Вычислительное прогнозирование аминокислотных предпочтений потенциально мультиспецифических пептид-связывающих доменов, участвующих в белок-белковых взаимодействиях

Краткое содержание

Мы описываем методологию, основанную на диверсификации последовательностей, для оценки аминокислотных предпочтений мультиспецифических сайтов связывания в белок-белковых взаимодействиях (ИПП). В рамках этой стратегии тысячи потенциальных пептидных лигандов генерируются и экранируются in silico, тем самым преодолевая некоторые ограничения доступных экспериментальных методов.

Аннотация

Многие белок-белковые взаимодействия включают связывание коротких белковых сегментов с пептид-связывающими доменами. Обычно такие взаимодействия требуют распознавания линейных мотивов с переменным сохранением. Комбинация высококонсервативных и более вариабельных областей в одних и тех же лигандах часто способствует мультиспецифичности связывания, что является общим свойством ферментов и клеточных сигнальных белков. Характеристика аминокислотных предпочтений пептид-связывающих доменов важна для разработки медиаторов белок-белковых взаимодействий (ИПП). Вычислительные методы являются эффективной альтернативой часто дорогостоящим и громоздким экспериментальным методам, позволяя разрабатывать потенциальные медиаторы, которые впоследствии могут быть проверены в последующих экспериментах. В данной работе мы описали методологию с использованием приложения Pepspec пакета молекулярного моделирования Rosetta для прогнозирования аминокислотных предпочтений пептид-связывающих доменов. Эта методология полезна, когда структура рецепторного белка и природа пептидного лиганда известны или могут быть выведены. Методология начинается с хорошо охарактеризованного якоря из лиганда, который расширяется за счет случайного добавления аминокислотных остатков. Аффинность связывания полученных таким образом пептидов затем оценивается с помощью докинга пептидов гибкого каркаса с целью выбора пептидов с наилучшими прогнозируемыми показателями связывания. Эти пептиды затем используются для расчета аминокислотных предпочтений и для опционального вычисления матрицы позицион-вес (ШИМ), которая может быть использована в дальнейших исследованиях. Чтобы проиллюстрировать применение этой методологии, мы использовали взаимодействие между субъединицами регуляторного фактора интерферона человека 5 (IRF5), ранее известного как мультиспецифичный, но глобально управляемого коротким консервативным мотивом под названием pLxIS. Оцененные предпочтения аминокислот согласуются с предыдущими знаниями о поверхности связывания IRF5. Позиции, занимаемые фосфорилируемыми сериновыми остатками, демонстрировали высокую частоту аспартата и глутамата, вероятно, потому, что их отрицательно заряженные боковые цепи подобны фосфосерину.

Введение

Взаимодействие между двумя белками часто включает связывание коротких сегментов аминокислот с пептид-связывающими доменами, напоминающими белок-пептидные границы. Рецепторные белки, участвующие в таких белок-белковых взаимодействиях (ИПП), часто обладают способностью распознавать определенный набор перекрывающихся, но расходящихся последовательностей лигандов, свойство, известное как мультиспецифичность ^1,2. Мультиспецифическое распознавание является особенностью многих клеточных белков, но особенно заметно оно проявляется в ферментах и клеточных сигнальных белках³. Белки, взаимодействующие с мультиспецифическими сайтами связывания, часто имеют комбинацию более и менее консервативных областей в своей последовательности ^4,5,6. В этом сценарии более консервативные мотивы последовательности вовлечены в строгие молекулярные взаимодействия. И наоборот, более вариабельные последовательности взаимодействуют с каким-то образом разрешающими поверхностями в месте связывания рецептора. Как правило, эти менее консервативные, но все же функционально значимые сегменты представляют собой петли, лишенные определенных структурных паттернов или имеющие еще более динамичные конформации, такие как типичные для внутренне неупорядоченных^{белков.}

Идентификация потенциальных пептидных лигандов сайтов связывания обычно является первым шагом в разработке медиаторов, способных интерферировать с соответствующими ИПП⁸. Тем не менее, часто маловероятно найти один наиболее часто встречающийся аминокислотный остаток в большинстве позиций последовательности в лигандах мультиспецифических сайтов связывания. Вместо этого эти сайты могут иметь особые предпочтения в отношении определенного класса аминокислот в соответствии с их химическими свойствами, например, кислых и отрицательно заряженных аминокислот, таких как аспартат или глутамат, объемных ароматических аминокислот, таких как фенилаланин, или более гидрофобных остатков, таких как алифатические аминокислоты аланин, валин, лейцин или изолейцин³. Несколько экспериментальных методов могут дать представление о аминокислотных предпочтениях сайтов связывания белков, включая направленную эволюцию⁹, мутагенез мультикодонового сканирования¹⁰ и глубокое мутационное сканирование¹¹. Все эти методы основаны на подходе диверсификации последовательностей, который основан на введении мутаций в исходные лиганды и дальнейшем анализе их влияния на функцию рецепторного белка (см. Bratulic and Badran¹² для всестороннего обзора). Однако эти методы часто требуют изучения больших библиотек последовательностей, что делает их более громоздкими, дорогостоящими и трудоемкими.

Вычислительные методы для вывода аминокислотных предпочтений мультиспецифических сайтов связывания могут обойти ограничения методов мокрой лаборатории. Среди них подход к диверсификации последовательностей in silico оценивает энергетическое воздействие широкого спектра заменителей аминокислот в последовательности лигандов как способ характеристики структурной пластичности PPI¹³. Этот метод начинается со структуры или модели пептидного лиганда, связанного с рецепторным сайтом связывания, и впоследствии вводит мутации в последовательность лиганда. Затем статистические функции и функции оценки энергии используются для оценки влияния этих мутаций на стабильность и аффинность связывания. Набор последовательностей лигандов с наилучшей оценкой, полученных в результате фазы оценки, может быть затем использован для вычисления предпочтений аминокислот. Эта стратегия обладает потенциалом для эффективной обработки очень большого числа последовательностей лигандов. Таким образом, он может обеспечить более полный и последовательный вывод о предпочтениях аминокислот по сравнению с теми, которые были вычислены из более ограниченного числа последовательностей, которые обычно могут быть обработаны в подходах к мокрой лаборатории.

Приложение Pepspec пакета молекулярного моделирования^{Rosetta 14} представляет собой инструмент, который выполняет диверсификацию последовательностей в качестве ключевого шага в режиме пептидного проектирования. Для этого требуется структура или модель рецепторного белка со связанным пептидом вплоть до одного аминокислотного остатка в длину, который используется в качестве якоря для следующих шагов. Затем последовательность связанного пептида удлиняют (при необходимости) и диверсифицируют для получения большого числа предполагаемых пептидных лигандов. Аффинность связывания этих пептидов затем оценивается с помощью докинга пептидов гибкого каркаса, чтобы выбрать те из них с наилучшими прогнозируемыми показателями связывания. Несмотря на то, что основным результатом данного применения являются наилучшие пептидные кандидаты, выбранные в конце фазы проектирования, гораздо больший набор пептидов, принятых во время этой фазы, также может быть использован для вычисления аминокислотных предпочтений целевого сайта связывания. Аминокислотные предпочтения вычисляются как частота каждого аминокислотного остатка на позицию лигандной последовательности, представленной либо в виде матрицы веса положения (ШИМ), либо в виде более визуального логотипа последовательности.

В этой статье мы описываем протокол для оценки аминокислотных предпочтений на поверхности связывания рецепторного белка, участвующего в ИПП. Протокол ориентирован на ИПП, в которых линейный сегмент белок-лиганда, как известно, связывается с рецепторным белком, поэтому сценарий может быть смоделирован как граница белок-пептид. В этом сценарии консервативные мотивы лиганда обычно взаимодействуют с определенными карманами в сайте связывания рецептора, хотя весь сегмент лиганда, участвующий в ИПП, может содержать менее консервативные области. Блок-схема, обобщающая основные этапы протокола, показана на рисунке 1. Протокол начинается с 3D-структуры белок-белкового комплекса и далее восстанавливает лигандный белок до потенциально наиболее взаимодействующего сегмента, оставляя рецепторный белок нетронутым. Наиболее взаимодействующий сегмент определяют с помощью сервера¹⁵ сканирования аланина BUDE, который проводит компьютерный мутагенез сканирования аланина для идентификации остатков горячих точек между двумя взаимодействующими белками. При таком подходе остатки лиганда по отдельности замещаются аланином, а расчетное изменение свободной энергии или стабильности комплекса (ΔΔG) затем используется для вывода о значимости соответствующего остатка для целевого PPI. После того, как выведен наиболее взаимодействующий сегмент, его комплекс с рецепторным белком используется в качестве базовой структуры, представленной в Pepspec для выполнения диверсификации последовательностей.

Рисунок 1: Обзор основных этапов протокола, предложенных в данной работе. Номера совпадают с номерами шагов в разделе протокола. Рисунки были выполнены с использованием белок-белкового комплекса, используемого в качестве примера, описанного в тексте. В этом комплексе белковая цепь, рассматриваемая как рецептор, показана розовым цветом, в то время как цепь, рассматриваемая как лиганд, показана светло-голубым цветом, а ее прогнозируемый наиболее взаимодействующий сегмент выделен красным. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Одним из ограничений предлагаемого протокола является требование к разрешенной структуре белок-пептидного интерфейса. В качестве альтернативы протокол может начинаться с моделирования интерфейса белок-пептид-мишень, хотя конкретные этапы моделирования в настоящем документе не описаны. Более того, хотя протокол может быть реализован на персональном компьютере под управлением любой операционной системы, для выполнения шагов, связанных с приложениями Rosetta, требуется среда Linux. Компьютерный кластер также настоятельно рекомендуется для этапа диверсификации последовательностей из-за большого количества итераций, обычно выполняемых Pepspec.

Применение предложенного протокола проиллюстрировано оценкой аминокислотных предпочтений бидинговой поверхности IRF5, входящего в семейство фактора регуляции интерферона человека (IRF). Мы выбрали этот белок в качестве примера, потому что во время его активации две субъединицы связываются, образуя димер, структура которого хорошо охарактеризована16. В димерах IRF связывание может быть смоделировано как граница белок-пептид, в которой одна субъединица обеспечивает поверхность связывания, а другая взаимодействует через область, содержащую короткий консервативный мотив, называемый pLxIS^17,18. Кроме того, связывание с субъединицами IRF является мультиспецифичным; Таким образом, они могут образовывать гомодимеры, гетеродимеры и комплексы с другими клеточными белками, известными как коактиваторы¹⁸.

Протокол

1. Начальная подготовка белок-пептидной границы раздела

1. Скачивание структуры белок-белкового комплекса
   1. Перейдите на домашнюю страницу Protein Data Bank (PDB) (https://www.rcsb.org/) и введите PDB ID для структуры белок-белкового комплекса в главном окне поиска (рис. 2A). Идентификатор PDB для структуры димера IRF5, используемый в качестве примера в данной работе, — 3DSH¹⁹.
   2. На главной странице нужной структуры нажмите на Download Files (рисунок 2B), а затем на Biological Assembly 1 (PDB - gz) (рисунок 2C).
      Примечание: В базе данных PDB структуры многих белковых комплексов, образованных идентичными мономерами, представлены в виде биологических сборок, в которых в PDB-файле хранится только структура одного мономера (асимметричной единицы). Структура мультимера, в данном случае димера IRF5, должна быть загружена в виде биологической сборки, содержащей два экземпляра асимметричной единицы. Чтобы облегчить следующие шаги этого протокола, два мономера сначала разделяются, и им присваиваются различные идентификаторы цепей.
   3. Откройте загруженную структуру в UCSF Chimera²⁰ и нажмите «Инструменты» > «Редактирование структуры> «Изменить идентификаторы цепочки». В этом примере обе цепочки в биологической сборке называются A. Переименуйте вторую цепь (помеченную #0.2) в B и нажмите OK.
   4. Нажмите «Избранное» > панели модели, а затем выберите модель, содержащую две цепочки. Нажмите кнопку «Сгруппировать/Разгруппировать», чтобы разделить каждую цепочку в отдельную модель. Затем выберите две модели и нажмите кнопку «Копировать/Объединить». Введите новое имя для объединенной модели, установите флажок «Закрыть исходные модели» и нажмите кнопку «ОК».
   5. Нажмите на Select > Chain и подтвердите, что каждая цепочка в димере теперь идентифицируется разными буквами, а именно A и B.
   6. Используйте File > Save PDB , чтобы сохранить отредактированную структуру в другой PDB-файл, который будет использоваться на следующих этапах протокола (здесь использовалось имя IRF5_dimer.pdb ).

Рисунок 2: Страница банка данных белков (PDB) для структуры, используемой в качестве репрезентативного примера в данной работе. (A) Окно поиска для введения кода присоединения PDB целевой структуры. (B) Меню для скачивания структуры в нескольких форматах. (C) Опции для загрузки биологических сборок, когда структура была сохранена как асимметричная единица (подробнее см. шаг 1.1.2). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

2. Идентификация целевого сегмента в белке лиганда
   1. Перейдите к серверу сканирования аланина BUDE (https://pragmaticproteindesign.bio.ed.ac.uk/balas/). Нажмите кнопку « Выбрать файл » в разделе «Загрузка структуры » и выберите PDB-файл, сохраненный на шаге 1.1.6.
   2. На следующей странице убедитесь, что структура была правильно загружена (рисунок 3A), и введите имя задания на сервере (рисунок 3B).
   3. Установите цепи из PDB, которые будут рассматриваться как рецептор (А) и лиганд (В) (рис. 3В). Затем нажмите кнопку « Начать сканирование », чтобы отправить задание.
   4. После завершения задания нажмите кнопку "Показать результаты ", чтобы открыть страницу результатов (рисунок 4).
      ПРИМЕЧАНИЕ: На странице результатов остатки лигандной структуры окрашены в соответствии с их расчетным изменением свободной энергии (ΔΔG), а остатки с более высокими значениями окрашены в красный цвет.
   5. В списке остатков выберите прогнозируемый участок остатков для лучшего взаимодействия с целевой поверхностью связывания. Убедитесь, что эти остатки кластеризуются с более высокими значениями разницы в свободной энергии (ΔΔG). В этом примере был выбран сегмент между остатками Leu424 и Ser436 (выделен красным прямоугольником на правой панели рисунка 4).
3. Подготовка белок-пептидного интерфейса к диверсификации последовательностей
   1. Откройте PDB-файл, сохраненный на шаге 1.1.6 в Chimera, и проверьте, что в структуре целевых субъединиц нет недостающих атомов или связей.
   2. Удалите все мелкие молекулы, ионы и растворители, которые были сокристаллизованы с исходной структурой. Для этого нажмите « Выбрать > остатки », а затем выберите все молекулы, кроме стандартных аминокислот. Затем нажмите на Действия > Атомы/Связи и Удалить.
   3. Обрежьте цепь лиганда до наиболее взаимодействующего сегмента, выбранного на шаге 1.2.5. Для этого нажмите на «Избранное» и «Последовательность », а затем нажмите на цепь, которая считается лигандом (B). На панели «Последовательность » перетащите мышь, чтобы выделить все остатки, кроме тех, которые находятся между позициями 424 и 436. Чтобы удалить эти остатки, нажмите на Действия > Атомы/Связи и Удалить.
   4. Используйте File > Save PDB , чтобы сохранить отредактированную структуру в другой PDB-файл, который используется на следующих этапах протокола (здесь использовалось имя IRF5_interface.pdb ).

Рисунок 3: Выбор рецептора и лиганда на сервере BUDE Alanine Scan. (A) Графическое представление комплекса белок-белок. (B) Текстовое поле для ввода имени задания на сервере. (C) Панель для интерактивного выбора цепей, которые будут рассматриваться как рецепторы и лиганды (подробнее см. шаг 1.2). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4: Страница результатов работы сервера сканирования аланина BUDE. Потенциальный наиболее взаимодействующий сегмент в последовательности лигандов обозначен красным прямоугольником. На левой панели остаток с более высоким прогнозируемым вкладом энергии (Leu433) выделен зеленым цветом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

2. Диверсификация последовательностей

ПРИМЕЧАНИЕ: На следующих шагах rosetta_main ссылается на основной каталог установки Rosetta, который обычно находится по адресу /opt/rosetta_src__bundle/main/, где указывает на установленную версию Rosetta. Кроме того, предполагается, что приложения Rosetta доступны в масштабах всей системы; Если это не так, необходимо предоставить полный путь к исполняемым файлам. При компиляции из исходного кода эти исполняемые файлы находятся в каталоге /rosetta_main/source/bin/ .

1. Первичная оптимизация боковых цепей аминокислот
   1. Скопируйте отредактированную структуру, сохраненную на шаге 1.3.4, в папку Linux, доступную для приложений Rosetta.
   2. Используйте приложение FixBB от Rosetta для выполнения переупаковки всех боковых цепей аминокислот базовой структуры перед диверсификацией последовательности. В этой операции ориентация всех боковых цепей аминокислот оптимизируется для минимизации энергии и повышения стабильности комплекса. Для этого выполните следующую команду:
      
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта команда выводит PDB-файл, названный в честь исходной структуры с дополнительным числовым суффиксом (IRF5_interface_0001.pdb в данном примере).
   3. Чтобы облегчить следующий шаг протокола, переименуйте переупакованный PDB-файл с суффиксом _repack с помощью следующей команды:
      MV IRF5_interface_0001.pdb IRF5_repack.pdb
2. Диверсификация последовательностей
   1. Запустите Pepspec в режиме проектирования, чтобы выполнить фактический шаг диверсификации последовательности с помощью следующей команды:
      
      Ниже приведены общие варианты:
      • -s указывает на входной файл (переупакованный PDB-файл, сгенерированный на шаге 2.1.3).
      • -o указывает префикс для именования выходных файлов.
      • - база данных указывает путь к основной базе данных Rosetta 3.
      • -ex1, -ex2 и extrachi_cutoff являются опциями библиотеки rotamer (подробнее см. документацию Pepspec).
      • -overwrite указывает приложению перезаписать возможные ранее существовавшие выходные данные, сгенерированные предыдущими итерациями.
      Ниже приведены варианты, относящиеся к диверсификации последовательностей как таковой:
      • -pepspec:pep_chain указывает на PDB-цепи, рассматриваемые как лиганды (в этом примере 'b').
      • -pepspec:native_pep_anchor указывает на аминокислотный остаток, используемый в качестве якоря (в данном примере остаток Leu в положении 10 пептида лиганда).
      • -pepspec:n_peptides указывает количество пептидных структур для вывода.
      • -pepspec:no_prepack_prot указывает приложению пропустить переупаковку в входной базовой структуре (поскольку это ранее было выполнено на шаге 2.1).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Основным выходом Pepspec является каталог, содержащий PDB-файлы для пептидов, полученных на этапе проектирования, названные с использованием выходного префикса с суффиксом .pdbs (в примере IRF5.pdbs ). Кроме того, Pepspec выводит все принятые пептидные последовательности, протестированные в рамках этапа диверсификации последовательностей, и соответствующие им оценки калорий Rosetta в текстовом файле, разделенном табуляцией, названном по выходному префиксу, с . spec (IRF5.spec в примере). Поскольку протокол, описанный в этой работе, направлен на оценку предпочтений аминокислот, а не фактического пептидного дизайна, на следующих этапах будет использоваться IRF5.spec вместо PDB-структур в каталоге .pdbs .

3. Оценка аминокислотных предпочтений

1. Вычисление ШИМ
   1. Чтобы сгенерировать ШИМ, используйте сценарий gen_pepspec_pwm.py , входящий в состав пакета Rosetta. Чтобы запустить этот скрипт, используйте следующую команду:
      
      где:
      • IRF5.spec - это выходной файл Pepspec, сгенерированный на шаге 2.2.
      • -1 указывает на то, что в последовательности нет дополнительных N-концевых остатков и, следовательно, позиции в ШИМ основаны на 1.
      • 0.2 указывает скрипту учитывать только 20% наиболее результативных пептидов из выходных данных Pepspec (значение по умолчанию — 0.1, что соответствует 10%)
      • interface_score указывает скрипту ранжировать пептиды на основе оценки интерфейса, которая является одной из различных оценок Rosetta, включенных в выходной файл Pepspec.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Этот скрипт генерирует два выходных файла, один для вычисленной ШИМ (с суффиксом .pwm ), а другой для последовательностей подмножества пептидов, используемых для вычисления ШИМ (с суффиксом .seq ). Названия этих файлов также включают оценку и фракцию пептидов, используемых для ранжирования. В этом примере эти файлы называются соответственно IRF5_interface_score_0.2.pwm и IRF5_interface_score_0.2.seq.
2. Создание логотипа последовательности
   1. Перейдите на сервер WebLogo (https://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi)²¹ и нажмите кнопку «Выбрать файл » рядом с пунктом «Загрузить данные последовательности». Загрузите файл с пептидными последовательностями, сгенерированными на шаге 3.1.1 (в данном примере IRF5_interface_score_0.2.seq ).
   2. Выберите желаемый формат и размер логотипа в соответствии с длиной ввода. В примере используется формат PDF и размер 15 см x 12 см. Нажмите на кнопку «Создать логотип».

Результаты

В этой статье мы описали протокол для прогнозирования аминокислотных предпочтений на поверхности связывания IRF5, члена семейства транскрипционных факторов, известных как регуляторные факторы интерферона человека. Эти белки являются регуляторами врожденных и адаптивных иммунных реакций и участвуют в дифференцировке и активации нескольких иммунных клеток. Субъединицы IRF обладают высокопластичными и мультиспецифическими связующими поверхностями, способны образовывать гомодимеры, гетеродимеры и комплексы с другими клеточными белками^17,18. Считается, что димеризация является первым шагом в активации этих факторов, и у большинства членов семейства она запускается фосфорилированием множественных остатков серина/треонина¹⁸. Во время димеризации каждый мономер взаимодействует с активной поверхностью другого мономера через высококонсервативный мотив под названием pLxIS, расположенный ближе к С-концевой области их последовательности. Аббревиатура pLxIS частично представляет аминокислотные предпочтения поверхности связывания, которая последовательно распознает полярную аминокислоту ('p'), за которой следуют две позиции с высокой частотой лейцина («L») и изолейцина («I»), разделенные позицией, занятой любой аминокислотой («x») и за которой следует фосфорилируемый сериновый остаток (Ser436 в этом примере). Фосфорилирование нескольких остатков серина, в том числе мотива pLxIS, способствует изгибу С-концевого сегмента одного мономера и его взаимодействию с поверхностью связывания другого мономера^19,22.

Описанный здесь протокол начинался с трехмерной структуры димера¹⁹ IRF5, в которой один из мономеров произвольно рассматривался как рецептор в PPI, в то время как другой рассматривался как лиганд, содержащий мотив pLxIS. Чтобы лучше определить сегмент лиганда, взаимодействующий с рецепторным сайтом связывания, мы провели компьютерный сканирующий мутагенез аланина (шаг 1.2). Предсказанный сегмент состоял из 13 аминокислотных остатков с позиций 424 по 436, при этом мотив pLxIS начинался с Arg432. Затем структуру исходного димера редуцировали до пептидно-белкового комплекса, в котором последовательность мономера, рассматриваемого как лиганд, обрезали до предсказанного наиболее взаимодействующего сегмента, в то время как другой мономер оставляли нетронутым (стадия 1.3). Затем эта структура была использована в качестве входных данных для стратегии диверсификации последовательностей (раздел 2), в которой лейциновый остаток мотива pLxIS (Leu433) был назначен в качестве якоря, требуемого Pepspec. В результате этого процесса было получено более 26 000 потенциальных пептидных лигандов. Верхние 20% потенциальных лигандов с наилучшими энергетическими показателями (5280) были использованы для оценки аминокислотных предпочтений поверхности связывания в форме ШИМ (рис. 5A) и логотипа последовательности (рис. 5B) (раздел 3).

Рисунок 5: Аминокислотные предпочтения связывающей поверхности IRF3. (A) ШИМ, указывающая частоту каждого аминокислотного остатка (строк) на позицию в последовательности пептидного лиганда (столбцов). (B) Логотип секвенции, визуально представляющий соответствующие частоты аминокислот. Позиции исходной последовательности IRF5 показаны в скобках под каждым столбцом логотипа последовательности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

В ШИМ каждая строка соответствует определенному аминокислотному остатку, в то время как каждый столбец представляет позицию в последовательности. Каждая ячейка матрицы содержит относительную частоту каждой аминокислоты в этой позиции, взвешенную по общим фоновым частотам. Логотипы последовательностей строятся путем складывания букв аминокислот таким образом, что общая высота стопки в каждой позиции указывает на сохранение общей последовательности в этой позиции. И наоборот, высота отдельных букв в стеке указывает на частоту соответствующей аминокислоты. В данном примере как ШИМ, так и логотип последовательности согласуются с предыдущими знаниями относительно поверхности связывания IRF5, с более высоким предпочтением полярной аминокислоты (глутамата) в положении 432 ('p') и очень высоким предпочтением лейцина и изолейцина в положениях 433 и 435, соответственно. Примечательно, что позиции 427, 429 и 436 были предсказаны как имеющие более высокую консервативность аспартата, несмотря на то, что они были заняты серином в исходной последовательности IRF5. Это открытие свидетельствует о важности фосфорилирования этих позиций для формирования димера IRF5, поскольку отрицательный заряд в боковых цепях аспартата и глутамата напоминает таковой у фосфосерина. На самом деле, в предыдущем исследовании сообщалось, что пептид-приманка под названием IRF5D, в котором эти остатки серина были заменены аспартатом, способен ингибировать активность IRF5²³. И наоборот, было предсказано, что позиция 425 имеет очень высокое предпочтение серину, что позволяет предположить, что остаток серина в этой позиции может участвовать в ИПП в его нефосфорилированной форме. Действительно, ранее сообщалось о том, что фосфорилирование эквивалентного остатка серина отрицательно влияет на димеризацию и связывание с другими коактиваторами^16,24.

Обсуждение

В настоящей статье описан протокол оценки аминокислотных предпочтений потенциально мультиспецифических сайтов связывания на основе диверсификации последовательностей in silico. Разработано несколько вычислительных инструментов для оценки аминокислотных предпочтений границ белок-пептид 14,25,26. Эти инструменты имеют прогностическую природу, но они различаются вычислительными алгоритмами, используемыми для выполнения прогнозов, и поправками, которые они реализуют для повышения точности. В этой работе мы использовали приложение Pepspec из набора молекулярного моделирования Rosetta¹⁴. Несмотря на то, что это приложение в первую очередь ориентировано на пептидный дизайн, в нем реализован алгоритм диверсификации последовательностей, который может быть использован для прогнозирования предпочтений аминокислот. Насколько нам известно, этот инструмент является единственным доступным в настоящее время, который предоставляет встроенный скрипт для вычисления ШИМ непосредственно на основе результатов диверсификации последовательностей. Важно отметить, что протокол ориентирован на ИПП, поэтому предполагается, что исходная структура будет представлять собой комплекс из двух белковых субъединиц. Перед фактическим этапом диверсификации последовательностей белок, рассматриваемый в качестве лиганда, обрезают до сегмента, который, как ожидается, будет взаимодействовать с рецепторным белком, и далее обрабатывают его как пептид. Тем не менее, протокол может быть применен и к белково-пептидным комплексам, в котором этапы 1.1-1.3 могут не потребоваться. На стадии получения (раздел 1) также важно исправить неправильно оформленные остатки и гетероатомы, а также смоделировать сегменты сложной структуры, релевантные для целевого сайта связывания, которые не могут быть должным образом разрешены. Эти поправки зависят от конкретной исследуемой структуры и не требовались для структуры, используемой в качестве примера в настоящем документе.

Наиболее важными шагами этого протокола являются те, которые выполняются с помощью приложений Rosetta, которые включают в себя первоначальную переупаковку боковых цепей с помощью FixBB (шаг 2.1) и фактическую диверсификацию последовательностей с помощью Pepspec (шаг 2.2). Этот начальный этап переупаковки, называемый предварительной упаковкой, прямо указан авторами Pepspec¹⁴. Несмотря на то, что это может быть выполнено с помощью Pepspec, авторы этого приложения настоятельно рекомендуют использовать приложение FixBB, которое было специально разработано для оптимизации ротамеров боковой цепи в фиксированных белковых магистралях. На этапе диверсификации последовательностей важно учитывать, что приложение Pepspec ориентировано на пептидный дизайн. Следовательно, по умолчанию он сообщает о нескольких пептидных кандидатах с наилучшими показателями. Поскольку целью представленного здесь протокола является генерация большого числа предполагаемых пептидных лигандов, а не нескольких кандидатов с наилучшими показателями, мы изменили параметр "-pepspec:n_peptides" с 8 (по умолчанию) на 200 (шаг 2.2.1). Используя эту настройку, Pepspec предсказал более 20 000 пептидов в качестве потенциальных лигандов. Этот набор предполагаемых пептидов обеспечил очень широкое представление о связывающем ландшафте рецептора, который затем был отобран для 20% лучших пептидов для фактической оценки аминокислотных предпочтений. Если меньшее количество пептидов передается в "-pepspec:n_peptides", то Pepspec будет принимать значительно меньше кандидатов. В этом сценарии выборка, предложенная в протоколе, может захватывать множество предполагаемых пептидных лигандов с неоптимальными энергетическими показателями, что потенциально может привести к менее надежным оценкам.

Одним из основных ограничений протокола, представленного в данной работе, является то, что он опирается на предварительные знания о структуре белка, содержащего поверхность связывания. Однако эта структура не обязательно должна быть определена экспериментально, но может быть смоделирована ab initio или путем моделирования гомологии¹⁴. Кроме того, необходимо также знать способ связывания хотя бы одного аминокислотного остатка (якоря) пептидного лиганда. Этот якорь будет расширен на определенное количество остатков с помощью специальных опций расширения якоря из Pepspec для выполнения диверсификации последовательностей. Если известна ориентация всего лиганда в сайте связывания, как в случае репрезентативного примера данного исследования, варианты, относящиеся к удлинению якоря, должны быть оставлены по умолчанию (без удлинения), хотя остаток пептида все равно должен быть указан в качестве якоря для руководства алгоритмом диверсификации последовательностей. Приложение Pepspec не поддерживает de novo докинг возможного остатка якоря, но оно может использовать в качестве входных данных выходные данные других приложений докинга или модель гомологичного комплекса белок-пептид для выполнения якорного докинга¹⁴; Хотя эти сценарии выходят за рамки данной статьи.

Важным недостатком предлагаемого протокола является присущая ему прогностическая природа, на которую напрямую влияет разрешение и точность исходной структуры или модели белок-белкового комплекса. Тем не менее, авторы Pepspec заявили, что точность этого приложения была значительно повышена за счет обработки входных координат магистрали как ансамбля структур, а не использования одной белковой структуры и применения фоновой нормализации при вычислении ШИМ¹⁴. Кроме того, протокол является альтернативой громоздким и дорогостоящим экспериментальным методам оценки аминокислотных предпочтений. Все эти экспериментальные методы основаны на оценке больших библиотек последовательностей, полученных путем введения мутаций в последовательность белковых лигандов с последующей экспериментальной оценкой влияния таких мутаций (см. обзор Bratulic and Badran¹²). Вычислительные протоколы, подобные предложенному в данной работе, позволяют проводить скрининг тысяч предполагаемых пептидных лигандов очень эффективным способом, потенциально обеспечивая более надежный набор для оценки аминокислотных предпочтений 13,14,25. Предложенный нами протокол может быть применен к любому ИПП, который может быть восстановлен до интерфейса белок-пептид. Кроме того, этот протокол может служить в качестве первоначальной стратегии для идентификации медиаторов ИПП, таких как потенциальные активаторы или ингибиторы. Идентифицированные медиаторы могут быть в дальнейшем использованы для изучения этих ИПП в лаборатории, или они могут быть оценены как потенциальные терапевтические агенты.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Сервер сканирования аланина BUDE	Эдинбургский университет	https://pragmaticproteindesign.bio.ed.ac.uk/balas/	doi: 10.1021/acschembio.9b00560
Программное обеспечение для моделирования Rosetta	Commons	https://www.rosettacommons.org/software	doi: 10.1002/prot.22851
UCSF Chimera	Калифорнийский университет Сан-Франциско	https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/	doi: 10.1002/ JCC.20084