста. Взаимодействие между Tyr-223 в доле II и антагонистом стабилизирует рецептор в открытом состоянии (рис. 2F). Аналогично структуре агониста, вблизи Asn-210 наблюдалось гликозилирование или присутствие N-ацетилглюкозаминового фрагмента (рис. 2G).

Пример 3
Третий пример разъясняет протокол моделирования лигандов и молекул растворителей размером с фрагмент или малого размера на картах CryoEM с высоким разрешением. Разработка фрагментарных лекарственных препаратов (FBDD) стала мощным и инновационным методом разработки новых таргетных терапевтических средств в различных областях заболеваний, что делает ее многообещающим направлением в фармацевтических исследованиях и разработках52,53. FBDD начинается со скрининга и тщательного отбора небольших, хорошо растворимых, низкомолекулярных фрагментов молекул, которые связываются с конкретными белками-мишенями или биомолекулами, представляющими интерес. Определение структур этих комплексов белок-фрагменты позволяет выявить способ связывания этих фрагментов, что служит руководством к проектированию более крупных и сложных лекарственных молекул с возрастающим сродством и специфичностью по отношению к белку-мишени54. Однако этот метод требует высокой плотности лиганда для точного определения позы и правильного размещения функциональных групп лиганда15.

β-галактозидаза, одна из первых структур с высоким разрешением, которая была определена на основе достижений в технологии криоЭМ, представляет собой хорошо изученный гомотетрамерный фермент с молекулярной массой 450 кДа, который катализирует гидролиз лактозы до глюкозы и галактозы55. Чтобы продемонстрировать использование криоЭМ в FBDD, компания Astex, Великобритания, определила структуру β-галактозидазы с помощью ингибитора размером с фрагмент, дезоксигалакто-ноджиримицина (DGN), связанного в активном центре (EMDB-10563, PDB:6tsh)56. Этот набор данных используется для иллюстрации протокола для однозначного моделирования лигандов и растворителей на картах с высоким разрешением. Чтобы продемонстрировать влияние разрешения на моделирование и визуализацию лигандов, карты были отфильтрованы до 3,0 Å и 3,5 Å на этапе постобработки в Relion. Это подчеркивает качество плотности карты при различных разрешениях и подчеркивает необходимость более высокого разрешения для моделирования лигандов и растворителей.

Фермент представляет собой тетрамер с D2-симметрией в растворе (рис. 3А). Карта различий (между картой и моделью), рассчитанная компанией Servalcat, свидетельствует о наличии DGN и нескольких молекул растворителя в активном центре фермента (рис. 3B). При расчетном разрешении 2,3 Å плотность показала особенности с высоким разрешением, что помогло в точном моделировании ингибитора в активном центре белка. Наблюдалось взаимодействие между DGN и Tyr-503 и His-540 (рисунок 3C). Плотность разницы также предполагает наличие молекул растворителей, которые взаимодействуют с DGN, а также с остатками белка. Магния2+ и несколько молекул воды были смоделированы в плотности (рисунок 3D). Наблюдаются координационные связи металлов между Mg2+ и Glu-416, Glu-461 и несколькими молекулами воды (рис. 3D). Было замечено, что Mg2+ взаимодействует с DGN через молекулу воды.

При более низком разрешении 3,5 Å и 3,0 Å плотность лиганда напоминает каплю и не имеет функций с высоким разрешением, имеющих решающее значение для точного моделирования лиганда (рис. 4A, B). Плотность молекул воды при таких разрешениях практически отсутствовала. Таким образом, с увеличением разрешения, особенно выше 3,0 Å, плотность позволила смоделировать большее количество молекул воды (рис. 4C, D). Правильное позиционирование хирального центра лиганда стало достижимым при ~2,3 Å (рис. 4C,D) благодаря наличию на карте отличительных особенностей, которые определяли размещение, а также моделированию молекул воды и Mg2+. Для сравнения, плотность Mg2+ оставалась различимой во всем диапазоне разрешения (рис. 4A-C).

figure-results-1
Рисунок 1: Моделирование лиганда фосфоенолпирувата в энолазе M. tuberculosis. (A) показывает заточенную карту фермента PEP-связанной енолазы с В-фактором. Карта предполагает, что енолаза является октамерной в растворе, и каждый мономер на карте окрашен по-разному. (B) отображает незаточенную криоЭМ-карту фермента апо-енолазы серым цветом с картой различий (между ПЭП-связанными и апо-енолазными незаточенными картами), наложенной зеленым цветом, что указывает на присутствие лиганда, ПЭП. Это демонстрационная карта, показывающая наличие лигандов. (C) отображает аппроксимацию модели енолазы на незаточенной карте cryoEM, выделяя положение разностной плотности относительно белка. Белковая модель показана в мультяшном представлении и раскрашена в Chainbow. Этот рисунок показывает, что дополнительная плотность (зеленая) присутствует в активном центре каждого мономера. (D) показывает лиганд PEP, заключенный в заточенную карту B-фактора, окрашенную в синий цвет. Кроме того, наблюдалась плотность двух ионов Mg2+, которые образуют координационные связи металла с несколькими активными остатками центра, включая Ser-42, Asp 241, Glu-283, Asp-310 и атомы лиганда. Лиганд вступает во взаимодействие водородных связей с Lys-386, Lys-335 и Arg-364. Остатки белка показаны в виде палочек, а ионы Mg2+ — в виде фиолетовых сфер. Фигуры в панелях (A-D) были сгенерированы с помощью Pymol. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Идентификация, моделирование и визуализация различных лигандов в рецепторе mGlu5 . Карты пропусков Fo-Fc были получены с помощью Servalcat. (A) показана структура димера рецептора mGlu5 (PDB-7fd8) в мультяшном представлении, где каждый мономер окрашен в бирюзовый и пшеничный цвета соответственно и связан с агонистом L-квисквалатом. Все лиганды, которые были идентифицированы во внеклеточном и на вершине трансмембранного домена рецептора, заключены в карту пропуска Fo-Fc, окрашены в зеленый цвет и оконтурены в точке 6σ. (В) подчеркивает пригодность агониста, L-квисквалата, заключенного в карте различий. L-квисквалат взаимодействует с несколькими остатками mGlu5 , включая Tyr-64, Trp-100, Ser-151, Thr-175 и Gly-280. Взаимодействия H-связи представлены красными черточками. В (C) дополнительная плотность очевидна вблизи Asn-210, который присутствует во внеклеточном домене рецептора, и молекула N-ацетилглюкозамина (NAG) была смоделирована в этой плотности. Для ясности, NAG не привязан к Asn на текущем рисунке. (D) показывает разницу в плотности холестеринового гемисукцината (CHS) зеленого цвета вблизи поверхности рецептора, подверженной воздействию липидов. Молекула CHS, представленная в палочках, была смоделирована в этой плотности. (E) показана структура рецептора mGlu5 (PDB-7fd9), связанная с антагонистом LY341495 в мультфильме. На рисунке (F) дополнительная плотность в карте различий Fo-Fc, расположенной на шарнире между долей I и долей II внеклеточного домена, указывает на присутствие антагониста. Ключевые остатки (Tyr-64, Trp-100, Ser-152, Ser-173, Thr-175 и Tyr-223) вокруг антагониста показаны в виде палочек, а потенциальные взаимодействия водородных связей с антагонистом показаны красными черточками. (G) показывает разницу в плотности, указывающую на присутствие молекулы NAG вблизи Asn-210 в структуре, связанной с антагонистом (обратите внимание, что NAG не связан с Asn для ясности). Фигурки были сгенерированы с помощью Pymol. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: Идентификация, моделирование и уточнение малых молекул ингибитора и растворителя на карте β-галактозидазы с высоким разрешением (EMD-10563). (A) показана модель β-галактозидазы с разрешением до 2,3 Å (PDB: 6tsh) в мультяшном представлении, где каждый мономер окрашен отчетливо. Серым прямоугольником выделен сайт связывания лиганда. (B) отображает плотность разности Fo-Fc (от Servalcat) в виде зеленой сетки в активном центре фермента. Разница в плотности позволяет предположить наличие ингибитора (ДГН) и нескольких молекул растворителя в активном центре. (C) демонстрирует, что, руководствуясь картой Fo-Fc, ингибитор дезоксигалакто-ноджиримицин (DGN) моделируется в активном центре. Этот смоделированный лиганд изображен в формате палочки и заключен в плотность Fo (от Servalcat), которая окрашена в blue_mesh. Наблюдаются взаимодействия водородных связей между DGN и несколькими белковыми остатками, включая Tyr-503 и His-540. Дополнительная разностная плотность Fo-Fc вокруг лиганда (зеленая) указывает на молекулы растворителя. (D) На карте показано, что несколько молекул растворителя, включая воду и Mg2+, представленные в виде красной и фиолетовой сфер соответственно, моделируются в активном центре после того, как каждая молекула растворителя связана либо с белком (Glu-416, His-418 и Glu-461), либо с остатками лиганда. Молекулы воды и Mg2+ заключены в плотность Fo (синяя сетка). Считается, что Mg2+ взаимодействует с лигандом DGN через молекулу воды. Карта Fo-Fc (зеленая сетка) на панелях (B,C) оконтурена на 6σ, в то время как плотность Fo - синяя сетка на C и D (из уточнения Servalcat после моделирования) оконтурена на 3σ. Фигуры в панелях (A-D) были сгенерированы с помощью Pymol. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-4
Рисунок 4: Влияние разрешения на моделирование лиганда в β-галактозидазе. Полукарты из EMD-10563 использовались в качестве входных данных на этапе постобработки Relion, а объединенные карты постобработки были отфильтрованы до разрешений 2,3 Å, 3,0 Å и 3,5 Å с различными B-факторами. Карта, показанная на всех панелях, обведена контуром 6σ. Для ясности, на панелях А, В и С показан только белковый остов без боковых цепей, лиганда или молекул растворителя. (А) Карта фильтруется до 3,5 Å, и показывается активный центр β-галактозидазы. На этом разрешении виден сгусток, напоминающий лиганд DGN, в сопровождении нескольких меньших пятен поблизости. Моделирование лиганда в правильной ориентации оказывается сложной задачей из-за отсутствия четких особенностей на карте. (B) Отображается карта, отфильтрованная с разрешением 3.0 Å. Здесь лигандный кап становится немного более определенным, но все еще не имеет особенностей в целом. Также наблюдается еще несколько небольших пятен, указывающих на молекулы растворителя. (C) Карта, отфильтрованная с разрешением 2,3 Å, показывает плотность лиганда с ярко выраженными особенностями, в частности, раскрывая конформацию стула иминосахара. При этом разрешении наблюдается значительное количество мелких пятен, соответствующих молекулам воды. Автоматическая оценка/повышение резкости B-фактора в постобработке Relion дает значение -18 Å2 для карт, отфильтрованных до 3 Å и 3,5 Å, в то время как значение -52 Å2 для карты, отфильтрованной до 2,3 Å. Различные B-факторы резкости EM-карт также могут быть выполнены с помощью Coot и полезны при построении модели. (D) На панели показано, что лиганд DGN (стиковое представление), Mg2+ и молекулы воды (в виде сфер) смоделированы в активном центре и на заточенной карте при 2,3 Å, показанной синей сеткой, окружающей эти атомы. Фигуры в панелях (A-D) были сгенерированы с помощью Pymol. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Усовершенствование аппаратного и программного обеспечения микроскопа привело к увеличению количества криоЭМ-структур в последние годы. Несмотря на то, что самое высокое разрешение, достигнутое на данный момент в криоЭМ для одиночных частиц, составляет 1,2 Å 57,58,59, большинство структур определяются с разрешением около 3-4 Å. Моделирование лигандов в картах со средним и низким разрешением может быть сложным и часто чревато неоднозначностью. Учитывая широкое использование криоЭМ как в академических кругах, так и в фармацевтической промышленности для трансляционных исследований и разработки лекарств, крайне важно обеспечить правильное моделирование лигандов и отсутствие двусмысленности. Таким образом, целесообразно количественно оценить разрешаемость атомов лиганда путем вычисления Q-баллов60, которые в настоящее время доступны в EMDB в качестве метрики для оценки качества карт и соответствия модели, а также в Chimera.

В первом примере ChimeraX был использован для вычисления разностной карты в реальном пространстве между апо и лиганд-связанными картами в ферменте менолазы M. tuberculosis. Дополнительная плотность при высоком пороге предполагает присутствие лиганда, фосфоенолпирувата, в активном центре и связанного с лигандом Mg2+. Важно отметить, что в этом случае карта имеет среднее разрешение (3,2 Å), и молекулы воды не могут быть смоделированы с уверенностью (рис. 1). Ограничение, связанное с этим методом, заключается в том, что он может быть применен только в том случае, если связывание лиганда не вызывает значительных конформационных изменений в белке. Нормализация карты в этом случае не проводилась, так как наборы данных apo и связанные с лигандом наборы данных были получены с одинаковым размером пикселя и обработаны с идентичными параметрами в Relion. Тем не менее, стоит отметить, что при сравнении карт, созданных различными программами реконструкции, такими как Relion46,47 и CryoSparc61, или с разным качеством, нормализация карт становится важной, прежде чем можно будет провести содержательное сравнение.

Следующим примером является mGlu5, который претерпевает значительную молекулярную реорганизацию при связывании с агонистами, как видно из структур криоЭМ51,62 (рисунок 2). В этом сценарии невозможно вычислить простую разностную карту между несвязанными (apo) и лиганд-связанными рецепторами из-за существенных различий между картами. В данном случае был использован Servalcat, который использует незаточенные и невзвешенные полукарты в качестве входных данных для уточнения во взаимном пространстве и впоследствии вычисляет разностную карту между экспериментальной картой и картой, полученной из модели. При высоком пороге можно визуализировать различия и выступать в качестве ориентира для коррекции и улучшения модели. Было обнаружено несколько несмоделированных пятен во внеклеточном и вблизи трансмембранного домена mGlu5, которые были использованы в качестве ориентира для модельных лигандов (рис. 2).

Третий пример показывает, как разрешение (2,3 Å) играет решающую роль в интерпретации карты и моделировании ингибитора размером с фрагмент в β-галактозидазе. Здесь задача состояла в том, чтобы идентифицировать очень малый лиганд (<200 Да) на карте различий Servalcat среди внутреннего шума данных и точно смоделировать его. В дополнение к высокому глобальному разрешению, определенному с помощью корреляции Фурье-оболочки (FSC), локальное разрешение, специфичное для лиганда, также было достаточно высоким, чтобы обеспечить точное размещение хиральных центров лигандов (рис. 3). Плотность молекул растворителя наблюдалась на карте различий по всему ферменту и особенно вокруг лиганда. Также было продемонстрировано влияние разрешения на моделирование лигандов и атомов растворителя (рис. 4). Важно проявлять осторожность при моделировании молекул воды или растворителя, потому что иногда шум на низком пороге может напоминать шум воды или молекул растворителя, что может привести к неправильной интерпретации.

Еще одним важным соображением является то, что одних только карт cryoEM может быть недостаточно для точной идентификации иона металла как такового. Дополнительные биофизические методы, такие как расширенная тонкая структура рентгеновского поглощения (EXAFS) или энергодисперсионная рентгеновская спектроскопия (EDX), часто необходимы для подтверждения присутствия и идентичности иона металла. Как в ферментах енолазы, так и в ферментах β-галактозидазы Mg2+ был смоделирован из-за большого количества информации, уже имеющейся об этих белках, подтверждающей идентичность иона металла. Кроме того, координация ионов металлов в этих случаях, примером которой является классическая октаэдрическая геометрия и почти идеальные координационные расстояния Mg2+, предоставила существенное доказательство их идентичности.

В целом, при моделировании лигандов в криоЭМ-картах следует учитывать несколько важных соображений. Прежде всего, важно выбрать правильную карту для идентификации и моделирования лигандов. Во всех случаях для визуализации плотности лиганда рекомендуется использовать незаточенную и невзвешенную карту или полукарту вместо карты с повышенным уровнем резкости и взвешивания, так как повышение резкости и взвешивание могут привести к появлению областей с недостаточной резкостью или чрезмерной резкостью (шум из-за обрыва последовательности) на карте. Это может привести к неоптимальной плотности лиганда, и для оценки плотности во время построения модели в Coother может быть использовано использование различного заточки B-фактора. Несмотря на то, что использование заточенной карты для идентификации лигандов на криоЭМ-карте сопряжено с риском, незаточенная карта может не отображать полную детализацию плотности лигандов, но может быть использована в демонстрационных целях, как показано на рисунке 1B, C.

Положение моделируемого лиганда должно быть валидировано, особенно в тех случаях, когда данные слабы. Как показано здесь для mGlu5, локальное разрешение варьируется по всей карте криоЭМ, и несмещенное моделирование лиганда может быть сложной задачей. Сервалкат может быть использован в качестве ценного инструмента для выявления потенциальных неточностей при моделировании белков и лигандов22.

Композиционная гетерогенность может присутствовать в комплексе белок-лиганд, где лиганд может присутствовать только в определенной популяции (если лиганд имеет низкую молекулярную массу, то этап классификации может не устранить гетерогенность). Тем не менее, важно выполнять63-й шаг 3D-классификации итеративно во время обработки изображения перед моделированием лиганда и проверять, улучшается ли плотность лиганда. Если присутствует несколько копий белка, следует проявлять осторожность при применении симметрии по всей карте во время первоначальной генерации и уточнения модели, так как это может привести к усреднению плотности лиганда во всех молекулах, связанных с симметрией. Симметрия должна быть наложена только после тщательной проверки карты для подтверждения наличия плотности лиганда во всех белковых цепях.

В зависимости от состояния (кристалл или раствор) и местоположения (погребенное или поверхностное) атомы могут быть динамическими, и при уточнении модели это называется параметром смещения атомов (ADP). Наряду с картой различий, которая дает визуальные подсказки к возможным неточностям в модели, значения ADP могут быть использованы для оценки точности лигандов после уточнения 64,65,66,67. Как правило, лиганд должен иметь такие же значения ADP, как и окружающие остатки, т.е. если они стабильно связаны и точно смоделированы. Однако лиганды на периферии или атомы лиганда (например, липиды), которые находятся далеко от макромолекул, могут иметь более высокие значения АДФ. В дополнение к уточнению координат, Refmac33,34 и Phenix позволяют уточнить значения ADP 28,68. В Refmac приближение Мотта-Бете используется для вычисления коэффициента рассеяния электронов отдельных атомов при расчете карты. В последней версии Phenix было введено индивидуальное уточнение B-фактора, аналогичное кристаллографии, для объяснения беспорядка в атомах. Очень часто в уточненных моделях, полученных с помощью cryoEM, наблюдается широкий диапазон значений ADP (иногда значения, близкие к нулю), и даже Q-оценка, используемая в EMDB для оценки соответствия модели карте, зависит от нанесенной первичной карты и характера повышения резкости B-фактора60. При построении криоЭМ-моделей часто используется несколько карт, и, таким образом, карты, используемые при моделировании и уточнении, должны быть четко упомянуты в методах, так как из-за анизотропного разрешения во многих макромолекулах одной единственной карты может быть недостаточно для объяснения всех деталей. 

При моделировании лигандов в макромолекулах одним из основных ограничений криоЭМ-карт (как и в кристаллографии) является то, что если сайт связывания лиганда имеет низкое разрешение или если связанный лиганд динамичен, то установление правильной конформации может оказаться затруднительным. Кроме того, большинство криоЭМ-структур имеют разрешение ниже 3 Å, а представление молекул воды на картах ограничено, что затрудняет оценку роли гидратации в связывании лигандов или лекарств (как показано здесь на примерах енолазы и mGluR). Вычислительные методы могут быть использованы в сочетании с данными cryoEM для устранения этих ограничений69. В отличие от кристаллографии, доработке подвергается только модель, а не карта. В настоящее время единственным способом указать на наличие лиганда или обеспечить точное моделирование является создание карт пропуска (с помощью таких инструментов, как Servalcat). Таким образом, существует ряд инструментов, помогающих исследователям построить и оценить модель, но есть несколько областей в доработке модели, где в ближайшем будущем можно ожидать появления новых подходов или модификаций существующих подходов.

В этой статье мы сосредоточились на современных подходах к моделированию лигандов, которые включают в себя ручную проверку плотности лиганда, генерацию файла геометрии лиганда с последующим моделированием лиганда на карте cryoEM. Это захватывающий период в структурной биологии и разработке лекарств, поскольку детекторы прямых электронов с более высокой частотой кадров и использованием более быстрого сбора данных70 привели к получению карт с высоким разрешением (<2,8 Å) нескольких макромолекул, часто связанных с низкомолекулярными лигандами, за относительно короткое время. Недавнее внедрение автоматизированных инструментов моделирования лигандов, таких как GEMspot69 в наборе Schrodinger и EMERALD17 в наборе Rosetta, которые пытаются найти наиболее вероятное связанное положение лиганда с учетом экспериментальных данных cryoEM, обещает оптимизировать и автоматизировать этот процесс. Как и в случае с рентгеновской кристаллографией, предполагается, что идентификация режимов связывания низкомолекулярных лигандов с помощью криоЭМ, возможно, двух или более за один день, станет реальной возможностью.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SJ является получателем стипендии PhD от DAE-TIFR, и финансирование признается. KRV выражает признательность за грант DBT B-Life DBT/PR12422/MED/31/287/2014 и поддержку Департамента атомной энергии правительства Индии в рамках проекта Identification No. RTI4006.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
CCP4-8.0Консорциум нескольких институтовhttps://www.ccp4.ac.ukбесплатным для академических пользователей и включает Coot и список разработанных инструментов для рентгеновской кристаллографии
CCP-EMКонсорциум нескольких институтовhttps://www.ccpem.ac.uk/download.phpFree для академических пользователей и включает Coot, Relion и многие другие
Coot Пол Эмсли, LMB, Кембриджhttps://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/Общее программное обеспечение для построения моделей, но также доступно с другими описанными выше пакетами
DockinMap (Phenix)Консорциум нескольких институтовhttps://phenix-online.org/documentation/reference/dock_in_map.htmlПрограммное обеспечение внутри пакета Phenix для стыковки моделей в карты криоЭМ
Банк данных электронной микроскопии Консорциум из нескольких институтовhttps://www.ebi.ac.uk/emdb/Публичный репозиторий карт электронной микроскопии
FalconThermo Fisher Scientific https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/MSD/Technical-Notes/Falcon-3EC-Datasheet.pdfРекламный ролик, фотоаппарат от Thermo Fisher 
Феникс Консорциум из нескольких институтовhttps://phenix-online.org/downloadбесплатным для академических пользователей и включает в себя Coot
Protein Data BankКонсорциум нескольких институтовhttps://rcsb.orgПубличную базу данных макромолекулярных структур
PymolSchrodingerhttps://pymol.org/2/Инструмент молекулярной виузализации. Образовательная версия бесплатна, но имеет ограничения. Полную версию можно получить за небольшую плату.
RelionMRC-LMB, Кембриджhttps://relion.readthedocs.io/en/release-4.0/Installation.htmlПрограммное обеспечение для обработки изображений cryoEM, также доступно с CCP-EM
Titan KriosThermo Fisher Scientific https://www.thermofisher.com/in/en/home/electron-microscopy/products/transmission-electron-microscopes/krios-g4-cryo-tem.html?cid=msd_ls_xbu_xmkt_tem-krios_285811_gl_pso_gaw_tpne1c&
gad_source=1& gclid=CjwKCAiA-P-rBhBEEiwAQEXhHyw5c8MKThmdA
AkZesWC4FYQSwIQRk
ZApkj08MfYG040DtiiuL8
RihoCebEQAvD_BwE		Коммерческий, криoTEM от Thermo Fisher
UCSF ChimeraUCSF, СШАhttps://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.htmlПрограммное обеспечение общего назначения для отображения, анализа и многого другого
UCSF Chimera XUCSF, СШАhttps://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/Программное обеспечение общего назначения для отображения, анализа и т. д.
,

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Steinbrecher, T., Labahn, A. Towards accurate free energy calculations in ligand protein-binding studies. Curr Med Chem. 17, 767-785 (2010).
  2. Fu, Y., Zhao, J., Chen, Z. Insights into the molecular mechanisms of protein-ligand interactions by molecular docking and molecular dynamics simulation: a case of oligopeptide binding protein. Comput Math Methods Med. 4, 3502514(2018).
  3. Grinter, S. Z., Zou, X. Challenges, applications, and recent advances of protein-ligand docking in structure-based drug design. Molecules. 19 (7), 10150-10176 (2014).
  4. Henderson, R., Hasnain, S. Cryo-EM': electron cryomicroscopy, cryo electron microscopy or something else. IUCrJ. 10 (5), 519-520 (2023).
  5. Rosenthal, P. B. A potential difference for single-particle cryo-EM. IUCrJ. 6, 988-989 (2019).
  6. Wang, J., Moore, P. B. On the interpretation of electron microscopic maps of biological macromolecules. Prot Sci. 26 (1), 122-129 (2017).
  7. Murshudov, G. N. Refinement of atomic structures against cryo-EM Maps. Meth Enzymol. 579, 277-305 (2016).
  8. Kulik, M., Chodkiewicz, M. L., Dominiak, P. M. Theoretical 3D electron diffraction electrostatic potential maps of proteins modeled with a multipolar pseudoatom data bank. Acta Crystallogr D Struct Biol. 78 (8), 1010-1020 (2022).
  9. Yonekura, K., Kato, K., Ogasawara, M., Tomita, M., Toyoshima, C. Electron crystallography of ultrathin 3D protein crystals: Atomic model with charges. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (11), 3368-3373 (2015).
  10. Mu, X., Gillman, C., Nguyen, C., Gonen, T. An overview of microcrystal electron diffraction (MicroED). Annu Rev Biochem. 90, 431-450 (2021).
  11. Kühlbrandt, W. The resolution revolution. Science. 343 (6178), 1443-1444 (2014).
  12. EMDB (the Electron Microscopy Data Bank. , Available from: www.ebi.ac.uk/emdb/ (2023).
  13. Lawson, C. L., et al. EMDataBank unified data resource for 3DEM. Nucleic Acids Res. 44, 396-403 (2016).
  14. RCSB.org. , Available from: http://www.rcsb.org/stats/growth/growth-em (2024).
  15. Lees, J. A., Dias, J. M., Han, S. Applications of Cryo-EM in small molecule and biologics drug design. Biochem Soc Trans. 49 (6), 2627-2638 (2021).
  16. Robertson, M. J., Meyerowitz, J. G., Skiniotis, G. Drug discovery in the era of cryo-electron microscopy. Trends Biochem Sci. 47 (2), 124-135 (2022).
  17. Muenks, A., Zepeda, S., Zhou, G., Veesler, D., DiMaio, F. Automatic and accurate ligand structure determination guided by cryo-electron microscopy maps. Nat Commun. 14, 1164(2023).
  18. Oldfield, T. J. X-ligand: An application for the automated addition of flexible ligands into electron density. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 57 (5), 696-705 (2001).
  19. Zwart, P. H., Langer, G. G., Lamzin, V. S. Modelling bound ligands in protein crystal structures. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 60, 2230-2239 (2004).
  20. Terwilliger, T. C., Klei, H., Adams, P. D., Moriarty, N. W., Cohn, J. D. Automated ligand fitting by core-fragment fitting and extension into density. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62 (8), 915-922 (2006).
  21. Casañal, A., Lohkamp, B., Emsley, P. Current developments in Coot for macromolecular model building of Electron Cryo-microscopy and Crystallographic Data. Prot Sci. 29 (4), 1069-1078 (2020).
  22. Yamashita, K., Palmer, C. M., Burnley, T., Murshudov, G. N. Cryo-EM single-particle structure refinement and map calculation using Servalcat. Acta Crystallogr D Struct Biol. 77 (10), 1282-1291 (2021).
  23. Wood, C. Collaborative computational project for electron cryo-microscopy. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 71 (1), 123-126 (2015).
  24. Burnley, T., Palmer, C. M., Winn, M. Recent developments in the CCP-EM software suite. Acta Crystallogr D Struct Biol. 73 (6), 469-477 (2017).
  25. Potterton, E., McNicholas, S., Krissinel, E., Cowtan, K., Noble, M. The CCP4 molecular-graphics project. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 58 (11), 1955-1957 (2002).
  26. Agirre, J. The CCP4 suite: Integrative software for macromolecular crystallography. Acta Crystallogr D Struct Biol. 79 (6), 449-461 (2023).
  27. Moriarty, N. W., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D. Electronic ligand builder and optimization workbench (eLBOW): A tool for ligand coordinate and restraint generation. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 65 (10), 1074-1080 (2009).
  28. Adams, P. D. A comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (2), 213-221 (2010).
  29. Emsley, P., Cowtan, K. Coot: Model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 60 (12), 2126-2132 (2004).
  30. Debreczeni, J. É, Emsley, P. Handling ligands with Coot. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 68 (4), 425-430 (2012).
  31. Long, F., et al. AceDRG: A stereochemical description generator for ligands. Acta Crystallogr D Struct Biol. 73 (2), 112-122 (2017).
  32. Schrödinger. LigPrep. Schrödinger Release 2022-1: Schrödinger, LLC. , Schrödinger, LLC. New York, NY. (2022).
  33. Brown, A. Tools for macromolecular model building and refinement into electron cryo-microscopy reconstructions. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 71 (1), 136-153 (2015).
  34. Murshudov, G. N., Vagin, A. A., Dodson, E. J. Refinement of macromolecular structures by the maximum-likelihood method. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 53, 240-255 (1997).
  35. Kovalevskiy, O., Nicholls, R. A., Long, F., Carlon, A., Murshudov, G. N. Overview of refinement procedures within REFMAC 5: Utilizing data from different sources. Acta Crystallogr D Struct Biol. 74 (3), 215-227 (2018).
  36. Winn, M. D., et al. Overview of the CCP4 suite and current developments. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 67 (4), 235-242 (2011).
  37. Pettersen, E. F., et al. UCSF Chimera - A visualization system for exploratory research and analysis. J Comput Chem. 25 (13), 1605-1612 (2004).
  38. Pettersen, E. F., et al. UCSF ChimeraX: Structure visualization for researchers, educators, and developers. Prot Sci. 30 (1), 70-82 (2021).
  39. Lamb, A. L., Kappock, T. J., Silvaggi, N. R. You are lost without a map: Navigating the sea of protein structures. Biochim Biophys Acta Proteins Proteom. 1854 (4), 256-268 (2015).
  40. Ehinger, S., Schubert, W. D., Bergmann, S., Hammerschmidt, S., Heinz, D. W. Plasmin(ogen)-binding α-Enolase from streptococcus pneumoniae: Crystal structure and evaluation of plasmin(ogen)-binding sites. J Mol Biol. 343 (4), 997-1005 (2004).
  41. Tjia-Fleck, S., Readnour, B. M., Ayinuola, Y. A., Castellino, F. J. High-Resolution single-particle cryo-EM hydrated structure of streptococcus pyogenes enolase offers insights into its function as a plasminogen receptor. Biochemistry. 62 (3), 735-746 (2023).
  42. DeLano, W. L. The PyMOL molecular graphics system. Schrödinger LLC wwwpymolorg. Version 1. , Available from: http://www.pymol.org (2002).
  43. Pfab, J., Si, D. Automated threshold selection for cryo-EM density maps. ACM-BCB 2019. Proceedings of the 10th ACM International Conference on Bioinformatics, Computational Biology and Health Informatics. , 161-166 (2019).
  44. Rahi, A., et al. Enolase of Mycobacterium tuberculosis is a surface exposed plasminogen binding protein. Biochim Biophys Acta Gen Subj. 1861 (1), 3355-3364 (2017).
  45. Henderson, B., Martin, A. Bacterial virulence in the moonlight: Multitasking bacterial moonlighting proteins are virulence determinants in infectious disease. Infect Immun. 79 (9), 3476-3491 (2011).
  46. Scheres, S. H. W. A bayesian view on cryo-EM structure determination. J Mol Biol. 415 (2), 406-418 (2012).
  47. Zivanov, J., et al. New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3. Elife. 7, 42166(2018).
  48. Mohammed, A., et al. Structural snapshots of Mycobacterium tuberculosis enolase reveal dual mode of 2PG binding and its implication in enzyme catalysis. IUCrJ. 10 (6), 738-753 (2023).
  49. RCSB Protein Data Bank (RCSB PDB). , Available from: http://www.rcsb.org (2023).
  50. Berman, H. M., et al. The Protein Data Bank. Nucleic Acids Res. 28 (1), 3-21 (2000).
  51. Nasrallah, C. Agonists and allosteric modulators promote signaling from different metabotropic glutamate receptor 5 conformations. Cell Rep. 36 (9), 109648(2021).
  52. Doak, B. C., Norton, R. S., Scanlon, M. J. The ways and means of fragment-based drug design. Pharmacol Ther. 167, 28-37 (2016).
  53. Baker, M. Fragment-based lead discovery grows up. Nat Rev Drug Discov. 12 (1), 5-7 (2013).
  54. Kirsch, P., Hartman, A. M., Hirsch, A. K. H., Empting, M. Concepts and core principles of fragment-based drug design. Molecules. 24 (3), 4309(2019).
  55. Bartesaghi, A., et al. 2.2 Å resolution cryo-EM structure of β-galactosidase in complex with a cell-permeant inhibitor. Science. 348 (6239), 1147-1151 (2015).
  56. Saur, M. Fragment-based drug discovery using cryo-EM. Drug Discov Today. 25 (3), 485-490 (2020).
  57. Maki-Yonekura, S., Kawakami, K., Takaba, K., Hamaguchi, T., Yonekura, K. Measurement of charges and chemical bonding in a cryo-EM structure. Commun Chem. 6 (1), 98(2023).
  58. Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM. Nature. 587 (7832), 157-161 (2020).
  59. Nakane, T. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).
  60. Pintilie, G. Measurement of atom resolvability in cryo-EM maps with Q-scores. Nat Methods. 17 (3), 328-334 (2020).
  61. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. CryoSPARC: Algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nat Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  62. Koehl, A. Structural insights into the activation of metabotropic glutamate receptors. Nature. 566 (7742), 79-84 (2019).
  63. Scheres, S. H. W. Classification of structural heterogeneity by maximum-likelihood methods. Meth Enzymol. 482, 295-320 (2010).
  64. Carugo, O. Atomic displacement parameters in structural biology. Amino Acids. 50 (7), 775-786 (2018).
  65. Wlodawer, A., Li, M., Dauter, Z. High-resolution Cryo-EM maps and models: A crystallographer's perspective. Structure. 25 (10), 1589-1597 (2017).
  66. Masmaliyeva, R. C., Babai, K. H., Murshudov, G. N. Local and global analysis of macromolecular atomic displacement parameters. Acta Crystallogr D Struct Biol. 76 (10), 926-937 (2020).
  67. Merritt, E. A. To B or not to B: A question of resolution. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 68 (4), 468-477 (2012).
  68. Afonine, P. V., et al. Real-space refinement in PHENIX for cryo-EM and crystallography. Acta Crystallogr D Struct Biol. 74 (60), 531-544 (2018).
  69. Roberts on, M. J., van Zundert, G. C. P., Borrelli, K., Skiniotis, G. GemSpot: A pipeline for robust modeling of ligands into Cryo-EM maps. Structure. 28 (6), 707-716 (2020).
  70. Weis, F., Hagen, W. J. H. Combining high throughput and high quality for cryo-electron microscopy data collection. Acta Crystallogr D Struct Biol. 76 (8), 724-728 (2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

CryoEM MapsLigand ModelingProtein Ligand InteractionsElectron CryomicroscopyMacromolecular ComplexesDifference MapReal Space RefinementActive Site ResiduesPhosphoenolpyruvate BindingMagnesium Coordination

Related Articles